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Eine schnelle und effiziente Methode zur Beurteilung der Pathogenität von Ustilago-Maydis auf Mais- und Teosintenlinien

Published: January 3, 2014 doi: 10.3791/50712
Automatic Translation
1, 1
1Department of Plant Pathology, University of Georgia

Summary

Die Verwendung einer Nadelinjektionsmethode zur Inokulation von Mais- und Teosintenpflanzen mit dem biotrophen Erreger Ustilago maydis wird beschrieben. Die Nadelinjektionsimpfung erleichtert die kontrollierte Abgabe des Pilzerregers zwischen den Pflanzenblättern, wo der Erreger durch die Bildung von Appresorie in die Pflanze gelangt. Diese Methode ist hocheffizient und ermöglicht reproduzierbare Impfungen mit U. maydis.

Abstract

Mais ist eine wichtige Getreidepflanze weltweit. Die Anfälligkeit für biotrophe Krankheitserreger ist jedoch die haupthindernis für die Steigerung der Produktivität. U. maydis ist ein biotropher Pilzerreger und der Erreger von Maiskot auf Mais. Diese Krankheit ist verantwortlich für erhebliche Ertragsverluste von etwa 1,0 Milliarden US-Dollar jährlich in den USA1 Mehrere Methoden einschließlich Fruchtfolge, Fungizid-Anwendung und Saatgut-Behandlungen werden derzeit verwendet, um Mais-Schmutz2zu kontrollieren. Der Wirtswiderstand ist jedoch die einzige praktische Methode zur Verwaltung des Maisschmutzes. Die Identifizierung von Kulturpflanzen wie Mais, Weizen und Reis, die gegen verschiedene biotrophe Krankheitserreger resistent sind, hat die Ertragsverluste jährlichum 3-5deutlich verringert. Daher würde die Verwendung einer Pathogen-Impfungsmethode, die den Erreger effizient und reproduzierbar zwischen den Pflanzenblättern liefert, die schnelle Identifizierung von Maislinien erleichtern, die gegen U. maydisresistent sind. Als ein erster Schritt zur Indentifizierung von Maislinien, die gegen U. Maydisresistent sind, wurde eine Nadelinjektionsimpfungsmethode und ein Resistenzreaktionsscreening-Verfahren verwendet, um Mais-, Teosinten- und Maisx-Teosinten-Introgressionslinien mit einem U.-Maydis-Stamm zu impfen und resistente Pflanzen auszuwählen.

Mais, Teosinte und Mais x Teosinte-Introgressionslinien, bestehend aus etwa 700 Pflanzen, wurden gepflanzt, mit einem Stamm von U. Maydisgeimpft und auf Widerstand gescreent. Die Impf- und Screening-Methoden identifizierten erfolgreich drei Teosintenlinien, die gegen U. maydisresistent sind. Hier wird ein detailliertes Nadelinjektions-Inokulations- und Resistenzreaktions-Screening-Protokoll für Mais-, Teosinat- und Mais x Teosinte-Introgressionslinien vorgestellt. Diese Studie zeigt, dass Nadelinjektionsimpfung ein unschätzbares Werkzeug in der Landwirtschaft ist, das U. Maydis zwischen den Pflanzenblättern effizient liefern kann und Pflanzenlinien zur Verfügung gestellt hat, die gegen U. Maydis resistent sind, die nun kombiniert und in Zuchtprogrammen zur Verbesserung der Krankheitsresistenz getestet werden können.

Introduction

Pilzkrankheiten von Pflanzen stellen eine der größten Bedrohungen für die Landwirtschaft dar. Die Notwendigkeit, Kulturen mit verbesserter Krankheitsresistenz zu entwickeln, steigt aufgrund des Nahrungsmittelbedarfs einer wachsenden Weltbevölkerung. Pflanzenpathogene infizieren natürlich Pflanzen auf dem Feld und verursachen Krankheiten, die sich negativ auf den Ernteertrag auswirken6. Es hat sich gezeigt, dass die Identifizierung und Verwendung resistenter Pflanzen die Resistenz verbessern und den Ertragsverlust verringern kann. Resistente Sorten wurden in vielen Pflanzenarten wie Mais, Weizen, Reis und Sorghum identifiziert, indem die Pflanzen mit einem Pflanzenpathogen impfen und für resistente Linien7ausgewählt wurden. Daher würde die Entwicklung und Verwendung einer effizienten Impfmethode es ermöglichen, viele Pflanzen zu impfen und auf Resistenzen zu überprüfen. Verschiedene Impfmethoden wurden verwendet, einschließlich Tauchimpfung, Pipettierung der Pathogenzellsuspensionskultur in den Wirbel der Pflanze, und Nadelinjektionsimpfung8-11. Bei jeder Methode muss der Erreger zuverlässig zwischen den Pflanzenblättern eingeschleppt werden, wo der Erreger durch die Bildung von Appresorie in die Pflanze gelangt, um die Entwicklung von Krankheitserregern und eine Pflanzeninfektion zu gewährleisten12,13.

Die Dip-Impfmethode beinhaltet das Eintauchen einer Pflanzensämling in eine Pathogenzellsuspensionskultur, während die Pipettiermethode erfordert, die Krankheitserregern-Zellsuspensionskultur in den Wirbel des Pflanzensämlings zu legen. Es gibt jedoch Probleme mit beiden Methoden. Erstens hängen beide Methoden von der natürlichen Bewegung des Erregers von der Blattoberfläche in das sehr variabel emittische Gewebe ab. Die meisten Krankheitserreger gelangen auf natürliche Weise durch stomataale Öffnungen oder Wunden auf der Pflanzenblattoberfläche in die Pflanze. Es gibt jedoch erhebliche Variabilität in der Fähigkeit der Krankheitserreger, die Pflanzenblattoberfläche durch die Stomata und/oder Wunden auf der Blattoberfläche zu durchdringen. Daher kann die Durchdringung von Krankheitserregern nicht mit einer der beiden Impfmethoden kontrolliert werden, die möglicherweise zu inkonsistenten Daten führen. Zweitens kann das Eintauchen der Sämlinge in eine Pathogenzellsuspensionskultur zeitaufwändig sein und die Anzahl der Pflanzen begrenzen, die gesiebelt werden können. Umgekehrt liefert das hier beschriebene Nadelinjektionsimpfungsprotokoll die Pathogenzellsuspensionskultur zwischen den Pflanzenblättern, die die Bildung von Appressadeia14erleichtert. Der Erreger nutzt dann die neu entwickelte Appressade, um in die Pflanze einzudringen, um das Problem der Pathogenpenetration zu beseitigen. Zusätzlich bietet das Nadelinjektions-Impfprotokoll eine Reihe von Phänotypen für Mais- und Teosintenpflanzen, die mit U. Maydis geimpft wurden und eine gute Infektion nachweisen. Die Phänotypen können als Marker verwendet werden, um die beste Konzentration für die Pathogenzellsuspensionskultur zu bestimmen, was zu konsistenten pflanzenphänotypen innerhalb und zwischen verschiedenen Experimenten führt.

Nach der Pflanzenimpfung mit einer Pathogenzellsuspensionskultur werden Pflanzen in der Regel gesiescreent, um einen resistenten oder anfälligen Phänotyp8-11,15zu erkennen. Während Krankheitsbewertungsskalen ausgiebig verwendet wurden, um Pflanzenphänotypen zu untersuchen und zu klassifizieren, unterscheiden sich die Bewertungsskalen je nach analysiertem Erreger. Daher kann eine Krankheitsbewertungsskala Protokoll Einrichtung für U. Maydis und Mais Wechselwirkungen für ähnliche Pilzerreger verwendet werden16.

Die vorliegende Reihe von Protokollen beschreibt die Nadelinjektionsimpfung mit einer U. Maydis-Zellsuspensionskultur und dem Krankheitsresistenz-Reaktionsscreening von Mais-, Teosinat- und Mais x Teosinte-Introgressionslinien. Die vorliegenden Protokolle beschränken sich nicht auf die Nadelinjektionsimpfung von U. maydis in Maispflanzen, sondern können für relativ alle Pilzpathogene und Pflanzenarten verwendet werden. Daher wird die Einbeziehung der Einzelheiten beider Methoden in ein und demselben Protokoll es den Forschern ermöglichen, die Protokolle für die Impfung und das Screening direkt zu nutzen oder die ursprünglichen Protokolle zu manipulieren, um den Pathogen und die Pflanzenarten besser in das Interesse von Pflanzen zu passen.

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Protocol

1. Wachstum von Pflanzenmaterial

  1. Wählen Sie Anlagenlinien für Dieinokulation und Siebung aus. Für diese Arbeit wurden zwei Maislinien, fünf Teosintenlinien und vierzig Maisx-Teosintenlinien mit uncharakterisierter Resistenz gegen U. Maydis verwendet (Tabelle 1).
  2. Pflanzensamen für experimentelle(U. maydis Injektion) und Kontrolle (Wasserinjektion) Nadelinjektion Impfexperimente. Tun Sie dies für jede Anlagenlinie.
  3. Pflanzen Sie vier Samen (Replikationen) für jede Pflanzenlinie in kleinen Wohnungen, indem Sie die Samen etwa 1/2 Zoll mit dem Finger in den Boden schieben und leicht mit Erde bedecken (Abbildungen 1A und 1B). Den Boden nicht über den Samen verpacken. Das Tieferanpflanzen oder das Verpacken des Bodens über das Saatgut kann Probleme mit der Entstehung des Sämlings verursachen.
  4. Gießen Sie die Samen in den Boden. Stellen Sie sicher, dass der Boden eingeweicht ist und die Samen nach dem Gießen unter dem Boden bleiben.
  5. Legen Sie die Pflanzen nach der Bewässerung in eine Wachstumskammer mit Tages- und Nachtumgebungen von 28/20 °C Temperatur bzw. 14/10 Hr Photoperioden bzw. ca. 500 mol/m2 sec   photosynthetisch aktive Strahlungen an der Spitze des Vordachs. Halten Sie die relative Luftfeuchtigkeit während des Tages und der Nacht bei ca. 70% bzw. 90%.
  6. Halten Sie alle Pflanzen in der gleichen Wachstumskammer, um eine Wachstumsumgebung zu erhalten, die über das Experiment kongruent ist.
  7. Nach 10 Tagen, entfernen Sie die Pflanzen aus der Wachstumskammer und impfen Sie die Pflanzen mit der U. Maydis Zellsuspensionskultur mit einer NadelinjektionImpfmethode. Hinweis: Maispflanzen können 7 Tage nach der Pflanzung geimpft werden8-10. Allerdings sind die Teosintenpflanzen nach 7 Tagen zu klein. Daher impfen Sie sowohl Mais- als auch Teosintenpflanzen 10 Tage nach der Pflanzung für Konsistenz innerhalb des Experiments (siehe Schritt 2.12).

2. Nadelinjektionsimpfung

  1. Arbeiten Sie alle in einer laminaren Durchflusshaube. Entfernen U. Maydis Glycerin Bestände aus Gefriertruhen Lagerung. Verwenden Sie eine sterile Schleife und Streifen Glycerin Bestände von U. Maydis Wild-Typ Stämme 1/2 (Paarung Typ a1b1) und 2/9 (Paarung Typ a2b2, nahe isogen bis 1/2) auf Kartoffel dextrose Agar (PDA) Platten. Pflegen Sie Stämme separat.
  2. PDA-Platten mit U. Maydis zwei Tage lang in einen 30 °C-Inkubator stellen. Bei Verwendung eines anderen biotrophen Erregers verwenden Sie die entsprechenden Stamm-, Medien- und Wachstumsbedingungen. Überwachen Sie das Wachstum des Erregers über den Zeitraum von zwei Tagen, um sicherzustellen, dass der U. Maydis-Stamm gut wächst.
  3. Entfernen Sie die PDA-Platten nach zwei Tagen aus dem Inkubator. Die Platten sollten ein gutes Pathogenwachstum haben und einzelne Kolonien enthalten (Abbildung 2A). Es ist wichtig, einzelne Kolonien zu erhalten. Wenn keine einzelnen Kolonien vorhanden sind, werden die Platten mit einer niedrigeren Konzentration umgestreift.
  4. Erledigen Sie die ganze Arbeit in einer laminaren Strömungshaube. Verwenden Sie einen sterilen Zahnstocher, um eine einzelne Kolonie für jeden Stamm aus den PDA-Platten auszuwählen. Legen Sie den Zahnstocher mit einer einzigen Kolonie in eine 3 ml Kartoffeldextrosebrühe (PDB). Es wird empfohlen, 2-3 Kulturen zu haben.
  5. Die 3 ml PDB-Kulturen zwei Tage lang bei 200 Umdrehungen pro Minute in einen 30 °C-Inkubator/Shaker geben. Überwachen Sie das Wachstum der Kultur während des zweitägigen Zeitraums, um das Wachstum der Kultur zu gewährleisten. Die Kultur sollte sehr wolkig erscheinen.
  6. Entfernen Sie die flüssigen Kulturen aus dem Inkubator/Shaker und messen Sie die Konzentration bei OD600, um sicherzustellen, dass die Zellen auf eine OD von 1,0 (ca. 1 x 107 Zellen/ml)17angebaut wurden.
  7. Bringen Sie die U. Maydis-Zellsuspensionskulturen auf eine Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml, mit Wasser in einem endgültigen 30 ml Kulturvolumen. Diese Konzentration führt konsequent zu einer guten Infektion der Pflanzen mit der Pathogenzellsuspensionskultur. 17

Hinweis: Bei Verwendung verschiedener Pathogenstämme sollten verschiedene Zellsuspensionskonzentrationen getestet werden, um den für die Impfung erforderlichen Zelltiter zu bestimmen18,19. Die gegebene Endkonzentration für die Zellsuspensionskultur kann als Ausgangspunkt für das Tittering verwendet werden. Die entsprechende Konzentration der Pathogenzellsuspensionskultur sollte durch Visualisierung der Pflanzenphänotypen mit guter Infektion überprüft werden (Abbildungen 3A-E).

  1. Mischen Sie gleiche Volumina der beiden U. Maydis-Stämme vor der Impfung. Wenn Sie einen Krankheitserreger verwenden, fahren Sie mit Schritt 2.9 fort. Bereiten Sie frische U. Maydis-Zellsuspensionskulturen für jedes Impfexperiment vor und entsorgen Sie Zellsuspensionskulturen nach zwei Tagen.
  2. Für die experimentelle Nadelinjektionsimpfung eine 3 ml Spritze mit der Us-Zellsuspensionskultur füllen, indem Sie die Zellsuspensionskultur in die Spritze ziehen.
  3. Für die Steuernadelinjektionsimpfung eine 3 ml Spritze mit Wasser17füllen. Verwenden Sie das gleiche Verfahren für die experimentelle Nadelinjektionsimpfung.
  4. Befestigen Sie eine 0,457 mm x 1,3 cm hypodermische Nadel am Ende jeder 3 ml Spritze. Die gewählte Nadelgröße liefert die Zellsuspensionskultur zwischen den Pflanzenblättern mit minimalen Schäden am Pflanzengewebe.
  5. Entfernen Sie die Versuchs- und Kontrollpflanzen 10 Tage nach der Pflanzung in Vorbereitung auf Nadelinjektionsimpfungen(Abbildung 2B) (siehe Schritt 1.7).
  6. Setzen Sie die hypodermische Nadel mit der U. maydis-Zellsuspensionskultur vorsichtig in den Stamm einer Versuchspflanze in einem 90°-Winkel knapp über der Bodenlinie ein. Setzen Sie die Nadel ein, bis sie sich in der Mitte des Stiels befindet. Drücken Sie die Nadel nicht durch den Stiel (Abbildung 2C).
  7. Injizieren Sie die Versuchspflanze mit ca. 100 l der U. Maydis-Zellsuspensionskultur 18,19. Dies variiert je nach Höhe des Sämlings leicht. Die Zellsuspensionskultur wird durch den Stamm drücken und in den Wirbel der Pflanze bewegen. Die Zellsuspensionskultur wird im Wirbel der Pflanze sichtbar sein. In jede einzelne Pflanze spritzen Sie weiterhin 100 l der Zellsuspensionskultur, bis die 3 ml Spritze leer ist.
  8. Entfernen Sie nach der Injektion die Nadel vorsichtig aus dem Pflanzenstamm. Entfernen Sie die Nadel aus der nun leeren 3 ml Spritze und füllen Sie sie mit Wasser. Befestigen Sie die Nadel wieder an der Spritze und drücken Sie das Wasser durch die Nadel, um Pflanzengewebe zu entfernen, das in der Nadelspitze gefangen werden kann.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 2.9-2.15 für jede Versuchspflanze. Folgen Sie dem gleichen Protokoll für die Kontrollanlagen, indem Sie Wasser injizieren.
  10. Legen Sie die geimpften Versuchs- und Kontrollpflanzen wieder in die Wachstumskammer. Gießen Sie die Pflanzen täglich, indem Sie den Boden und nicht das Pflanzengewebe benetzen.
  11. Überprüfen Sie die Pflanzen täglich, um die Entwicklung von Krankheitserregern und Pflanzenresistenzreaktionen zu erkennen.

3. Widerstandsreaktions-Screening

  1. Erfassen und erfassen Sie die Widerstandsreaktionen für jede Pflanze 7, 10, 14 und 21 Tage nach der Inokulation (dpi) mit einer Widerstandsreaktionsskala von 1 bis 5. Der Schweregrad der Erkrankung nimmt mit der Erhöhung der numerischen Werte auf der Bewertungsskala zu (Tabelle 2). A 1C (Blattchlorose), 1A (Blatt-Anthocyan-Produktion) oder 2 (kleine Blattgallen) Widerstandsreaktion zeigt Widerstand. A 3 (Stammgallen), 4 (Basalgalle) oder 5 (Pflanzentod) Widerstandsreaktion zeigt Anfälligkeit (Abbildungen 3A-E und Tabelle 2)18,19.
  2. Bewerten Sie sowohl Versuchs- als auch Kontrollpflanzen und zeichnen Sie Widerstandsreaktionswerte auf.
  3. Vergleichen Sie die Widerstandsreaktionen der Versuchs- und Kontrollanlagen. Wählen Sie Versuchspflanzen mit einer Widerstandsreaktionsbewertung von 1C, 1A oder 2 aus. Diese Pflanzen gelten als resistent gegen U. maydis18,19.
  4. Wiederholen Sie das gesamte Experiment, um die Pflanzlichen Phänotypen zu verifizieren.

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Representative Results

Eine erfolgreiche Nadelinjektionsimpfung kann durch Visualisierung des Phänotyps der mit U. maydis (experimentell) geimpften Pflanzen bestimmt werden. Die meisten Versuchspflanzen waren anfällig für U. Maydis-Infektionen. Die anfälligen Pflanzen zeigten eine sehr schwere Krankheitsentwicklung, die durch Stamm- und Basalgallenbildung mit schwarzen Teliosporen nachgewiesen wurde (Abbildungen 3D und 3E, Tabelle 2). Mehrere Pflanzen waren nach der Impfung aufgrund der Schwere der Krankheit tot. Es wurden drei Mais x Teosinte-Introgressionslinien identifiziert, die gegen U. Maydis resistent waren. Bei Pflanzen, die gegen U. Maydisresistent sind, wurde eine erfolgreiche Impfung durch geringfügige Chlorose, Anthocyanproduktion oder, geringe Blattgallenbildung nachgewiesen. (Abbildungen 3A-C und Tabelle 2).

Um zu überprüfen, ob der für die Versuchspflanzen beobachtete Phänotyp das Ergebnis der Impfung war, wurden die Phänotypen der Versuchs- und Kontrollpflanzen (Wasser geimpft) verglichen. Die Versuchspflanzen zeigten die Pathogenentwicklung auf dem Blatt- und/oder Stammbereich, wie oben beschrieben, für die resistenten und anfälligen Pflanzen. Umgekehrt zeigten die Kontrollanlagen keinen Phänotyp. Die Kontrollpflanzen waren sehr sauber und zeigten keine Krankheitserregerentwicklung auf irgendeinem Teil der Pflanze, was darauf hindeutet, dass die Pathogenentwicklung auf den Versuchspflanzen auf die Nadelinjektionsimpfung mit U. maydiszurückzuführen war.

Um die Reproduzierbarkeit und Effizienz der Nadelinjektionsimpfungsmethode zu überprüfen, wurde das Experiment zweimal durchgeführt, bestehend aus 700 Pflanzen und verglich die Resistenzreaktionswerte (Phänotypen) für die Versuchspflanzen innerhalb und zwischen den Experimenten für jede Pflanzenlinie. Die vier Replizienpflanzen aus derselben Pflanzenlinie zeigten in einem Experiment den gleichen Widerstandsreaktionswert für 99,8 % der Pflanzen. Zusätzlich wurden die vier Replizienzwischen-Pflanzen zwischen den Experimenten verglichen und zeigten, dass 99,4% der Pflanzen den gleichen Widerstandsreaktionswert zeigten. Dies deutet darauf hin, dass die Nadelinjektionsimpfungsmethode effizient die U. Maydis-Zellsuspensionskultur zwischen den Pflanzenblättern liefern kann und dass die Impfungen und Phänotypen innerhalb und zwischen den Experimenten konsistent waren.

Figure 1
Abbildung 1. Maissamen, die zur Impfung gepflanzt werden. A) Sechs Maissamen, die zum Anpflanzen auf den Boden gelegt werden. B) Schieben Sie Samen 1/2 Zoll in den Boden mit dem Finger.

Figure 2
Abbildung 2. Flussdiagramm des Nadelinjektionsinokulationsprozesses. A) Wachstum von U. Maydis auf PDA-Platten nach zweitägiger Inkubation bei 30 °C. B) Wohnung von uninokulierten 10 Tage alten Sämlingen aus der Wachstumskammer entfernt. C) Nadelinjektionsimpfung im Stamm eines zehn Tage alten Sämlings mit 100 l der U. Maydis-Zellsuspensionskultur.

Figure 3
Abbildung 3. Pflanzliche phänotypische Reaktionen auf U. Maydis Nadelinjektion Sokulation. A) Resistente Teosintenpflanzen mit kleiner Blattchlorose, die von weißen Streifen auf den Blättern ausgestellt werden. Der Phänotyp entspricht einem 1C-Widerstandsreaktions-Rating-Score. B) Resistente Teosintenpflanzen mit Anthocyan-Produktion, die durch die violette Blattfarbe ausgestellt wird. Der Phänotyp entspricht einem 1A-Widerstandsreaktions-Rating-Score. C) Resistente Teosintenpflanzen mit geringer Blattgallenentwicklung. Der Phänotyp entspricht einem 2-Widerstandsreaktions-Rating-Score. D) Anfällige Maispflanzen mit schwerer Stammgallenentwicklung und schwarzen Teliosporen. Der Phänotyp entspricht einem 3-Widerstandsreaktions-Rating-Score. E) Anfällige Maispflanzen mit schwerer Basalgallenentwicklung. Der Phänotyp entspricht einem 4-Widerstandsreaktions-Rating-Score. Phänotypen entsprechen der Resistenzreaktionsskala und den Krankheitssymptomen in Tabelle 2. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.

Anlagenlinien Pflanzenarten Widerstandsreaktion
1. Zea Mays (NSL 30060) Mais Resistent
2. Zea mays subsp. mays (PI511562) Teosinte Anfällig
3. Zea mays subsp. Parviglumis Teosinte Anfällig
4. Zea mays subsp. Diploperennis Teosinte Resistent
5. Zea mays subsp. Luxurians Teosinte Resistent
6. B73 (P1) Mais Anfällig
7. Parviglumis (P2) Teosinte Anfällig
8. Z031E0560 Mais x Teosinte NIL Resistent
9. Z031E0560 Mais x Teosinte NIL Resistent
10. Z031E0068 Mais x Teosinte NIL Resistent
11. 37 Mais x Teosinte NILs Mais x Teosinte NILs Anfällig

Tabelle 1. Widerstandsreaktionen von Mais- und Teosintenlinien, die mit U. maydisgeimpft wurden. P1 gibt das übergeordnete Element der NILs an. P2 gibt das übergeordnete Element der NILs an. NIL zeigt near-isogenic-lines an.

Host-Antwort Krankheitsbewertung* Krankheitssymptome*
Resistent 1C Wenige chlorotische Bereiche, keine Gallenbildung.
Resistent 1A Dunkelviolette Anthocyan-Produktion, nur wenige Gallen gebildet.
Resistent 2 Kleine Blatt Gallen.
Anfällig 3 Schwere Stammgallen mit der Bildung von schwarzen Teliosporen.
Anfällig 4 Große Basalgallen mit der Bildung von schwarzen Teliosporen
Anfällig 5 Tod von Pflanzen mit schweren Blatt-, Stamm- und Basalgallen.

Tabelle 2. Widerstandsreaktionsbewertungssystem für U. Maydis Scoring. *Rating- und Krankheitssymptome entsprechen den Phänotypen in Abbildung 3.

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Discussion

In dieser Studie war die Nadelinjektionsimpfungsmethode, mit der ein Stamm von U. Maydis in den Stamm von 700 Mais- und Teosintenpflanzen geliefert wurde, erfolgreich. Zusätzlich wurde eine überarbeitete Seuchenresistenz-Bewertungsskala verwendet, um die Pflanzen zu untersuchen und die Entwicklung von Krankheitserregern zu erkennen. Als Ergebnis der Verwendung beider Methoden wurden Pflanzenlinien, die gegen U. Maydis resistent sind, unter 700 Mais- und Teosintenpflanzen identifiziert, die nun kombiniert und in Zuchtprogrammen auf verbesserte Krankheitsresistenz getestet werden können.

Wie bei den meisten Impfmethoden ist die Fähigkeit, den gleichen Resistenz-Phänotyp unter Pflanzen aus der gleichen Linie zu reproduzieren, unerlässlich. Zusätzlich müssen die gleichen Resistenz-Phänotypen in mindestens zwei separaten Experimenten beobachtet werden20,21. Da die Fähigkeit, einen pflanzlichen Phänotyp zu erhalten, ob resistent oder anfällig, in erster Linie durch die Fähigkeit des Erregers bestimmt wird, Zugang in das Pflanzengewebe zu erhalten, ist es sehr wichtig, eine Impfmethode auszuwählen, die den Erreger zwischen den Pflanzenblättern pro Impfung liefert. Einige der häufigsten Probleme Forscher haben mit Nadelinjektion Impfmethoden mit biotrophen Pilzpathogenen wie U. Maydis konfrontiert sind: 1) Unangemessene Konzentration von Pilzerreger für die Impfung verwendet, 2) Mangel an reproduzierbaren Phänotypen in mehreren Experimenten, und 3) Mangel an einer etablierten Widerstandsreaktion Scoring-Methode. Hier wird jedes der Themen getrennt behandelt.

Es ist wichtig, die geeignete Konzentration der Pilzpathogen-Zellsuspensionskultur zu bestimmen, die für die Impfung8-11,22verwendet wird. Die Impfung mit hohen Konzentrationen der Pathogenzellsuspensionskultur führt zum Tod sowohl resistenter als auch anfälliger Pflanzen, während niedrige Konzentrationen keinen Phänotyp auf beiden Pflanzentypen zeigen. Die geeignete Konzentration der Pilzpathogen-Zellsuspensionskultur, die für die Impfung verwendet wird, variiert jedoch von mehreren Faktoren, einschließlich Despathogen, Krankheitserregerstamm, Pflanzenarten und Pflanzenbeitritt. Die vorliegenden Protokolle enthalten Phänotypen und eine Konzentration für die Us-Maydis-Zellsuspensionskultur, die als Ausgangspunkt für die Prüfung des Titers auf Nadelinjektionsimpfung verwendet werden soll. Dies führt zu konsistenten pflanzlichen Phänotypen innerhalb und zwischen verschiedenen Experimenten. Die Zellsuspensionskulturkonzentration, die für U. Maydis-Impfungen verwendet wird, kann auch als Anfangskonzentration für Impfungen mit anderen biotrophen Pilzpathogenen verwendet werden. Es ist ratsam, verschiedene Verdünnungen der Pathogenzellsuspensionskultur zu testen, wenn andere biotrophe Pilzerreger verwendet werden. Dies wird die Auswahl der besten Konzentration für die Pathogenzellsuspensionskultur erleichtern, die zur Impfung verwendet wird.

Eine große Anzahl von Pflanzen muss in der Regel geimpft und aus einer Pflanzenpopulation gescreent werden, um potenziell Pflanzen zu identifizieren, die gegen den Pathogen von Interesse resistent sind6,23. Daher ist es wichtig, eine Impfmethode zu verwenden, die zuverlässig die Pathogenzellsuspensionskultur zwischen den Pflanzenblättern liefert und dass dies mit relativer Leichtigkeit und geringer Manipulation der Pflanzen geschieht. Dies wird reproduzierbare Phänotypen in mehreren Experimenten erleichtern. Die vorliegenden Protokolle geben einen detaillierten Überblick über eine Nadelinjektionsimpfung im Stamm von Mais- und Teosintenpflanzen mit einer Us-Maydis-Zellsuspensionskultur. Diese Methode kann auch für die Impfung anderer Pflanzenarten verwendet werden, die Mais und Teosinte ähneln. Um Krankheiten in der Pflanze zu verursachen, muss U. Maydis in das Pflanzengewebe7,21,24bewegen. Während einer natürlichen Infektion bewegt sich U. Maydis durch stomataale Öffnungen oder Wunden auf der Pflanzenblattoberfläche in das Pflanzengewebe. Eine Dip-Impfung und Pflanzenwirbel Pipettiermethode wurde auch verwendet, um die U. Maydis natürlichen Infektionsprozess zu imitieren, aber hatte begrenzten Erfolg aufgrund der Variabilität in der Krankheitserreger Fähigkeit, das Pflanzengewebe zu durchdringen8-10,25. Jedoch, die Nadelinjektion Impfmethode liefert die U. Maydis Zell Suspension Kultur zwischen den Pflanzenblättern Beseitigung der PathogenPenetration Problem.

Einrichtung einer Resistenzreaktions-Bewertungsskala für U. maydis in wesentlichen zur Identifizierung von Pflanzen, die gegen den Erreger resistentsind 25. Die vorliegenden Protokolle enthalten eine detaillierte Beschreibung der 1 (resistenten) bis 5 (anfälligen) Seuchen-Bewertungsskala, die für die US-Maydis-Infektion von Mais- und Teosintenpflanzen festgelegt wurde. Es ist ohnmächtig, zuerst eine Testimpfung durchzuführen und eine kleine Anzahl von Pflanzen zu überprüfen, bevor ein groß angelegtes Experiment mit Hunderten von Pflanzen ins Leben zu schließen ist. Die im vorliegenden Protokoll festgelegte Resistenzreaktions-Ratingskala besteht in zwei verschiedenen Experimenten als Konnotypus für 700 Pflanzen. Es wird empfohlen, die Impf- und Screeningprotokolle mindestens zweimal zu wiederholen, um Konsistenz und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse nachzuweisen.

Die derzeitige Nadelinjektionsimpfungsmethode und die etablierte resistente Reaktionsbewertungsskala werden weiterhin verwendet, um Mais- und/oder Teosintenpflanzen zu untersuchen und auszuwählen, die gegen Eine U. Maydis-Infektion resistent sind. Als Ergebnis haben die beiden Methoden viele wichtige Implikationen in der Landwirtschaft, die in Zuchtprogrammen für verbesserte Resistenz gegen U. Maydis Infektion abnehmende Ertragsverluste in den USA und international verwendet werden können.

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Disclosures

Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken Dr. Emir Islamovic für die Labor- und Gewächshaushilfe. Wir danken auch Dr. Sherry Flint-Garcia für die Bereitstellung der Mais x Teosinte Introgressionslinien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Seed for plants Collected from original crosses
Growth chamber Conviron PGR14 REACH-IN
Planting flats Hummert International 14-3385-2
Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite) Hummert International 10-1059-2
Laminar flow hood Lab Conoco 70875372
Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest Stocks were grown from original culture
Sterile loop Fisher Scientific S17356A
Potato dextrose agar (PDA) plates Fisher Scientific R454311
Incubator set to 30 °C Fisher Scientific 11-690-650F
Sterile toothpicks Walmart Purchased from Walmart and sterilized by autoclave
Potato dextrose broth (PDB) Fisher Scientific ICN1008617
Incubator-shaker set to 30 °C New Brunswick 14-278-179
Spectrophotometer Fisher Scientific 4001000
U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml) Grown from glycerol stock as described in the methods
3 ml Syringes Becton Dickinson 309606
.457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles Kendall Brands 8881250321

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Umweltwissenschaften Ausgabe 83 Bakterielle Infektionen Anzeichen und Symptome Eukaryota Pflanzenphysiologische Phänomene Ustilago Maydis Nadelinjektionsimpfung Krankheitsbewertungsskala Pflanzen-Pathogen-Wechselwirkungen
Eine schnelle und effiziente Methode zur Beurteilung der Pathogenität von <em>Ustilago-Maydis</em> auf Mais- und Teosintenlinien
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Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and … More

Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines. J. Vis. Exp. (83), e50712, doi:10.3791/50712 (2014).

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