Nós delinear métodos para a rápida e eficiente isolamento / cultura da microglia viável a partir do córtex cerebral neonatal e adulto medula espinhal. A dissecção e revestimento de microglia cortical pode ser realizado dentro de 90 minutos, com a colheita da microglia subseqüente ocorrendo ~ 10 dias após a dissecção inicial.
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Artigo de método
Microglia cultura do Sistema Nervoso Central Neonatal e Adulto
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A microglia residentes são as células de macrófagos, como do sistema nervoso central (SNC) e, como tal, têm um papel extremamente importante nos processos fisiológicos e patológicos, tais como a maturação do SNC em desenvolvimento, a esclerose múltipla, e lesão da medula espinal. Microglia podem ser ativados e recrutado para a ação por lesão neuronal ou estimulação, como dano axonal visto em MS ou trauma cerebral isquêmica resultante de acidente vascular cerebral. Estes membros imunocompetentes do SNC também são pensados para ter papel na plasticidade sináptica em condições não patológicas. Empregamos protocolos para microglia cultura de tecidos neonatais e adultos que são destinadas a maximizar o número de células viáveis, minimizando variáveis interferentes, tais como a presença de outros tipos de células do sistema nervoso central e os restos de cultura de células. Nós utilizamos grandes e facilmente discernível componentes do SNC (por exemplo, do córtex, os segmentos da medula espinal), o que torna todo o processo viável e reprodutível. O uso da célula adultas uma alternativa adequada para o uso de neonatal microglia do cérebro, como muitas patologias estudados afectam principalmente a medula espinal pós-natal. Esses sistemas de cultura são também úteis para testar directamente o efeito dos compostos que podem inibir ou estimular a activação da microglia. Uma vez que a activação da microglia, podem moldar os resultados da doença no SNC adulto, existe uma necessidade de sistemas in vitro em que a microglia neonatal e adulto podem ser cultivadas e estudadas.
Introdução
A microglia são as células imunitárias residentes do SNC, que mais se assemelham macrófagos periféricos em estrutura e função 1. Foi recentemente demonstrado que as células microgliais pós-natais derivar de progenitores mielóides primitivos e são gerados antes do oitavo dia da embriogênese erigir a noção anterior que progenitores hematopoiéticos pós-natais são a fonte da microglia no cérebro adulto 2. Eles desempenham um papel-chave em várias doenças neurológicas e pode responder rapidamente a uma infecção ou lesão, liberando citocinas pró-inflamatórias ou anti-inflamatória 3. Assim microglia abranger uma unidade autónoma no SNC, que ....
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Protocolo
1. Dissecção (Dia 0)
- Induzir a anestesia para P0-2 filhotes de rato com hipotermia. Limpe as cabeças dos filhotes com um Kimwipe embebido em álcool 70% para desinfecção do tecido.
- Retire as cabeças com um par de tesouras, usando quatro filhotes por 10 centímetros placa de cultura. Coloque as cabeças em uma placa de Petri contendo tampão de gelada Hank.
- Ancorar as cabeças usando uma pinça curva através das órbitas dos olhos e remova cuidadosamente a pele que cobre o crânio com micropinças retas.
- Retire os ossos do crânio com micropinças em linha reta, tendo o cuidado para não perfurar ou danificar o córtex. A maneira mais efica....
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Resultados
Um exemplo de células microgliais de repouso e activado é mostrado na Figura 1. A microglia foram visualizadas 24 horas após o plaqueamento (Figura 1a) e exibem morfologia ramificada (de repouso). A exposição ao reagente de iniciação, o lipopolissacarídeo bacteriano (LPS), resulta em alterações na morfologia da microglia, como as células ficam activadas (Figura 1b).
Um exemplo de contagem das células de revestimento é mostrada na
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Discussão
A microglia modular CNS funcionamento normal, bem como as respostas inflamatórias a diversas patologias. Funcional remodelação sináptica por microglia tem sido implicado na manutenção da homeostase do cérebro normal 15. Durante a cascata neurogênica participam na depuração de células progenitoras neurais do giro denteado do hipocampo 4, 16. Por conseguinte, é necessário desenvolver um sistema de cultura no qual a estudar microglia neonatal e adulto, que vai cobrir a vasta área do desenvolvimento e .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório Tsirka para os seus conselhos e comentários úteis. Este trabalho foi apoiado por R01NS42168 a SET, 12PRE12060489 a RB, um NSF-3MT IGERT e uma dissertação comunhão Turner a LT, e NSF-3MT IGERT de JCN.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| EDTA, 5mM | Invitrogen | 15567-028 | |
| Lidocaína, 60mM | Sigma | L-5647 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Tripsina / EDTA | Cellgro | 25-052-CI | |
| DMEM, 1X | Cellgro | 10-017 | |
| Piruvato de Sódio | Cellgro | 25-000-Cl | |
| Gentamycin Sulfato | Biowittaker | 17-518Z | |
| 35 x 10mm Placa de cultura de tecidos | Falcon | 353001 | |
| Poly-D-Lysine, 100 μ g/ml | Diluir 1:20 | ||
| HBSS, 1X | Cellgro | 20-023-CV |
Referências
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Ann. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Ginhoux, F., Greter, M., Leboeuf, M., Nandi, S., See, P., Gokhan, S., Mehler, M., Conway, S., Ng, L., Stanley, E., Samokhavalov, I., Merad, M.
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Reimpressões e permissões
