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DOI:

10.3791/50766

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10 de dezembro de 2013

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1Laboratory of Pediatric Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Radboud university medical center

Neste artigo

Resumo

O vírus sincicial respiratório humano (HRSV) pode causar bronquiolite grave em lactentes pequenos. Parte da patogênese da doença grave por HRSV é causada pela resposta imune do hospedeiro. A estimulação de células imunes humanas primárias com HRSV fornece um sistema modelo rápido e reprodutível para estudar a ativação de vias inflamatórias e infecções.

Resumo

O vírus sincicial respiratório humano (HRSV) infecções apresentar um largo espectro de gravidade da doença, variando desde as infecções suaves a bronquiolite com risco de vida. Uma parte importante da patogênese da doença grave é uma resposta imune melhorada levando a imunopatologia.

Aqui, nós descrevemos um protocolo usado para investigar a resposta imune de células do sistema imunológico humano a uma infecção HRSV. Em primeiro lugar, descrevemos métodos utilizados para a cultura, purificação e quantificação de HRSV. Subsequentemente, foi descrito um modelo humano in vitro, em que as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) são estimuladas com HRSV vivo. Este sistema modelo pode ser usado para estudar vários parâmetros que podem contribuir para a gravidade da doença, incluindo a resposta imune inata e adaptativa. Estas respostas podem ser medido ao nível da transcrição e da tradução. Além disso, a infecção virai de células pode ser facilmente medida utilizando citometria de fluxo. Tomadojuntos, a estimulação de PBMC com HRSV vivo fornece um sistema modelo rápido e reprodutível para examinar os mecanismos envolvidos na doença induzida por HRSV.

Introdução

O Vírus Sincicial Respiratório Humano (HRSV) é a causa mais comum de infecções do trato respiratório inferior em crianças. A cada ano, mais de 33 milhões de crianças menores de cinco anos são infectadas pelo HRSV, levando a mais de três milhões de hospitalizações e quase 200.000 mortes1. Um crescente corpo de evidências sugere que o HRSV também representa uma ameaça significativa para idosos e adultos com doenças crônicas subjacentes2.

A maioria das infecções por vírus da raça (HRSV) em crianças pequenas apresenta sintomas leves, comparáveis ao resfriado comum, e não requer intervenção clínica. No entanto, uma pequena proporção de pacientes necessita de hospitalização e ventilação mecânica devido à bronquiolite grave.

Parte da patogênese da doença por HRSV é a resposta imune superexuberante e inadequada do hospedeiro à infecção3,4. Isso é ilustrado por várias observações. O período de doença máxima é frequentemente precedido pelo pico da infecção viral e coincide melhor com a infiltração celular dos tecidos infectados e a liberação de citocinas inflamatórias3. Outra linha de evidência vem dos ensaios de HRSV inativado com formalina (FI-RSV) na década de 1960. Em vez de induzir proteção em bebês pequenos, a vacina resultou em uma resposta imune exagerada, resultando em aumento da doença respiratória e maior morbidade e mortalidade.

Vários modelos foram desenvolvidos para estudar a patogênese das infecções por HRSV. Linhagens celulares contínuas, como HEp-2 e A549, têm sido amplamente utilizadas para estudar a infecção por HRSV in vitro. As células epiteliais são os principais alvos da infecção por HRSV5, portanto, muito foco tem sido nesses tipos de células. No entanto, a situação in vivo é muito mais complexa e não se limita a um tipo de célula. Para examinar essas interações complexas, vários modelos de infecção animal foram desenvolvidos para estudar a patogênese do HRSV. Até agora, duas estratégias diferentes foram empregadas, com foco em modelos heterólogos (não humanos) e modelos cognatos de pneumovírus hospedeiro. Exemplos de modelos heterólogos para HRSV incluem chimpanzés, ovelhas, ratos de algodão e camundongos. A infecção por VSR em seu hospedeiro natural tem sido estudada em bovinos e em camundongos, utilizando VSR bovino e pneumovírus, respectivamente.

Embora cada um desses modelos tenha fornecido informações importantes sobre a patogênese da doença, o HRSV é altamente adaptado aos seres humanos. Portanto, como um complemento às linhagens celulares e modelos animais atualmente utilizados, propomos o uso de PBMCs primárias humanas como modelo para estimulação com HRSV. PBMCs humanos podem ser obtidos de uma variedade de indivíduos para abordar questões específicas de pesquisa, incluindo crianças pequenas6, indivíduos imunocomprometidos, bem como adultos saudáveis7 ou idosos8. Os PBMCs podem ser usados para estudar aspectos inatos da infecção, bem como a resposta adaptativa ao vírus. As vias inflamatórias ativadas importantes para a patogênese da doença por HRSV podem ser estudadas no nível de mRNA e proteína. Além disso, a infecção viral de (subconjuntos de) células imunes pode ser determinada por citometria de fluxo. Usamos esse modelo anteriormente para identificar os efeitos sinérgicos da infecção por HRSV juntamente com o ligante bacteriano muramil dipeptídeo (MDP) na indução de citocinas pró-inflamatórias7. Propomos usar a estimulação por HRSV de PBMCs primárias humanas como um modelo in vitro robusto, fácil e rápido para estudar as vias inflamatórias envolvidas na patogênese da doença por HRSV.

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Protocolo

Observação:

Experimentos com HRSV devem ser realizados em uma cabine de segurança biológica em laboratório de nível de biossegurança 2. Colete todos os resíduos virais e materiais que entraram em contato com o vírus para descarte adequado devido aos riscos biológicos.

Precauções especiais devem ser tomadas ao usar sangue humano potencialmente infectado.

É fundamental utilizar reagentes livres de endotoxinas em todos os protocolos.

1. Cultivo do HRSV A2

  1. Cultive células HeLa ou HEp-2 em meio DMEM + 10% soro fetal bovino (SFB) + 1% penicilina/estreptomicina (P/E) em um frasco de 175 cm²2 frasco de cultura até que estejam aproximadamente 50% confluentes.
  2. Lave as células três vezes com solução salina tamponada com fosfato à temperatura ambiente (PBS).
  3. Descongele um frasco com estoque de vírus de inoculação de HRSV em 37 °C em banho-maria. Dilua o estoque viral de modo a manter a MOI em 0,1 ou abaixo. Isso evitará a geração de partículas interferentes deficientes (DIPs). Dilua o estoque viral em 4 ml/frasco de meio de infecção (DMEM + 1% P/S) e adicione às células HeLa ou HEp-2. Mantenha este volume tão baixo quanto possível sem causar dessecação das células. Quanto menor o volume, maior será a taxa de infecção.
  4. Incubar 2-4 h em 37 °C, 5% CO₂2. Gire o frasco a cada 15 min para redistribuir o meio.
  5. Retire o inóculo e lave uma vez com PBS.
  6. Adicione 15 ml de meio de cultura (DMEM + 10% FCS + 1% P/S) e incube por 3 a 5 dias a 37 °C, 5% CO₂2. Observe as células com microscopia de campo claro normal para detectar alterações citopatológicas induzidas pelo vírus, por exemplo formação de sincícia e morte e células flutuantes.
  7. Quando aparecerem alterações citopáticas, colete o HRSV raspando as células e recolha a suspensão viral em um tubo estéril de 50 ml. Vortexe a suspensão celular. A raspagem e o vortexamento das células liberam um maior número de partículas virais.
  8. Centrifugue a suspensão viral por 10 min à temperatura ambiente a 1.800 x g para formar um pellet com os detritos celulares. O HRSV no sobrenadante não sedimenta nesta velocidade e o sobrenadante pode ser usado diretamente para infectar múltiplas placas de 175 cm2 frascos ou pode ser armazenado a -80 °C como estoque de semente em alíquotas de 1 ml para uso futuro. Congele rapidamente o HRSV em nitrogênio líquido sempre que possível para evitar a perda de partículas virais infecciosas.
  9. Como mencionado acima, o inóculo preparado com o protocolo descrito é utilizado para infectar múltiplas garrafas de cultura de 175 cm²2 frascos de cultura. Repita o protocolo exato para produzir mais vírus para purificação. Purifique até 180 ml de suspensão viral em um único ciclo de ultracentrifugação.
  10. Quando aparecerem alterações citopáticas, colha o HRSV raspando as células e recolha o sobrenadante. Agite a suspensão viral em vórtex. Centrifugue durante 10 min à temperatura ambiente a 1.800 x g para sedimentar os detritos celulares. O HRSV no sobrenadante não sedimenta nesta velocidade, e o sobrenadante é aliquotado em 15 ml por tubo de 50 ml. Congele rapidamente e armazene a -80 °C até a purificação.

2. Purificação do HRSV

Observação: Antes de usar um ultracentrífuga, tenha em mente que se trata de um equipamento potencialmente perigoso. Leia os manuais e realize a primeira centrifugação ultracentrífuga sob a supervisão de alguém com experiência.

  1. Limpe os baldes de ultracentrifugação com etanol a 70% e deixe-os secar em uma cabine de segurança biológica.
  2. Coloque um tubo de centrífuga estéril em cada balde.
  3. Prepare uma solução de sacarose a 30% (p/v) em solução PBS, esterilize por filtração (filtro de 0,2 μm) e adicione 5 ml na parte inferior de cada tubo de centrífuga. Para um protocolo mais rápido, os tubos com a solução de sacarose podem ser congelados. Certifique-se de mantê-los estéreis.
  4. Se a solução de sacarose não tiver sido congelada, adicione cuidadosamente 30 ml da solução de HRSV sobre a solução de sacarose. Pipete lentamente para evitar perturbar a camada de sacarose. Mantenha uma distinção clara entre as camadas. Se os tubos tiverem sido congelados, despeje a suspensão viral sobre a solução de sacarose congelada e, em seguida, deixe descongelar.
  5. Equilibre cuidadosamente os seis baldes de ultracentrifugação com PBS estéril. Coloque a balança dentro de uma cabine de fluxo para manter a esterilidade. Encha os tubos até 3-5 mm abaixo da borda, para evitar o colapso dos tubos de centrífuga. Equilibre os baldes com diferença máxima de 0,1 g, incluindo a tampa rosqueável, caso as tampas não sejam perfeitamente idênticas.
  6. Centrifugue no ultracentrífugo por 1,5 h, a 4 °C e 20.000 rcf.
  7. Remova cuidadosamente o tubo de centrífuga do balde usando pinças estéreis. As partículas virais terão atravessado a camada de sacarose e formarão um precipitado (pellet). Por outro lado, fatores solúveis secretados pelas células (por exemplo, citocinas) permanecerão em solução. Incline o tubo de centrífuga para drenar todo o líquido. Deixe-o virado para baixo sobre uma superfície estéril, por exemplo, uma placa de cultura, para secar, mas sem deixar o pellet secar completamente.
  8. Adicione cuidadosamente 1 ml de Solução Salina Tamponada de Hank (HBSS) ao pellet e incline o tubo de centrífuga para drenar o HBSS. Deixe o tubo secar novamente virado para baixo sobre uma superfície estéril. Não deixe o pellet secar completamente.
  9. Reconstitua o pellet em 1 ml de HBSS pipetando para cima e para baixo 40 vezes. Tente evitar a formação de bolhas de ar, pois isso pode destruir o vírus.
  10. Aliquote o vírus, congele rapidamente em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C até uso posterior. Utilize um novo alíquota de vírus para cada experimento, pois ciclos repetidos de congelamento e descongelamento reduzirão o título infeccioso. Ao descongelar, sempre faça-o a 37 °C, pois o HRSV é menos estável entre -20 e 15 °C.

3. Quantificação do HRSV

Observação: Para garantir dados reproduzíveis, repita a quantificação pelo menos três vezes em duplicata.

3.1. Infecção de células A549

  1. Cultive células A549 em uma placa de 24 poços até atingirem confluência.
  2. Lave as células A549 duas vezes com 1 ml de PBS à temperatura ambiente.
  3. Prepare diluições seriadas 5 vezes do HRSV em Meio com Soro Reduzido. Adicione 100 μl do vírus diluído a ambos os poços. Faça no mínimo 4 diluições (por exemplo, 4, 20, 100 e 500 vezes). Inclua dois poços extras infectados com a dose mais alta do vírus (que serão usados para o controle de isotipo) e inclua dois poços mock-infectados.
  4. Incube as células por 2 horas a 5% de CO2, 37 °C. Agite suavemente a placa de 24 poços a cada 15 minutos para evitar secagem.
  5. Remova a suspensão viral e lave as células uma vez com 1 ml de PBS à temperatura ambiente.
  6. Prepare BSA (albumina sérica bovina) a 4% (p/v) em Meio com Soro Reduzido. Estérilize por filtração (filtro de 0,2 μm) e adicione 500 μl a cada poço.
  7. Incube a 5% de CO2, 37 °C por 22 horas.

3.2. Preparação para FACS

  1. Remova o meio e lave as células uma vez com 1 ml de PBS à temperatura ambiente.
  2. Adicione 200 μl de tripsina pré-aquecida (37 °C) a cada poço e incube por 10 min a 37 °C, 5% CO2.
  3. Verifique ao microscópio o desprendimento das células. Se as células estiverem destacadas, adicione 800 μl de DMEM + 10% FCS + 1% P/S para neutralizar a tripsina. Re-suspenda as células.
  4. Transfira as células para uma placa de 96 poços cônica, não tratada para cultura de tecidos. Centrifugue por 5 min a 400 x g à temperatura ambiente. Re-suspenda os pellets em 200 μl de PBS frio.
  5. Centrifugue por 5 min a 400 x g a 4 °C. Decante o sobrenadante e re-suspenda em 200 μl de PBS frio.
  6. Centrifugue por 5 min a 400 x g a 4 °C. Decante o sobrenadante e re-suspenda em 150 μl de acetona a 80%, gelada.
  7. Fixe as células à temperatura ambiente por 15 min.
  8. Centrifugue por 5 min a 400 x g a 4 °C. Decante o sobrenadante e re-suspenda em 200 μl de PBS frio + 0,1% BSA.
  9. Centrifugue por 5 min a 400 x g a 4 °C. Decante o sobrenadante e re-suspenda em 50 μl de anti-NP-RSV-FITC (diluído 1:50 em PBS + 1% BSA) ou em 50 μl de IgG2 anti-murino-FITC (este é um controle de isotipo; portanto, use a mesma concentração de anticorpo).
  10. Para o restante do protocolo, mantenha os tubos no escuro. Incube por pelo menos 1 h a 4 °C, podendo estender até a noite.
  11. Adicione 150 μl de PBS frio + 0,1% BSA.
  12. Centrifugue por 5 min a 400 x g a 4 °C. Decante o sobrenadante e re-suspenda em 200 μl de PBS frio + 0,1% BSA.
  13. Centrifugue por 5 min a 400 x g a 4 °C. Decante o sobrenadante e re-suspenda em 200 μl de PBS frio + 0,1% BSA. Mantenha a placa no gelo e no escuro até a medição por citometria de fluxo.
  14. Meça as células infectadas em um citômetro de fluxo.

3.3. Cálculo do FITC-50

  1. Utilize um programa de análise de citometria de fluxo para definir o ponto de corte usando o controle negativo (controle de isotipos). Utilize o tipo de gráfico Pseudocor. Desenhe um quadrante, onde as células positivas estão no campo Q3. A porcentagem de falsos positivos deve ser inferior a 0,2% em ambos os controles de isotipos.
  2. Exporte os dados para um programa de planilha eletrônica e prepare uma tabela com a porcentagem de células FITC+ para cada diluição. Subtraia o valor médio de falsos positivos (determinado pelo controle de isotipos) de cada valor em cada experimento.
  3. Abra um novo arquivo (dispersão XY, colunas únicas de X e múltiplas de Y) em um programa estatístico. Copie os dados para este programa: X = diluição, Y = % de células infectadas, n = 3, utilize a média de duas medidas para cada diluição. Realize uma regressão não linear, análise estatística de decaimento exponencial de uma fase. Verifique se a curva se ajusta aos pontos de dados; caso contrário, escolha uma análise estatística diferente.
  4. Copie a equação da curva e os valores para a equação para um programa de planilha eletrônica. Calcule o valor de X para Y = 50%. Determine, assim, o valor FITC-50 calculando as Partículas Infecciosas detectadas por FITC/ml (FIP/ml) na diluição na qual há 50% de infecção, utilizando a seguinte equação:
    Fórmula de cálculo do FITC50; diagrama ilustrando a equação de medição da intensidade de fluorescência.
    A = número médio de células A549 por poço
    B = μl de vírus por poço utilizados para infecção
    C = diluição na qual há 50% de infecção

4. Isolamento de Células Mononucleares do Sangue Periférico (PBMC) a Partir de Sangue de Voluntários Saudáveis

  1. Coletar sangue venoso em tubos de 10 ml com EDTA de voluntários saudáveis após consentimento informado. Um volume de 10 ml de sangue renderá aproximadamente 107 PBMCs.
  2. A partir de agora, trabalhar em condições estéreis dentro de uma cabine de fluxo laminar.
  3. Diluir o sangue em uma proporção de 1:1 com PBS à temperatura ambiente em um tubo de 50 ml. Por tubo de 50 ml, pode-se usar um volume máximo total de 35 ml de sangue diluído.
  4. Utilizar uma seringa estéril de 50 ml e acoplar uma agulha Luer lock esterilizada. Aspirar o meio de gradiente de densidade para dentro da seringa. Posicionar a agulha no fundo de um tubo contendo o sangue diluído e pipetar cuidadosamente 15 ml do meio de gradiente de densidade sob o sangue diluído. Manter uma delimitação nítida entre o meio de gradiente de densidade e o sangue.
  5. Centrifugar a 800 x g à temperatura ambiente por 20 minutos com aceleração no nível 9 (máximo) e freio desligado. Após o uso, ajustar a temperatura da centrífuga para 4 °C.
  6. A centrifugação em gradiente de densidade resultará em múltiplas camadas. Na parte inferior, haverá um precipitado com eritrócitos, com uma camada esbranquiçada (prateada) na superfície, contendo os neutrófilos. A camada clara acima desse precipitado contém o meio de gradiente de densidade. Uma fina camada entre o meio de gradiente de densidade e a camada superior de plasma sanguíneo contém os PBMCs.
  7. Coletar cuidadosamente os PBMCs com uma pipeta de Pasteur e transferir as células para um novo tubo de 50 ml. A partir de agora, manter os PBMCs sobre gelo e utilizar PBS gelado. Completar o volume para 50 ml com PBS gelado e centrifugar a 400 x g por 10 minutos a 4 °C (com o freio ajustado no nível 9).
  8. Descartar o sobrenadante por aspiração, ressuspender o precipitado em 50 ml de PBS gelado e centrifugar a 400 x g por 10 minutos a 4 °C; repetir o processo duas vezes.
  9. Após descartar o sobrenadante, adicionar 1 ml de meio gelado (RPMI + 1% P/S) e quantificar as células utilizando uma câmara de contagem.
  10. Ajustar a concentração celular para 5 x 106 PBMCs/ml.

5. Estimulação de PBMCs com HRSV vivo

  1. Prepare um arranjo do experimento; inclua duplicatas experimentais para cada condição.
  2. Dilua todos os estímulos necessários no meio (RPMI + 1% P/S). Considere que o volume final por poço será de 200 μl. Um volume de 50 μl de estímulos será adicionado, portanto prepare soluções estoque de estimulação 4x concentradas.
  3. Adicione 100 μl da suspensão celular mencionada acima a cada poço de uma placa de 96 poços com fundo redondo (5 x 105 PBMC/poço).
  4. Adicione 50 μl dos estímulos diluídos a cada poço. É possível adicionar dois estímulos diferentes, o que resulta em um volume total de 200 μl. Se apenas um estímulo for necessário, ajuste o volume para 200 μl com meio.
  5. Incube a placa de 96 poços pelo período de incubação necessário a 37 °C em uma incubadora com 5% de CO2. Para a maioria das citocinas, 24 horas de incubação serão suficientes.

6. Leitura do Estímulo

  1. Após o período de incubação, centrifugar a placa de 96 poços por 5 min a temperatura ambiente a 450 x g para recolher as células no fundo.
  2. Coletar o sobrenadante (retirar um volume máximo de 180 μl) e armazenar para análise subsequente de citocinas (-20 °C) ou para produção de vírus (-80 °C).
  3. Os PBMCs estimulados presentes no pellet podem ser analisados por qPCR/blotagem ocidental mediante adição de tampão de lise ou, alternativamente, os PBMCs podem ser corados para análise por citometria de fluxo.

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Resultados

O método de cultivo e purificação do HRSV A2 descrito aqui fornecerá um rendimento entre 2 x 107 e 2 x 108 partículas virais infecciosas quantificadas por FITC-50/mL. Os resultados da análise microscópica, na qual foram contadas células infectadas marcadas com FITC (resultados não mostrados), foram comparados aos resultados da quantificação por FACS (Figura 1). Ambos os métodos resultaram em títulos semelhantes, embora o método de FACS tenha apresentado um desvio padrão muito menor ...

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Discussão

Neste estudo, demonstramos que a infecção de PBMC com HRSV é um sistema modelo rápido e confiável no qual as vias inflamatórias podem ser estudadas. Para estimular as PBMC, é necessário preparar e quantificar um stock de HRSV.

Várias linhagens celulares são suscetíveis à infecção por HRSV. As linhagens celulares mais usadas para cultura de HRSV são as células HEp-2, HeLa e Vero. No entanto, não recomendamos o uso de células Vero para cultura de HRSV porque foi demonstrado que a cultura de HRSV...

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Divulgações

Não temos nada a divulgar.

Agradecimentos

RSV A2 foi gentilmente cedido pelo Dr. R. de Swart (Erasmus MC, Roterdã, Holanda). MV e GF são apoiados pelo consórcio Virgo, financiado pelo projeto do governo holandês número FES0908, e pelo projeto da Iniciativa Genômica da Holanda (NGI) número 050-060-452. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagente
PBSLonzaBE17-516FPBS sem Ca2+ Mg2+ ou vermelho de fenol
HBSSInvitrogen14025-100HBSS, Cálcio, Magnésio, sem vermelho de fenol
DMEMInvitrogen31966-047DMEM, Glicose alta, GlutaMAX, Piruvato
RPMIInvitrogen72400054RPMI 1640 Medium, GlutaMAX, HEPES
Reduced Serum Medium (Opti-MEM)Invitrogen51985-026Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX
FCSGreiner Bio-oneFBS (Fetal Bovine Serum)
BSASigma AldrichA7030Albumina de soro bovino
P/SInvitrogen15140-122Penicilina-Estreptomicina, tripsina líquida
Invitrogen25300-0540,05% Tripsina-EDTA (1x), células HeLa vermelhas de fenol
ATCCCCL-2
células A549ATCCCCL-185
sacaroseSigma AldrichS7903sacarose BioXtra, ≥ 99,5%
IgG2 anti-mouse-FITCBD Pharmingen555057Ms IgG2b K Controle de isotipo FITC
Anti-NP-RSV-FITCAbcamab25849Anticorpo anti-vírus sincicial respiratório [671] (FITC)
Meio de gradiente de densidade (Lymphoprep)Axis-Shield1114545
tubos EDTABD Biosciences367525
AcetonaMerck Millipore1000141000acetona para análise
Material
Tubos de centrífugaBeckman Coulter326823Thinwall, Polialômero, 38,5 ml, 25 mm x 89 mm
Rotor SureSpin 630 com baldes de 36 mlSorvall79368Rotor de titânio de balde oscilante
Sorvall WX80 UltracentrífugaSorvall46900
CB 150l CO2Pasta
de incubadora

Referências

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