मक्का और टेओसिंते लाइनों पर Ustilago maydis की रोगजनकता का आकलन करने के लिए एक त्वरित और कुशल विधि

Summary

बायोट्रोफिक रोगजनक उचिटागो मेडिस के साथ मक्का और टेओसिंते पौधों को टीका लगाने के लिए सुई इंजेक्शन विधि का उपयोग वर्णित है। सुई इंजेक्शन टीका विधि पौधे के पत्तों के बीच में कवक रोगजनक के नियंत्रित वितरण की सुविधा देती है जहां रोगजनक एप्रेसोरिया के गठन के माध्यम से पौधे में प्रवेश करता है। यह विधि अत्यधिक कुशल है, जो यू मेडिसके साथ प्रजनन योग्य टीका को सक्षम करती है।

Abstract

मक्का दुनिया भर में एक प्रमुख अनाज की फसल है। हालांकि, जैव रोगजनकों के लिए संवेदनशीलता उत्पादकता बढ़ाने के लिए प्राथमिक बाधा है। यू मेडिस एक बायोट्रोफिक फंगल रोगजनक और मक्का पर मकई मैल का कारण एजेंट है। यह रोग अमेरिका में सालाना लगभग $ 1.0 बिलियन के महत्वपूर्ण उपज नुकसान के लिए जिम्मेदार है¹ फसल रोटेशन, कवकनाशी आवेदन और बीज उपचार सहित कई तरीकों का उपयोग वर्तमान में मकई मैल 2 को नियंत्रित करने के लिए किया^जाताहै। हालांकि, मेजबान प्रतिरोध मकई मैल के प्रबंधन के लिए एकमात्र व्यावहारिक तरीका है। मक्का, गेहूं और चावल सहित फसल पौधों की पहचान जो विभिन्न बायोट्रोफिक रोगजनकों के लिए प्रतिरोधी हैं, से सालाना^3-5उपज के नुकसान में काफी कमी आई है । इसलिए, एक रोगजनक टीका विधि का उपयोग जो पौधे की पत्तियों के बीच में रोगजनक को कुशलतापूर्वक और पुन: उत्पन्न करता है, मक्का लाइनों की तेजी से पहचान करने में सुविधाजनक होगा जो यू मेडिसके लिए प्रतिरोधी हैं। के रूप में, मक्का लाइनों कि यू maydisके लिए प्रतिरोधी हैं, एक सुई इंजेक्शन टीका विधि और एक प्रतिरोध प्रतिक्रिया स्क्रीनिंग विधि एक यू maydis तनाव के साथ मक्का, teosinte introgression लाइनों टीका और प्रतिरोधी पौधों का चयन करने के लिए उपयोग किया गया था, इंडेंटिंग की ओर एक पहला कदम ।

मक्का, टेओसिंते और मक्का एक्स टेओसिंटे इन्ट्रोग्रेसियन लाइनें, जिनमें लगभग 700 पौधे शामिल थे, लगाए गए थे, यू मेडिसके तनाव के साथ टीका लगाए गए थे, और प्रतिरोध के लिए जांच की गई थी। टीका और स्क्रीनिंग विधियों ने यू मेडिसके प्रतिरोधी तीन टेओसिंते लाइनों की सफलतापूर्वक पहचान की । यहां मक्का, टेओसिंते और मक्का एक्स टेओसिंटे इनट्रो्रेसेशन लाइनों के लिए एक विस्तृत सुई इंजेक्शन टीका और प्रतिरोध प्रतिक्रिया स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। इस अध्ययन को दर्शाता है कि सुई इंजेक्शन टीका कृषि में एक अमूल्य उपकरण है कि कुशलता से संयंत्र की पत्तियों के बीच में यू maydis उद्धार कर सकते है और संयंत्र लाइनों है कि यू maydis के लिए प्रतिरोधी है कि अब संयुक्त और बेहतर रोग प्रतिरोध के लिए प्रजनन कार्यक्रमों में परीक्षण किया जा सकता है प्रदान की है ।

Introduction

पौधों की फंगल बीमारियां कृषि के लिए सबसे प्रख्यात खतरों में से एक का प्रतिनिधित्व करती हैं। दुनिया की बढ़ती आबादी की खाद्य जरूरतों के कारण बेहतर रोग प्रतिरोध के साथ फसलों को विकसित करने की जरूरत बढ़ रही है । पौधे रोगजनक प्राकृतिक रूप से खेत में फसल के पौधों को संक्रमित करते हैं जिससे फसल की पैदावार पर नकारात्मक प्रभाव पड़ता है⁶. यह दिखाया गया है कि प्रतिरोधी पौधों की पहचान और उपयोग प्रतिरोध में सुधार और उपज हानि को कम कर सकते हैं । पौधों को पौधों के रोगजनक के साथ बाहर निकालकर और प्रतिरोधी लाइनों^केलिए चयन करके मक्का, गेहूं, चावल और ज्वार सहित कई पौधों की प्रजातियों में प्रतिरोधी खेती की पहचान की गई है। इसलिए, एक कुशल टीका विधि के विकास और उपयोग से कई पौधों को टीका लगाया जा सकेगा और प्रतिरोध के लिए जांच की जा सकेगी। विभिन्न टीका विधियों का उपयोग किया गया है जिसमें डुबकी टीका, रोगजनक कोशिका निलंबन संस्कृति को पौधे के चक्कर में पिपिंग करना, और सुई इंजेक्शन टीका^8-11शामिल है। प्रत्येक विधि के साथ, रोगजनक को पौधे की पत्तियों के बीच में मज़बूती से पेश किया जाना चाहिए जहां रोगजनक रोगजनक विकास और पौधे के संक्रमण को सुनिश्चित करने के लिए एप्रेसोरिया के गठन के माध्यम से पौधे में प्रवेश करता है^12,13।

डुबकी टीका विधि एक रोगजनक कोशिका निलंबन संस्कृति में एक पौधे के अंकुर को जलमग्न शामिल है, जबकि पाइपिंग विधि पौधे के अंकुर के चक्कर में रोगजनक सेल निलंबन संस्कृति रखने की आवश्यकता है । हालांकि, दोनों तरीकों के साथ मुद्दे हैं । सबसे पहले, दोनों विधियां पौधे के ऊतकों में पत्ती की सतह से रोगजनक के प्राकृतिक आंदोलन पर निर्भर करती हैं जो अत्यधिक चर है। अधिकांश रोगजनक स्वाभाविक रूप से पौधे के पत्ते की सतह पर स्टोमेटल उद्घाटन या घावों के माध्यम से पौधे में प्रवेश करते हैं। हालांकि, रोगजनकों में महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता के माध्यम से संयंत्र पत्ती की सतह में घुसना और/ इसलिए, रोगजनक प्रवेश को या तो टीका विधि के साथ नियंत्रित नहीं किया जा सकता है जिसके परिणामस्वरूप असंगत डेटा होता है। दूसरा, जब पौधों की एक बड़ी संख्या में स्क्रीनिंग, एक रोगजनक कोशिका निलंबन संस्कृति में रोपण जलमग्न समय लेने वाली हो सकती है और पौधों की संख्या है कि जांच की जा सकती है सीमा हो सकती है । इसके विपरीत, यहां वर्णित सुई इंजेक्शन टीका प्रोटोकॉल पौधे के पत्तों के बीच रोगजनक कोशिका निलंबन संस्कृति को बचाता है जो एपप्रेसोरिया¹⁴के गठन को सुविधाजनक बनाता है। रोगजनक तब रोगजनक प्रवेश मुद्दे को नष्ट करने वाले पौधे में प्रवेश करने के लिए नव विकसित एपप्रेसिया का उपयोग करता है। इसके अतिरिक्त, सुई इंजेक्शन टीका प्रोटोकॉल मक्का और टेओसिंते पौधों के लिए फेनोटाइप की एक श्रृंखला प्रदान करता है जिन्हें यू मेडिस के साथ टीका लगाया गया है और अच्छे संक्रमण का प्रदर्शन करता है। फेनोटाइप का उपयोग रोगजनक कोशिका निलंबन संस्कृति के लिए सबसे अच्छी एकाग्रता निर्धारित करने के लिए एक मार्कर के रूप में किया जा सकता है जिसके परिणामस्वरूप विभिन्न प्रयोगों के भीतर और बीच लगातार पौधे फेनोटाइप होते हैं।

रोगजनक कोशिका निलंबन संस्कृति के साथ पौधे के टीका के बाद, पौधों को आमतौर पर प्रतिरोधी या अतिसंवेदनशील फेनोटाइप^8-11,15का पता लगाने के लिए जांच की जाती है। जबकि रोग रेटिंग तराजू बड़े पैमाने पर स्क्रीन और संयंत्र फेनोटाइप वर्गीकृत करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, रेटिंग तराजू रोगजनक के आधार पर अलग विश्लेषण किया जा रहा है । इसलिए, यू मेडिस और मक्का इंटरैक्शन के लिए रोग रेटिंग स्केल प्रोटोकॉल प्रतिष्ठान का उपयोग इसी^तरहके फंगल रोगजनकों के लिए किया जा सकता है ।

प्रोटोकॉल की वर्तमान श्रृंखला में सुई इंजेक्शन टीका को यू मेडिस सेल सस्पेंशन कल्चर और मक्का, टेओसिंते और मक्का एक्स टेओसिंते इनट्रोग्रेगेशन लाइनों की रोग प्रतिरोध प्रतिक्रिया स्क्रीनिंग के साथ विवरण दिया गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल मक्का के पौधों में यू मेडिस के सुई इंजेक्शन टीका तक ही सीमित नहीं हैं, लेकिन अपेक्षाकृत किसी भी कवक रोगजनक और पौधों की प्रजातियों के लिए उपयोग किया जा सकता है। इसलिए, एक ही प्रोटोकॉल में दोनों तरीकों के विवरण सहित शोधकर्ताओं को सीधे टीका और स्क्रीनिंग के लिए प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए या बेहतर रोगजनक और ब्याज की पौधों की प्रजातियों फिट करने के लिए मूल प्रोटोकॉल में हेरफेर करने के लिए सक्षम हो जाएगा ।

Protocol

1. पादप सामग्री का विकास

1. टीका और स्क्रीनिंग के लिए पौधों की लाइनों का चयन करें। दो मक्का लाइनों, पांच teosinte लाइनों, और यू मेडिस के लिए अस्वाभाविक प्रतिरोध के साथ ४० मक्का एक्स teosinte लाइनों इस काम के लिए इस्तेमाल किया गया(तालिका 1)।
2. प्रायोगिक(यू मेडिस इंजेक्शन) और नियंत्रण (पानी इंजेक्शन) सुई इंजेक्शन टीका प्रयोगों के लिए पौधे के बीज। प्रत्येक पौधे की रेखा के लिए ऐसा करें।
3. छोटे फ्लैटों में प्रत्येक पौधे की रेखा के लिए चार बीज (प्रतिकृति) लगाएं, बीजों को उंगली के साथ मिट्टी में धकेलकर और मिट्टी के साथ हल्के से कवर करके(आंकड़े 1A और 1B)। बीज के ऊपर मिट्टी पैक न करें। बीज को गहरा रोपण या बीज पर मिट्टी पैकिंग अंकुर उद्भव के साथ समस्या पैदा कर सकता है।
4. बीजों को मिट्टी में पानी दें। सुनिश्चित करें कि मिट्टी भिगोई हुई है और पानी भरने के बाद बीज मिट्टी के नीचे रहते हैं।
5. पानी के बाद, पौधों को 28/20 डिग्री सेल्सियस तापमान और 14/10 घंटे के फोटोपीरियोड के दिन और रात के वातावरण के साथ एक विकास कक्ष में रखें, क्रमशः और लगभग 500 माइक्रोमोल/एम² सेकंड   फोटोसिंथेटिक रूप से सक्रिय विकिरण चंदवा के शीर्ष पर। दिन और रात के दौरान सापेक्ष आर्द्रता को क्रमशः लगभग 70% और 90% पर बनाए रखें।
6. सभी पौधों को एक ही विकास कक्ष में रखें ताकि एक विकास वातावरण बनाए रखा जा सके जो प्रयोग में अनुकूल है।
7. 10 दिनों के बाद, पौधों को विकास कक्ष से हटा दें और सुई इंजेक्शन टीका विधि का उपयोग करके यू मेडिस सेल सस्पेंशन कल्चर के साथ पौधों को टीका लगाएं। नोट: मक्का के पौधों को^8-10लगाने के 7 दिन बाद टीका लगाया जा सकता है । हालांकि, टेओसिंते पौधे 7 दिनों के बाद बहुत छोटे होते हैं। इसलिए, प्रयोग के भीतर स्थिरता के लिए रोपण के 10 दिन बाद मक्का और टेओसिंते पौधों दोनों को टीका लगाएं (चरण 2.12 देखें)।

2. सुई इंजेक्शन टीका

1. एक लेमिनार प्रवाह हुड में सभी काम करते हैं। फ्रीजर स्टोरेज से यू मेडिस ग्लिसेरोल स्टॉक्स निकालें । आलू डेक्सट्रोस एगर (पीडीए) प्लेटों पर यू मेडिस वाइल्ड-टाइप स्ट्रेन 1/2 (संभोग प्रकार a1b1) और 2/9 (संभोग प्रकार a2b2, आइसोजेनिक के पास 1/2) के बाँझ पाश और लकीर ग्लिसरोल स्टॉक का उपयोग करें। उपभेदों को अलग से बनाए रखें।
2. दो दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में यू मेडिस के साथ पीडीए प्लेटें रखें। यदि एक अलग बायोट्रोफिक रोगजनक का उपयोग उपयुक्त तनाव, मीडिया और विकास की स्थिति का उपयोग करें। दो दिन की अवधि में रोगजनक के विकास की निगरानी सुनिश्चित करने के लिए कि यू maydis तनाव अच्छी तरह से बढ़ रहा है ।
3. दो दिन बाद इनक्यूबेटर से पीडीए प्लेटें निकाल लें। प्लेटों में अच्छा रोगजनक विकास होना चाहिए और एकल उपनिवेशों(चित्रा 2A)होते हैं। एकल उपनिवेशों को प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। यदि एकल उपनिवेश कम एकाग्रता पर प्लेटों को फिर से पेश नहीं करते हैं।
4. एक लेमिनार प्रवाह हुड में सभी काम करें। पीडीए प्लेटों से प्रत्येक तनाव के लिए एक ही कॉलोनी का चयन करने के लिए एक बाँझ टूथपिक का उपयोग करें। एक ही कॉलोनी वाले टूथपिक को 3 मिलीलीटर आलू डेक्सट्रोस शोरबा (पीडीबी) में रखें। इसमें 2-3 संस्कृतियों की सलाह दी जाती है।
5. 3 मिलीलीटर पीडीबी संस्कृतियों को 200 आरपीएम पर दो दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर/शेखर में रखें। संस्कृति के विकास को सुनिश्चित करने के लिए दो दिन की अवधि में संस्कृति के विकास की निगरानी करें। संस्कृति में बहुत बादल दिखाई देने चाहिए।
6. इनक्यूबेटर/शेखर से तरल संस्कृतियों को हटा दें और ओडी_६०० पर एकाग्रता को मापने के लिए सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को १.० (~ 1 x 10⁷ कोशिकाओं/ml)¹⁷के एक आयुध के लिए उगाया गया ।
7. यू मेडिस सेल सस्पेंशन संस्कृतियों को अंतिम 30 मिलीलीटर संस्कृति की मात्रा में पानी का उपयोग करके 1 x 10⁶ कोशिकाओं/मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता में लाएं। इस एकाग्रता के परिणामस्वरूप रोगजनक कोशिका निलंबन संस्कृति के साथ पौधों का अच्छा संक्रमण होता है। ¹⁷

नोट: टीका^18,19के लिए आवश्यक उपयुक्त सेल टाइटर का निर्धारण करने के लिए विभिन्न रोगजनक उपभेदों का उपयोग करते समय विभिन्न सेल निलंबन सांद्रता का परीक्षण किया जाना चाहिए। सेल निलंबन संस्कृति के लिए दी गई अंतिम एकाग्रता टिटरिंग के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। रोगजनक कोशिका निलंबन संस्कृति की उचित एकाग्रता को अच्छे संक्रमण(आंकड़े 3 ए-ई)के साथ पौधे फेनोटाइप की कल्पना करके सत्यापित किया जाना चाहिए।

8. टीका लगाने से पहले दो यू मेडिस उपभेदों के बराबर मात्रा मिलाएं। यदि एक रोगजनक तनाव का उपयोग कर 2.9 कदम के लिए आगे बढ़ना है। प्रत्येक टीका प्रयोग के लिए ताजा यू मेडिस सेल सस्पेंशन संस्कृतियों को तैयार करें और दो दिनों के बाद सेल निलंबन संस्कृतियों को त्यागें।
9. प्रायोगिक सुई इंजेक्शन टीका के लिए, सिरिंज में सेल निलंबन संस्कृति ड्राइंग द्वारा यू मेडिस सेल निलंबन संस्कृति के साथ एक 3 मिलीलीटर सिरिंज भरें।
10. नियंत्रण सुई इंजेक्शन टीका के लिए, पानी के साथ एक 3 मिलीलीटर सिरिंज^{भरें 17}। प्रयोगात्मक सुई इंजेक्शन टीका के लिए एक ही प्रक्रिया का उपयोग करें।
11. प्रत्येक 3 मिलीलीटर सिरिंज के अंत में 0.457 मिमी x 1.3 सेमी हाइपोडर्मिक सुई संलग्न करें। चयनित सुई आकार पौधे के ऊतकों को न्यूनतम क्षति के साथ पौधे की पत्तियों के बीच में सेल निलंबन संस्कृति प्रदान करेगा।
12. सुई इंजेक्शन टीका(चित्रा 2B) (चरण1.7 देखें) के लिए तैयारी में रोपण के 10 दिन बाद विकास कक्ष से प्रायोगिक और नियंत्रण पौधों को हटा दें।
13. ध्यान से मिट्टी की रेखा के ठीक ऊपर एक 90 डिग्री कोण पर एक प्रयोगात्मक संयंत्र के तने में यू मेडिस सेल निलंबन संस्कृति युक्त हाइपोडर्मिक सुई डालें। सुई डालें जब तक कि यह तने के बीच में न हो जाए। सुई को तने(चित्रा 2C)के माध्यम से न धकेलें।
14. प्रायोगिक पौधे को यू मेडिस सेल सस्पेंशन कल्चर^18,19के लगभग 100 माइक्रोन के साथ इंजेक्ट करें । यह अंकुर की ऊंचाई के आधार पर थोड़ा भिन्न होगा। सेल निलंबन संस्कृति तने के माध्यम से धक्का और संयंत्र के चक्कर में ले जाएगा। प्लांट के चक्कर में सेल सस्पेंशन कल्चर दिखाई देगा। 3 मिलीलीटर सिरिंज खाली होने तक प्रत्येक व्यक्तिगत पौधे में सेल निलंबन संस्कृति के 100 माइक्रोन इंजेक्शन जारी रखें।
15. इंजेक्शन के बाद, ध्यान से सुई को पौधे के तने से हटा दें। अब खाली 3 मिली सी सिरिंज से सुई निकालें और पानी से भरें। सुई को सिरिंज में वापस संलग्न करें और सुई टिप में पकड़े जाने वाले किसी भी पौधे के ऊतकों को हटाने के लिए सुई के माध्यम से पानी को धक्का दें।
16. प्रत्येक प्रायोगिक पौधे के लिए 2.9-2.15 चरण दोहराएं। पानी का इंजेक्शन लगाकर कंट्रोल प्लांट्स के लिए एक ही प्रोटोकॉल का पालन करें।
17. टीका प्रयोगात्मक और नियंत्रण पौधों को विकास कक्ष में वापस रखें। पौधों के ऊतकों को गीला करके पौधों को प्रतिदिन पानी दें।
18. रोगजनक विकास और पौधों के प्रतिरोध प्रतिक्रियाओं का पता लगाने के लिए दैनिक पौधों की जांच करें।

3. प्रतिरोध प्रतिक्रिया स्क्रीनिंग

1. स्कोर और प्रत्येक संयंत्र के लिए प्रतिरोध प्रतिक्रियाओं रिकॉर्ड 7, 10, 14, और 21 दिनों के बाद टीका (dpi) एक 1 से 5 प्रतिरोध प्रतिक्रिया रेटिंग पैमाने का उपयोग कर । रेटिंग पैमाने पर संख्यात्मक मूल्यों(तालिका 2)के रूप में रोग की गंभीरता बढ़ जाती है । एक 1C (लीफ क्लोरोसिस), 1A (लीफ एंथोसाइनिन उत्पादन), या 2 (छोटे पत्ते पित्त) प्रतिरोध प्रतिक्रिया प्रतिरोध को इंगित करती है। एक 3 (स्टेम गॉल), 4 (बेसल गॉल), या 5 (पौधे की मृत्यु) प्रतिरोध प्रतिक्रिया संवेदनशीलता(आंकड़े 3ए-ई और तालिका 2)^18,19इंगित करती है।
2. दोनों प्रयोगात्मक और नियंत्रण संयंत्रों स्कोर और रिकॉर्ड प्रतिरोध प्रतिक्रिया रेटिंग।
3. प्रयोगात्मक और नियंत्रण पौधों की प्रतिरोध प्रतिक्रियाओं की तुलना करें। 1C, 1A, या 2 प्रतिरोध प्रतिक्रिया रेटिंग के साथ प्रयोगात्मक पौधों का चयन करें। इन पौधों को यू ^18,19के लिए प्रतिरोधी माना जाता है .
4. पौधे फेनोटाइप को सत्यापित करने के लिए पूरे प्रयोग को दोहराएं।

Representative Results

एक सफल सुई इंजेक्शन टीका यू मेडिस (प्रायोगिक) के साथ टीका लगाने वाले पौधों के फेनोटाइप की कल्पना करके निर्धारित किया जा सकता है। अधिकांश प्रायोगिक पौधे यू मेडिस संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील थे। अतिसंवेदनशील पौधों ने काले तेलियोस्पोर(आंकड़े 3 डी और 3E, टेबल 2)के साथ स्टेम और बेसल पित्त गठन द्वारा प्रदर्शित बहुत गंभीर रोग विकास दिखाया। बीमारी की गंभीरता के कारण टीका लगने के बाद कई पौधे मर गए थे। तीन मक्का एक्स टेओसिंटे इन्ट्रोक््रेसेशन लाइनों की पहचान की गई जो यू मेडिस के प्रतिरोधी थे । यू मेडिसके प्रतिरोधी पौधों के लिए, मामूली क्लोरोसिस, एंथोसाइनिन उत्पादन या मामूली पत्ती पित्त गठन द्वारा एक सफल टीका का प्रदर्शन किया गया था। (आंकड़े3ए-सी और टेबल 2)।

यह सत्यापित करने के लिए कि प्रायोगिक पौधों के लिए मनाया गया फेनोटाइप टीका का परिणाम था, प्रायोगिक और नियंत्रण पौधों (पानी टीका) के फेनोटाइप की तुलना की गई थी। प्रायोगिक पौधों ने प्रतिरोधी और अतिसंवेदनशील पौधों के लिए ऊपर वर्णित पत्ती और/या स्टेम क्षेत्र पर रोगजनक विकास दिखाया । इसके विपरीत, नियंत्रण संयंत्रों ने फेनोटाइप का प्रदर्शन नहीं किया। नियंत्रण पौधे बहुत साफ थे और पौधे के किसी भी हिस्से पर रोगजनक विकास नहीं दिखाते थे, यह दर्शाता है कि प्रायोगिक पौधों पर रोगजनक विकास यू मेडिसके साथ सुई इंजेक्शन टीका के कारण था।

सुई इंजेक्शन टीका विधि की प्रजनन क्षमता और दक्षता को सत्यापित करने के लिए, प्रयोग दो बार 700 पौधों से मिलकर किया गया था और प्रत्येक पौधे लाइन के लिए प्रयोगों के भीतर और बीच प्रयोगों के लिए प्रतिरोध प्रतिक्रिया स्कोर (फेनोटाइप) की तुलना में। एक प्रयोग के भीतर एक ही पौधे लाइन से चार दोहराने पौधों पौधों पौधों के ९९.८% के लिए एक ही प्रतिरोध प्रतिक्रिया स्कोर दिखाया । इसके अतिरिक्त, चार दोहराने पौधों प्रयोगों के बीच तुलना की गई और संकेत दिया कि पौधों के ९९.४% एक ही प्रतिरोध प्रतिक्रिया स्कोर दिखाया । इससे पता चलता है कि सुई इंजेक्शन टीका विधि कुशलता से पौधे की पत्तियों के बीच में यू मेडिस सेल सस्पेंशन संस्कृति प्रदान कर सकती है और टीका और फेनोटाइप प्रयोगों के भीतर और बीच में सुसंगत थे।

चित्रा 1. टीका लगाने के लिए लगाए गए मक्का के बीज। ए) रोपण के लिए मिट्टी के ऊपर रखे गए छह मक्का बीज। ख)बीज ों को उंगली से मिट्टी में 1/2 इंच पुश करें ।

चित्रा 2। सुई इंजेक्शन टीका प्रक्रिया का प्रवाह चार्ट। A} यू माइडिस की ग्रोथ दो दिन इनक्यूबेशन के बाद पीडीए प्लेटों पर 30 डिग्री सेल्सियस पर आई बी) ग्रोथ चैंबर से हटाए गए 10 दिन पुराने रोपण के फ्लैट । C)सुई इंजेक्शन यू मेडिस सेल सस्पेंशन कल्चर के 100 माइक्रोन के साथ दस दिन पुराने अंकुर के तने में टीका।

चित्र 3। यू मेडिस सुई इंजेक्शन टीका के लिए संयंत्र फेनोटाइपिक प्रतिक्रियाएं। A)पत्तियों पर सफेद धारियाँ द्वारा प्रदर्शित मामूली पत्ती क्लोरोसिस वाले प्रतिरोधी टेओसिंते पौधे। फेनोटाइप 1C प्रतिरोध प्रतिक्रिया रेटिंग स्कोर से मेल खाता है। B)बैंगनी पत्ती के रंग द्वारा प्रदर्शित एंथोसाइनिन उत्पादन के साथ प्रतिरोधी टेओसिंते पौधे। फेनोटाइप 1A प्रतिरोध प्रतिक्रिया रेटिंग स्कोर से मेल खाता है। ग)मामूली पत्ती पित्त विकास के साथ प्रतिरोधी टेओसिंते पौधे। फेनोटाइप 2 प्रतिरोध प्रतिक्रिया रेटिंग स्कोर से मेल खाता है। घ)गंभीर तने पित्त विकास और काले टेलिओस्पोर के साथ अतिसंवेदनशील मक्का के पौधे। फेनोटाइप 3 प्रतिरोध प्रतिक्रिया रेटिंग स्कोर से मेल खाता है। ई)गंभीर बेसल पित्त विकास के साथ अतिसंवेदनशील मक्का के पौधे। फेनोटाइप 4 प्रतिरोध प्रतिक्रिया रेटिंग स्कोर से मेल खाता है। फेनोटाइप टेबल 2में प्रतिरोध प्रतिक्रिया रेटिंग पैमाने और रोग के लक्षणों के अनुरूप है। बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्लांट लाइनें	पौधों की प्रजातियां	प्रतिरोध प्रतिक्रिया
1. ज़ीया मेस (एनएसएल 30060)	मक्‍की	प्रतिरोधी
2. ज़ीया mays subsp. mays (PI511562)	टेओसिंते	अतिसंवेदनशील
3. ज़ीया मेस सबएसपी. पारिगलुमिस	टेओसिंते	अतिसंवेदनशील
4. ज़ीया मेस सबएसपी. डिप्लोपेनिस	टेओसिंते	प्रतिरोधी
5. ज़ीया mays subsp. विलासिता	टेओसिंते	प्रतिरोधी
6. B73 (P1)	मक्‍की	अतिसंवेदनशील
7. पार्विग्लुमिस (P2)	टेओसिंते	अतिसंवेदनशील
8. Z031E0560	मक्का एक्स टेओसिंते शून्य	प्रतिरोधी
9. Z031E0560	मक्का एक्स टेओसिंते शून्य	प्रतिरोधी
10. Z031E0068	मक्का एक्स टेओसिंते शून्य	प्रतिरोधी
11. 37 मक्का एक्स टेओसिंते एनआईएलएस	मक्का एक्स टेओसिंते एनआईएलएस	अतिसंवेदनशील

तालिका 1. मक्का और टेओसिंते लाइनों की प्रतिरोध प्रतिक्रियाएं यू मेडिस के साथ टीका लगाया । P1 एनआईएलएस के माता-पिता को इंगित करता है। P2 एनआईएलएस के माता-पिता को इंगित करता है। निल निकट-आइसोजेनिक-लाइनों को इंगित करता है।

होस्ट रिस्पांस	रोग रेटिंग *	रोग के लक्षण *
प्रतिरोधी	1C	कुछ हरित क्षेत्र, कोई पित्त गठन नहीं।
प्रतिरोधी	1ए	डार्क पर्पल एंथोसाइनिन उत्पादन, कुछ गॉल का गठन किया।
प्रतिरोधी	2	मामूली पत्ती पित्त।
अतिसंवेदनशील	3	काले टेलिओस्पोर के गठन के साथ गंभीर स्टेम गॉल।
अतिसंवेदनशील	4	काले टेलिओस्पोर के गठन के साथ बड़े बेसल गॉल
अतिसंवेदनशील	5	गंभीर पत्ती, तना और बेसल पित्त के साथ पौधों की मौत।

तालिका 2. यू मेडिस स्कोरिंग के लिए उपयोग की जाने वाली प्रतिरोध प्रतिक्रिया रेटिंग प्रणाली। * रेटिंग और रोग के लक्षण चित्र 3में फेनोटाइप के अनुरूप हैं ।

Discussion

इस अध्ययन में सुई इंजेक्शन टीका विधि 700 मक्का और टेओसिंते पौधों के तने में यू मेडिस के तनाव को वितरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया सफल रहा। इसके अतिरिक्त, पौधों को स्क्रीन करने और रोगजनक विकास का पता लगाने के लिए एक संशोधित रोग प्रतिरोध रेटिंग पैमाने का उपयोग किया गया था। दोनों तरीकों का उपयोग करने के परिणामस्वरूप, यू मेडिस के लिए प्रतिरोधी पौधों की रेखाओं की पहचान 700 मक्का और टेओसिंते पौधों के बीच की गई थी जिन्हें अब बेहतर रोग प्रतिरोध के लिए प्रजनन कार्यक्रमों में जोड़ा और परीक्षण किया जा सकता है।

अधिकांश टीका विधियों के साथ, एक ही रेखा से पौधों के बीच एक ही प्रतिरोध फेनोटाइप को पुन: पेश करने की क्षमता आवश्यक है। इसके अतिरिक्त, कम से कम दो अलग-अलग प्रयोगों^20,21में एक ही प्रतिरोध फेनोटाइप देखा जाना चाहिए। क्योंकि एक पौधे फेनोटाइप प्राप्त करने की क्षमता, चाहे वह प्रतिरोधी हो या अतिसंवेदनशील, मुख्य रूप से पौधे के ऊतकों में पहुंच प्राप्त करने के लिए रोगजनक की क्षमता से निर्धारित होता है, पौधे के बीच में रोगजनक बचाता है कि एक टीका का चयन करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है प्रत्येक टीका छोड़ देता है । कुछ आम मुद्दों शोधकर्ताओं ने यू मेडिस जैसे बायोट्रोफिक फंगल रोगजनकों का उपयोग करके सुई इंजेक्शन टीका विधियों का सामना किया है: 1) टीका के लिए उपयोग किए जाने वाले कवक रोगजनक की अनुचित एकाग्रता, 2) कई प्रयोगों में प्रजनन योग्य फेनोटाइप की कमी, और 3) एक स्थापित प्रतिरोध प्रतिक्रिया स्कोरिंग विधि की कमी। यहां प्रत्येक मुद्दे का अलग से समाधान किया जाता है ।

टीका^8-11,22के लिए उपयोग की जाने वाली कवक रोगजनक कोशिका निलंबन संस्कृति की उचित एकाग्रता का निर्धारण करना महत्वपूर्ण है। रोगजनक कोशिका निलंबन संस्कृति की उच्च सांद्रता के साथ टीका प्रतिरोधी और अतिसंवेदनशील दोनों पौधों की मौत का कारण बनेगा, जबकि कम सांद्रता या तो पौधे के प्रकार पर फेनोटाइप नहीं दिखाएगी। हालांकि, टीका लगाने के लिए उपयोग की जाने वाली कवक रोगजनक कोशिका निलंबन संस्कृति की उचित एकाग्रता रोगजनक, रोगजनक तनाव, पौधों की प्रजातियों और पौधों के राज्यारोहण सहित कई कारकों के आधार पर भिन्न होगी। वर्तमान प्रोटोकॉल फेनोटाइप और यू मेडिस सेल सस्पेंशन संस्कृति के लिए एक एकाग्रता प्रदान करते हैं जिसे सुई इंजेक्शन टीका के लिए टाइटर का परीक्षण करने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में उपयोग किया जाता है। इसके परिणामस्वरूप विभिन्न प्रयोगों के भीतर और बीच में लगातार पौधे फेनोटाइप होते हैं। यू मेडिस टीका के लिए उपयोग की जाने वाली सेल निलंबन संस्कृति एकाग्रता का उपयोग अन्य बायोट्रोफिक फंगल रोगजनकों के साथ टीका लगाने के लिए एक प्रारंभिक एकाग्रता के रूप में भी किया जा सकता है। अन्य बायोट्रोफिक फंगल रोगजनकों का उपयोग करते समय रोगजनक कोशिका निलंबन संस्कृति के विभिन्न कमजोर पड़ने का परीक्षण करने की सलाह दी जाती है। इससे टीका लगाने के लिए इस्तेमाल की जा रही रोगजनक कोशिका निलंबन संस्कृति के लिए सर्वोत्तम एकाग्रता के चयन में आसानी होगी।

^6,23ब्याज रोगजनक के प्रतिरोधी पौधों की संभावित पहचान करने के लिए पौधों की आबादी से अधिक संख्या में पौधों को टीका लगाया जाना चाहिए और उनकी जांच की जानी चाहिए । इसलिए, एक टीका विधि का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जो पौधे की पत्तियों के बीच में रोगजनक कोशिका निलंबन संस्कृति को मज़बूती से बचाता है और यह पौधों की सापेक्ष आसानी और थोड़ा हेरफेर के साथ किया जाता है। यह कई प्रयोगों में प्रजनन योग्य फेनोटाइप की सुविधा प्रदान करेगा। वर्तमान प्रोटोकॉल एक यू मेडिस सेल निलंबन संस्कृति के साथ मक्का और टेओसिंते पौधों के तने में सुई इंजेक्शन टीका की एक विस्तृत रूपरेखा देते हैं। इस विधि का उपयोग मक्का और टेओसिंते के समान अन्य पौधों की प्रजातियों के टीका के लिए भी किया जा सकता है। पौधे में बीमारी पैदा करने के लिए, यू मेडिस को पौधे के ऊतकों में स्थानांतरित करना चाहिए^7,21,24। प्राकृतिक संक्रमण के दौरान, यू मेडिस पौधे के पत्ते की सतह पर स्टोमेटल उद्घाटन या घावों के माध्यम से पौधे के ऊतकों में चलता है। यू मेडिस प्राकृतिक संक्रमण प्रक्रिया की नकल करने के लिए एक डिप टीका और पौधे के चक्कर लगाने की विधि का भी उपयोग किया गया है, लेकिन पौधे के ऊतकों को^8-10,25में प्रवेश करने की रोगजनकों की क्षमता में परिवर्तनशीलता के कारण सीमित सफलता मिली है। हालांकि, सुई इंजेक्शन टीका विधि पौधे के बीच में यू मेडिस सेल निलंबन संस्कृति बचाता है रोगजनक प्रवेश मुद्दे को नष्ट करने ।

²⁵रोगजनक के प्रतिरोधी पौधों की पहचान करने के लिए आवश्यक में यू मेडिस के लिए एक प्रतिरोध प्रतिक्रिया रेटिंग पैमाने की स्थापना । वर्तमान प्रोटोकॉल मक्का और टेओसिंते पौधों के यू मेडिस संक्रमण के लिए स्थापित 1 (प्रतिरोधी) से 5 (अतिसंवेदनशील) रोग रेटिंग पैमाने का विस्तृत विवरण देते हैं। यह पहले एक परीक्षण टीका प्रदर्शन और पौधों की एक छोटी संख्या में सैकड़ों पौधों के साथ एक बड़े पैमाने पर प्रयोग शुरू करने से पहले स्क्रीन करने के लिए नपुंसक है । वर्तमान प्रोटोकॉल प्रदर्शन में स्थापित प्रतिरोध प्रतिक्रिया रेटिंग पैमाने में दो अलग-अलग प्रयोगों में 700 पौधों के लिए फेनोटाइप शामिल हैं। परिणामों की निरंतरता और प्रजनन क्षमता प्रदर्शित करने के लिए कम से कम दो बार टीका और स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल दोहराने की सलाह दी जाती है।

वर्तमान सुई इंजेक्शन टीका विधि और स्थापित प्रतिरोधी प्रतिक्रिया रेटिंग पैमाने के लिए स्क्रीन और मक्का का चयन करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा रहेगा और/ नतीजतन, दो तरीकों कृषि में कई महत्वपूर्ण निहितार्थ है कि अमेरिका में बेहतर प्रतिरोध के लिए प्रजनन कार्यक्रमों में इस्तेमाल किया जा सकता है maydis संक्रमण अमेरिका और अंतरराष्ट्रीय स्तर पर उपज नुकसान कम ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seed for plants			Collected from original crosses
Growth chamber	Conviron	PGR14 REACH-IN
Planting flats	Hummert International	14-3385-2
Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite)	Hummert International	10-1059-2
Laminar flow hood	Lab Conoco	70875372
Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest			Stocks were grown from original culture
Sterile loop	Fisher Scientific	S17356A
Potato dextrose agar (PDA) plates	Fisher Scientific	R454311
Incubator set to 30 °C	Fisher Scientific	11-690-650F
Sterile toothpicks	Walmart		Purchased from Walmart and sterilized by autoclave
Potato dextrose broth (PDB)	Fisher Scientific	ICN1008617
Incubator-shaker set to 30 °C	New Brunswick	14-278-179
Spectrophotometer	Fisher Scientific	4001000
U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml)			Grown from glycerol stock as described in the methods
3 ml Syringes	Becton Dickinson	309606
.457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles	Kendall Brands	8881250321