Multiplexado fluorescente Microarray para análise de proteína salivar humana Usando Polymer Microesferas e Pacotes de fibra óptica

Shuai Nie; Elena Benito-Peña; Huaibin Zhang; Yue Wu; David R. Walt

doi:10.3791/50726

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Artigo de método

Multiplexado fluorescente Microarray para análise de proteína salivar humana Usando Polymer Microesferas e Pacotes de fibra óptica

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DOI:

10.3791/50726

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10 de outubro de 2013

Shuai Nie¹ , Elena Benito-Peña¹^,² , Huaibin Zhang¹ , Yue Wu³ , David R. Walt¹

¹Department of Chemistry, Tufts University, ²Department of Analytical Chemistry, Complutense University (Spain), ³Department of Electrical and Computer Engineering, Tufts University

Neste artigo

Resumo

Nós descrevemos um procedimento para perfilar proteínas salivares usando multiplexados matrizes à base de microesferas de anticorpos. Os anticorpos monoclonais foram covalentemente ligados para 4,5 mM microesferas fluorescentes polímero codificado-dye usando química carbodiimida. As microesferas modificadas foram depositados em micropoços de fibra óptica para medir os níveis de proteína na saliva usando imunoensaios sanduíche de fluorescência.

Resumo

Relata-se um protocolo para medir simultaneamente seis proteínas na saliva usando uma baseada em microesfera variedade de anticorpos de fibra óptica. A tecnologia de imuno-matriz empregada combina as vantagens de suspensão à base de fabrico de microesferas de matriz com a utilização de microscopia de fluorescência. Tal como descrito no protocolo de vídeo, microesferas de polímero 4,5 mM disponíveis comercialmente foram codificados em sete tipos diferentes, diferenciadas por a concentração de dois corantes fluorescentes aprisionados fisicamente dentro das microesferas. As microesferas codificados contendo grupos carboxilo de superfície foram modificados com anticorpos de captura monoclonais através de EDC / NHS acoplamento química. Para montar o microarray de proteínas, os diferentes tipos de microesferas codificados e funcionalizados foram misturadas e depositadas aleatoriamente em 4,5 mM microcavidades, que foram quimicamente gravado na extremidade proximal de um feixe de fibras ópticas. O feixe de fibras ópticas, foi usado como um portador para a imagem latente e o microspheres. Depois de montada, a micromatriz foi utilizado para capturar as proteínas no sobrenadante da saliva recolhida a partir da clínica. A detecção foi baseada num imunoensaio de sanduíche utilizando uma mistura de anticorpos de detecção de bioestanhados para diferentes analitos com uma sonda fluorescente de estreptavidina conjugada com R-ficoeritrina. O microarray foram visualizados por meio de microscopia de fluorescência, em três canais diferentes, dois para o registo de microesferas e um para o sinal de ensaio. As micrografias de fluorescência foram decodificados e analisados por meio de um algoritmo de caseiro em MATLAB.

Introdução

Desde o primeiro microarray relatado por Mark Schena e colegas de trabalho em meados de 1990, esta poderosa ferramenta tem sido utilizada em muitos campos da pesquisa biológica ^1. Microarrays de anticorpo capaz de detectar simultaneamente várias proteínas em fluidos de diagnóstico, tais como o sangue, tem aplicações importantes no diagnóstico clínico e biomarcador rastreio ^2-10. Saliva, que contém muitos dos mesmos analitos como sangue, tem sido considerada como uma alternativa preferível ao sangue porque recolha de saliva é seguro, não invasivo, e pode ser levada a cabo por pessoal médico minimamente treinados ^11-13. Actualmente, a a....