Multiplexado fluorescente Microarray para análise de proteína salivar humana Usando Polymer Microesferas e Pacotes de fibra óptica

Summary

Nós descrevemos um procedimento para perfilar proteínas salivares usando multiplexados matrizes à base de microesferas de anticorpos. Os anticorpos monoclonais foram covalentemente ligados para 4,5 mM microesferas fluorescentes polímero codificado-dye usando química carbodiimida. As microesferas modificadas foram depositados em micropoços de fibra óptica para medir os níveis de proteína na saliva usando imunoensaios sanduíche de fluorescência.

Abstract

Relata-se um protocolo para medir simultaneamente seis proteínas na saliva usando uma baseada em microesfera variedade de anticorpos de fibra óptica. A tecnologia de imuno-matriz empregada combina as vantagens de suspensão à base de fabrico de microesferas de matriz com a utilização de microscopia de fluorescência. Tal como descrito no protocolo de vídeo, microesferas de polímero 4,5 mM disponíveis comercialmente foram codificados em sete tipos diferentes, diferenciadas por a concentração de dois corantes fluorescentes aprisionados fisicamente dentro das microesferas. As microesferas codificados contendo grupos carboxilo de superfície foram modificados com anticorpos de captura monoclonais através de EDC / NHS acoplamento química. Para montar o microarray de proteínas, os diferentes tipos de microesferas codificados e funcionalizados foram misturadas e depositadas aleatoriamente em 4,5 mM microcavidades, que foram quimicamente gravado na extremidade proximal de um feixe de fibras ópticas. O feixe de fibras ópticas, foi usado como um portador para a imagem latente e o microspheres. Depois de montada, a micromatriz foi utilizado para capturar as proteínas no sobrenadante da saliva recolhida a partir da clínica. A detecção foi baseada num imunoensaio de sanduíche utilizando uma mistura de anticorpos de detecção de bioestanhados para diferentes analitos com uma sonda fluorescente de estreptavidina conjugada com R-ficoeritrina. O microarray foram visualizados por meio de microscopia de fluorescência, em três canais diferentes, dois para o registo de microesferas e um para o sinal de ensaio. As micrografias de fluorescência foram decodificados e analisados ​​por meio de um algoritmo de caseiro em MATLAB.

Introduction

Desde o primeiro microarray relatado por Mark Schena e colegas de trabalho em meados de 1990, esta poderosa ferramenta tem sido utilizada em muitos campos da pesquisa biológica ^1. Microarrays de anticorpo capaz de detectar simultaneamente várias proteínas em fluidos de diagnóstico, tais como o sangue, tem aplicações importantes no diagnóstico clínico e biomarcador rastreio ^2-10. Saliva, que contém muitos dos mesmos analitos como sangue, tem sido considerada como uma alternativa preferível ao sangue porque recolha de saliva é seguro, não invasivo, e pode ser levada a cabo por pessoal médico minimamente treinados ^11-13. Actualmente, a análise da proteína multiplexado utilizando amostras de saliva é limitada por vários factores importantes, incluindo a baixa concentração do analito alvo ¹⁴ e o largo intervalo de concentração de diferentes biomarcadores ^15.

.

Aqui, nós demonstramos a análise de seis proteínas: fator de crescimento endotelial vascular humano (VEGF), proteína induzida por interferão gama, 10 (IP-10), interleucina-8 (IL-8), factor de crescimento epidérmico (EGF), metalopeptidase matriz 9 (MMP-9), e interleucina-1 beta (IL-1β) . O desempenho do método foi inicialmente verificado utilizando soluções padrão constituindo proteínas recombinantes de analitos e tampão de bloqueio. Amostras de saliva reais coletadas de pacientes de diferentes doenças respiratórias crônicas, bem como controles saudáveis ​​também foram testados com desempenho satisfatório. O protocolo deve ser aplicável a outros analitos de proteína e outros ensaios baseados em microesferas. Esta plataforma oferece vantagens consideráveis ​​para o campo Analytical Chemistry, uma vez que permite a análise simultânea rápido, preciso e reprodutível de baixas concentrações de várias proteínas com uma gama ampla dinâmica, as interações não-específicas mínimas, reduziu o consumo de amostra, e de baixo custo em comparação com um análogo Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).

Protocol

Figura 1. . Fluxo de trabalho para aplicar matriz anticorpo microesfera de fibra óptica para a saliva de perfis (1) As microesferas são internamente codificado com dois corantes fluorescentes, (2) as microesferas codificados são externamente modificada com anticorpos monoclonais específicos para a proteína, (3) as microesferas multiplexados são misturados, e (4) depositado aleatoriamente em micropoços gravado na extremidade proximal de um feixe de fibras ópticas, (5) as proteínas salivares são capturados por microesferas através de imunoensaio de sanduíche, e (6) quantificados por microscopia de fluorescência.

1. Microesferas Encoding

1. Pesar európio de sódio (III) thenoyltrifluoroacetonate trihidrato (Eu-TTA, PM = 869,54 g / mol) num frasco de vidro âmbar e preparar uma solução de estoque 200 mM em tetra-hidrofurano (THF). Misture delicadamente por pipetagem; verificar visualmenteo corante esteja completamente dissolvido.
2. Pesar cumarina 30 (C30, PM = 347,41 g / mol) num frasco de vidro âmbar e preparar uma solução de estoque 12 mM em THF. Misturar suavemente por pipetagem; visualmente verificar o corante esteja completamente dissolvido.
3. Prepare a 700 ul de solução de trabalho para cada tipo de microesfera utilizando as soluções de reserva e de THF para atingir uma concentração final na Tabela 1.
4. Certifique-se de microsferas (10% w / v) são bem suspensas por vórtice, e depois transferir a suspensão de 60 mL para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
5. Adicionar 600 mL PBS a suspensão de microesferas e misture pipetando 20x. Centrifuga-se o tubo a 10.000 rpm durante 3 min e remover cuidadosamente o sobrenadante. Repetir este processo mais 2x para lavar as microsferas.
6. Lava-se a pelete 3x com microesferas de THF utilizando um procedimento semelhante ao passo 1.5.
7. Centrifugar a suspensão de microsferas / THF a 10.000 rpm, durante 3 min, remover o sobrenadante, e re-suspender o sedimento em 600 ulSolução de trabalho de listados na Tabela 1. Transferir a mistura para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 ml.
8. Selar o tubo de microcentrífuga com Parafilm e colocá-lo em uma coqueteleira. Agite a 3.000 rpm e incubar por 24 horas, proteger da luz, cobrindo a instalação usando uma caixa coberta com papel alumínio.
9. Centrifugar a suspensão de microesferas a 10.000 rpm durante 3 minutos para formar uma pelete.
10. Remover a solução de corante sobrenadante, lavar as microesferas 6X com 600 ul de metanol e em seguida com 600 ul de PBS contendo 0,01% de Tween-20, um outro 6x, tal como descrito na etapa 1.5.
11. Armazenar as microesferas codificadas em 600 ul de PBS contendo 0,01% de Tween-20 a 4 ° C até à sua utilização, proteger da luz.

Nome do tipo de microesfera:	1	2	3	4	5	6	7
Eu-TTA (mM)	100	100	10	100	10
C30 (mM)		1	1	6	6	1	6

Tabela 1. As concentrações de Eu-TTA e C30 soluções de trabalho.

2. Preparação de microesferas de captura de Proteína

1. Preparar tampão MES [2 - (N-morfolino) etanossulfónico (MES) 0,1 M, NaCl a 0,9%, SDS a 0,01%, pH 5,7] e tampão PBS / SDS (fosfato de sódio 0,01 M, NaCl 0,154 M, SDS a 0,01%, pH 7,4) com antecedência à temperatura ambiente.
2. Adicionar 200 mL de suspensão de microesferas codificadas (contendo ~ 2 mg de microesferas) em um Safe-Lock 1,5 ml tubo de microcentrífuga. É importante a utilização deste tipo de tubo de microcentrífuga para evitar o derrame durante a incubação no passo 2.6.
3. Lavar as microesferas com 600 ul de tampão MES 3x como descrito na etapa 1.5. Adicionar 700 ul de MES para o pellet de microsferas e misturar bem por pipetagem.
4. Prepare a 0,105 g / ml de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC, MW = 191,7 g / mol) e 0,163 g / ml de sulfo-N-hidroxissulf (sulfo-NHS, PM = 217,13 g / mol) soluções em tampão MES em tubos separados.
5. Adicionar 150 ul de solução recém-preparada de EDC, gota a gota, à suspensão de microesferas. O EDC hidrolisa muito rapidamente, pelo que é essencial para utilizar feita recentemente solução para assegurar a eficiência de imobilização. Imediatamente após a adição de EDC, adicionar 150 ul de solução de sulfo-NHS para as microesferas, misturar bem por pipetagem e verificar se a suspensão homogénea.
6. Tampe o tubo, selá-lo com Parafilm, e colocá-lo em uma coqueteleira. Agite a 1.500 rpm, durante 4 horas, proteger da luz usando uma caixa coberta com papel alumínio.
7. Centrifugar as suspens microesferasion a 10.000 rpm durante 3 minutos para formar uma pelete e remover o sobrenadante. Lave as microesferas com 500 ul de PBS / SDS 3x tampão como descrito no passo 1.5.
8. Adicionar 200 ul de tampão PBS / SDS ao precipitado, as microesferas misturar bem e transferir a solução para 300 ul de tampão PBS / SDS contendo 60 ug de anticorpos de captura. É importante para suspender o sedimento de microsferas primeiro e, em seguida, adicionar a suspensão de microesferas para a solução de anticorpo.
9. Incubar a mistura de anticorpos-microesferas agitando a 1.500 rpm, durante 4 horas em um shaker, proteger da luz usando uma caixa coberta com papel alumínio.
10. Centrifugar a suspensão de microesferas a 10.000 rpm durante 3 minutos para formar uma pelete e remover o sobrenadante. Lave as microesferas com 500 ul StartingBlock (TBS) bloqueando 3x tampão, como descrito no passo 1.5.
11. Misturar microesferas com 1 ml de TBS tampão de bloqueio e incubar microesferas a 1.500 rpm durante 1 hora, num agitador, proteger da luz usando um enseada caixavermelho com folha de alumínio.
12. Centrifugar a suspensão de microesferas a 7.000 rpm, durante 3 minutos, para formar um sedimento e remove-se o sobrenadante. Lava-se a pelete 3x com 500 ul de TBS tampão de bloqueio, como descrito no passo 1.5.
13. Centrifugar a solução de microesferas a 7.000 rpm, durante 3 minutos, para formar um sedimento e remove-se o sobrenadante. Adicionar 500 mL de TBS tampão de bloqueio e misture por pipetagem.
14. Armazenar a suspensão de microesferas modificadas a 4 ° C até à sua utilização, proteger da luz.
15. Repita este procedimento para fazer outros tipos de microesferas utilizando anticorpos correspondentes.

3. Assembléia Microarray de fibra óptica

1. Misturar 50 ul de cada tipo de micro-esferas de captura de proteína para um novo tubo de microcentrifugação esterilizado. Centrifugue as microesferas imagens reunir a 7.000 rpm, durante 3 min, e remover o sobrenadante, de modo que o volume remanescente é de aproximadamente 100 ul.
2. Feixes de fibra óptica cortados à mão a cerca de 5 cm de comprimento esequencialmente polir ambas as extremidades de uma máquina de polimento, utilizando 30, 15, 9, 6, 3, 1, 0,5, e 0,05 mM de diamante de tamanho de polimento filmes. Sonicar o pacote polido em água deionizada por 2 min para remover quaisquer partículas.
3. Colocar uma pequena barra de agitação magnética para um tubo de microcentrífuga de 0,5 ml, adicionar 400 mL de PBS isento de proteína padrão e agite sobre uma placa de agitação magnética durante 30 min para remover as bolhas de ar.
4. Etch uma das extremidades do feixe de fibras polido em uma solução 0,025 N de HCl durante 150 segundos ^10,16. Imediatamente submergir e sonicate final gravado em água deionizada por 1 min. Secam-se os feixes de fibras, com ar comprimido.
5. Montagem do feixe de fibras sobre um suporte de fibra e bloquear a extremidade gravadas no, tampão PBS livre de proteína livre de bolhas durante 1 hora.
6. Depósito 1 ul alíquota da suspensão de microesferas armazenado na extremidade entalhada do feixe de fibras ópticas. Proteja a instalação da luz com uma caixa com papel alumínio e aguarde 15 min. O volume da suspensão serádiminuir por evaporação e forçar as microesferas para os micropoços gravadas. Repetir esta etapa de carregamento mais uma vez.
7. Utilize um cotonete saturado com solução de amostra para remover microesferas que não estão presas nos micropoços. O microarray proteína já está pronto para usar. Vá imediatamente para o passo 4.1 para a análise de saliva.

4. Análise Saliva Amostra Utilizando Microesferas Microarray

1. Adicionar solução de amostra de 200 ul (100 ul de sobrenadante de saliva diluída com igual volume de StartingBlock T20 (PBS), tampão de bloqueio. Do protocolo de recolha de saliva sobrenadante foi publicada previamente ^10). para um tubo de microcentrífuga de 0,5 ml autoclavado. Mergulhar o microarray de proteína carregada sobre a fibra para dentro da solução e incubar num agitador a 600 rpm durante 2 h, protegido da luz utilizando uma caixa coberta com folha de alumínio.
2. Preparar 20 ml de tampão de lavagem através da adição de 200 ul de solução de BSA a 10% e 200 ul de 10% de Tween-20 em 19,6 ml de PBS, mix bem agitando suavemente.
3. Mergulhe o microarray de proteínas em um novo tubo de microcentrífuga autoclavada contendo 200 tampão de lavagem e agitar a 600 rpm por 2 min. Repita esta lavagem 3x.
4. Incubar o microarray em solução de 100 mL de um cocktail de anticorpos de detecção que contém 5 ug / ml de anti-VEGF, IP-10, IL-8, FEG, MMP-9, anticorpos de detecção de IL-1β biotinilados em StartingBlock T20 (PBS), tampão de bloqueio durante 30 min à temperatura ambiente no agitador a 600 rpm, proteger da luz usando uma caixa coberta com folha de alumínio.
5. Lavar 3x com tampão de lavagem de microarray, tal como descrito na etapa 4.3.
6. Incubar o microarray em 200 ul de ug / ml de conjugado de R-ficoeritrina estreptavidina (SAPE) solução a 20 em PBS, a 600 rpm no agitador durante 10 minutos, proteger da luz usando uma caixa coberta com folha de alumínio.
7. Lava-se a 5x com tampão de lavagem de microarray como descrito na etapa 4.3.
8. Limpar a extremidade distal da fibra (isto é, na extremidade opostaa partir das microesferas) junte com um cotonete saturado com etanol absoluto.
9. Seca-se ambas as extremidades da fibra com o ar comprimido. Montar a fibra num microscópio de epifluorescência e imagem através da extremidade distal da fibra.
10. Adquirir imagens de microesferas correspondentes ao Eu-TTA, C30 e Sapé intensidades de emissão de fluorescência. Filtros ópticos configuração e tempo de exposição para imagens de fluorescência de Eu-TTA, C30 e SAPE estão representados na Tabela 2.

Canal	Eu-TTA	C30	SAPE
Excitador	365/10x	350/50x	546/10x
Refletor	525DCLP	400DCLP	560LP
Emitter	620/60m	460/50m	580/30m
Tempo de exposição	1 seg	0,3 seg	1 seg

Tabela 2. Parâmetros para as três imagens fluorescentes de microarray.

Results

As imagens de fluorescência a partir de três canais, mostrando uma pequena parte do feixe de fibras ópticas, são mostrados nas Figuras 2A-C. Estas imagens foram analisadas utilizando um algoritmo escrito em Matlab (como descrito em mais detalhe na secção Discussão). A análise utiliza tanto a informação de codificação de imagem do Eu-ATT (Figura 2A) e da imagem de codificação C30 (Figura 2B) para descodificar as microesferas, e as intensidades de fluorescência de diferen...

Discussion

Os investigadores devem prestar atenção extra para os seguintes passos: para uma melhor precisão de decodificação, é necessário verificar as microesferas foram homogeneamente suspensa em todos incubação e lavagem etapas durante o processo de microesferas de codificação. Além disso, as microesferas codificados devem ser protegidos da luz durante todo o experimento. Após os procedimentos de codificação e armazenamento adequados, descobrimos que a precisão geral de decodificação foi acima de 99%. As microesferas codificada...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eu-TTA corante	Fisher Scientific	AC42319-0010
THF	Sigma-Aldrich	34865-100ML
Frasco de vidro âmbar	Fisher Scientific	03-339-23B
Cumarina 30 corante	Sigma-Aldrich	546127-100MG
Microesferas	Bangslabs	PC05N / 6698
tubos de microcentrífuga de 1,5 ml	Fisher Scientific	05-408-129
PBS 10x concentrado	Sigma-Aldrich	P5493-1L
Água	Sigma-Aldrich	W4502-1L
Metanol	Sigma-Aldrich	34860-100ML
Tw-20	Sigma-Aldrich	P7949-100 ml
BupH MES tampão salino	Thermo Scientific	28390
Solução de NaOH SDS	Sigma-Aldrich	05030-500ML-F
	Fisher Scientific	SS256-500
Tubo de microcentrífuga com trava segura	VWR labshop	53511-997
EDC	Thermo Scientific	22980
Sulfo-NHS	Thermo Scientific	24510
Anticorpo de captura de VEGF humano	R& D Systems	MAB293
Anticorpos de captura IP-10 humanos	R& D Systems	MAB266
Anticorpo de captura de IL-8 humano	R& D Systems	MAB208
Anticorpos de captura EGF humano	R& D Systems	MAB636
Anticorpo de captura MMP-9 humano	R& D Systems	MAB936
Human IL-1β anticorpo de captura	R& D Systems	MAB601
Mouse IgG1 anticorpo de controle de isotipo	R& D Systems	MAB002
StartingBlock (TBS) tampão	Thermo Scientific	37542
HCl solução padrão 1,0 N	Sigma-Aldrich	318949-500 ml
0,5 ml tubos de microcentrífuga	Fisher Scientific	05-408-120
Tampão livre de proteína (PBS)	Thermo Scientific	37572
VEGF humano recombinante 165	R& D Systems	293-VE
R & IP-10 humano recombinante	D Systems	266-IP
IL-8 humano recombinante	R& D Systems	208-IL
EGF humano recombinante	R& D Systems	236-EG
MMP-9 humano recombinante	R& D Systems	911-MP
IL-1&beta humano recombinante;	R& D Systems	201-LB
StartingBlock T20 (PBS) buffer	Thermo Scientific	37539
Bloqueador BSA em PBS	Thermo Scientific	37525
Anticorpo de detecção de VEGF biotinilado	R & D Systems	BAF293
Anticorpo de detecção IP-10 biotinilado	R& D Systems	BAF266
Anticorpo de detecção de IL-8 biotinilado	R& D Systems	BAF208
Anticorpo de detecção de EGF biotinilado	R& D Systems	BAF236
Anticorpo de detecção MMP-9 biotinilado	R& D Systems	BAF911
Anticorpo de detecção de IL-1β biotinilado	R& D Systems	BAF201
Streptavidin, R-ficoeritrina	Invitrogen	S-21388
Etanol (200 provas)	Sigma-Aldrich	E7023-500ML