Steady-state Pré-steady-state, e Single-turnover Medição, Kinetic para DNA glicosilase Atividade

Resumo

Cursos de tempo para a actividade de glicosilase de 8-oxoguanina glicosilase de ADN são bifásica exibindo uma explosão de formação do produto e uma fase de estado estacionário linear. Utilizando as técnicas de têmpera de fluxo, o rebentamento e as taxas em estado estacionário pode ser medida, o que corresponde à excisão de 8-oxoguanina e libertação da glicosilase de ADN a partir do produto, respectivamente.

Resumo

Humano 8-oxoguanina ADN glicosilase (OGG1) extirpa o mutagénicas lesão oxidativa do ADN de 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) a partir de ADN. Caracterização cinética da OGG1 é realizada para medir as taxas de excisão 8 oxoG e lançamento do produto. Quando a concentração de OGG1 é menor do que o ADN do substrato, o período de formação de produto são bifásicos, com uma fase exponencial rápida (isto é, explosão) de formação do produto é seguido por uma fase de estado estacionário linear. O assomo inicial de formação do produto corresponde à concentração de enzima adequadamente acoplada no substrato, e a amplitude de explosão depende da concentração de enzima. A constante do sinal de sincronismo de velocidade de primeira ordem corresponde à taxa intrínseca da excisão 8-oxoG e da taxa em estado estacionário mais lento mede a taxa de libertação de produto (produto de ADN constante da taxa de dissociação, _koff). Aqui, descrevemos as abordagens de estado estacionário, pré-steady-estado, e um único volume de negócios de isolar e medir spetapas ecific durante OGG1 ciclismo catalítico. Um oligonucleótido marcado fluorescente lesão contendo OGG1 e purificados são utilizados para facilitar as medições cinéticas exactas. Uma vez que baixas concentrações de enzima são utilizados para fazer medições de estado estacionário, a mistura de reagentes manuais e têmpera da reacção pode ser executada para determinar a taxa de estado estacionário (k _off). Além disso, a extrapolação da taxa em estado estacionário de um ponto na ordenada no tempo zero indica que uma explosão de formação do produto ocorreu durante o primeiro volume (isto é, intercepção de y é positivo). A constante da taxa de fase do sincronismo exponencial de primeira ordem pode ser medida utilizando uma técnica de mistura e de arrefecimento rápido, que examina a quantidade de produto formado em intervalos de tempo curtos (<1 s) antes da fase de estado estacionário correspondendo a uma taxa de 8 -oxoG excisão (isto é, química). O passo de química também pode ser medida utilizando uma abordagem de um único volume de negócios onde ciclismo catalítica éprevenida por ADN com a enzima de substrato saturante (E> S). Estas abordagens podem medir constantes de velocidade elementares que influenciam a eficiência da remoção de uma lesão de DNA.

Introdução

Um ambiente aeróbico acelera instabilidade genômica. Uma lesão grande de DNA resultante promutagenic do stress oxidativo é 7,8-di-hidro-8-oxoguanina (8-oxoG). Isto é devido ao potencial de codificação ambígua de 8-oxoG. Human 8 oxoguanine DNA glicosilase (OGG1) é responsável por iniciar reparo por excisão de base do 8 oxoG. A atividade glicosilase de OGG1 extirpa a base de 8 oxoG resultando em DNA produto com um site apurínico (AP-local). A atividade lyase fraco OGG1 pode incisão no AP local em alguns casos.

Caracterização cinética da glicosilases DNA geralmente acha que eles exibem cursos de tempo bifásicos. Depois de uma fase rápida ini....

Protocolo

1. Preparação de enzima e substrato de ADN

1. Over-express OGG1 como uma proteína de fusão GST-em E. coli, utilize o tag GST para a purificação e, em seguida, remover o tag GST por clivagem com HRV-3C protease (Figura 1) ^6.
2. Adquirir a sintetizado quimicamente 5'-6-carboxifluoresceína (6-FAM) oligonucleotídeo marcado contendo um único resíduo de 8 oxoG e a sua cadeia de oligonucleótido não marcado complementar. Os oligonucleótidos 34-mero contêm a 8 oxoG na posição 17 a partir da extremidade 5 '. Purifica-se estes oligonucleótidos por electroforese em gel de poliacrilamida.
3. Preparar substrato de ....

Resultados

A análise cinética de estado estacionário foi realizada usando 200 nM de substrato de ADN e quatro diferentes concentrações aparentes de OGG1 (15, 30, 45 e 60 nM), como determinado por um ensaio de proteína de Bradford ^2. Os cursos de tempo da formação de produto foram ajustados a uma equação linear para determinar a intercepção de y, que foram de 2,2, 11, 15 e 26 nM, respectivamente, em relação a cada concentração de proteína (Figura 2B). A y-intercepta foram ainda traçada em relação a cada .......

Discussão

As aproximações cinéticas descritas aqui delinear métodos para definir constantes cinéticas elementares. Se um decurso de tempo de formação do produto é bifásico, com a primeira reposição enzimática ocorre rapidamente, em seguida, um passo após a química é limitante da velocidade durante a rotatividade catalíticas subsequentes. No caso de OGG1, o primeiro volume pode ser medido utilizando elevadas concentrações de enzima, quer com a limitação (S E), as concentrações de ADN. No primeiro caso, a reac.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagent/Material
5'-6-FAM oligonucleotídeos marcados contendo um único 8-oxoG	Eurofins MWG Operon		5'-P32 oligonucleotídeos radiomarcados também podem ser usados. Recomenda-se o grau de purificação do gel de poliacrilamida.
Oligonucleotídeos não marcados (fita complementar)	Recomenda-se o grau de purificação do gel Eurofins	MWG Operon
Seringa descartável BD Luer Lock de 1 ml A seringa descartável	BD Medical	309628	Lue Lock de outros fornecedores também pode ser usada.
Seringa descartável BD Luer Lock de 10 ml	BE Medical	309604	Seringa descartável Luer Lock de outros fornecedores também podem ser usadas.
Equipamento
Banho-maria circulante	Qualquer vendedor
RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument	KinTek Corporation		Rapid Quench-Flow Instrument de outros fornecedores também pode ser usado.
Typhoon Phosphorimager 8600	GE Healthcare Life Sciences		Imager de outros fornecedores também pode ser usado.
		KaleidaGraph	Synergy

Polyacrylamida.Software