In Vitro Ensaio para avaliar o impacto da imunorreguladora Pathways on específica para o HIV CD4 T efetoras celular Função

Resumo

Foi desenvolvido um ensaio in vitro para investigar o papel das vias de imunorreguladores na regulação da secreção de citoquinas por células T CD4 + específicas para o HIV.

Resumo

T exaustão celular é um fator importante na depuração patógeno falhou durante infecções virais crônicas. Vias imunoreguladores, tais como DP-1 e IL-10, são regulados positivamente em cima desta exposição do antigénio em curso e contribuir para a perda de proliferação, uma redução da função citolítica e auditivos produção de citoquinas por células T CD4 e CD8. No modelo murino de infecção por LCMV, a administração de anticorpos bloqueadores contra estas duas vias aumentou a resposta de células T. No entanto, não há atualmente nenhum ensaio in vitro para medir o impacto de tal bloqueio na secreção de citocinas em células de amostras humanas. Nosso protocolo ea abordagem experimental nos permitir quantificar de forma precisa e eficiente a restauração da produção de citocinas por células específicas para o HIV CD4 T de indivíduos infectados por VIH.

Aqui, retratam um delineamento experimental in vitro que permite medições de secreção de citocinas por células específicas para o HIV T CD4 e seu impacto no outro cell subconjuntos. Células CD8 T foram esgotadas de sangue total e PBMC restantes foram isolados através do método de separação com Ficoll. As PBMC esgotadas-CD8 foram então incubadas com anticorpos bloqueadores contra a PD-L1 e / ou IL-10Rα e, após a estimulação com um conjunto de peptídeos Gag de HIV-1, as células foram incubadas a 37 ° C, 5% de CO _2. Após 48 horas, o sobrenadante foi coletado para análise de citocinas por contas de matrizes e pellets celulares foram recolhidos para qualquer análise fenotípica por citometria de fluxo ou análise transcricional usando qRT-PCR. Para análise mais pormenorizada, as populações de células diferentes foram obtidos por depleção selectiva subconjunto de PBMC ou por triagem utilizando citometria de fluxo antes de ser avaliado nos mesmos ensaios. Estes métodos proporcionam uma abordagem altamente sensível e específico para determinar a modulação da produção de citoquinas por células T auxiliares específicas para o antigénio e para determinar as interacções funcionais entre as diferentes populações de células imunitárias.

Introdução

Durante infecções virais persistentes, as células-T específicos do vírus adquirir defeitos funcionais em um processo conhecido como T exaustão celular. No início de estudos in vivo no modelo murino de LCMV infecção viral crônica indicaram que as células específicas do vírus exaustos T reduziram função citolítica contra as células infectadas por vírus, perdem a capacidade de proliferar e ter a sua capacidade reduzida para produzir citocinas como IL-2, TNF- α e IFN-γ ^1,2. Uma rede complexa de vias imunoreguladores, tais como DP-1 e IL-10, são regulados positivamente durante infecções crónicas e contribuem para a disfunção de células T (revisto em ^3,4). Administração in vivo de anticorpos bloqueadores contra estas vias inibitórias no rato LCMV função das células específicas do vírus exaustos T e depuração viral reforçada modelo restaurado, indicando que células T exaustão é um fenômeno parcialmente reversível (revisto em ^5).

Achados no the modelo LCMV foram rapidamente estendido para infecções virais crônicas humanas, tais como HBV, HCV e HIV ^5. Na infecção crónica pelo HIV-1, DP-1 e IL-10 são as vias regulada em indivíduos infectados e correlacionam com os parâmetros de progressão da doença, directamente com a carga viral e inversamente com a contagem de CD4 ^6-8. Anticorpo bloqueio dos PD-1 ou IL-10 in vitro vias restaurada a proliferação de células T CD4 e CD8 específicas para o HIV, indicando que, tal como o modelo de rato de LCMV, t exaustão de células em seres humanos é um fenómeno é totalmente reversível. No entanto, devido à natureza delicada de experimentos em amostras humanas, bem como limitações na sensibilidade dos ensaios in vitro, investigação completa dos perfis de restauração funcionais obtidos por essas intervenções é notavelmente ausente. Ensaios de proliferação têm sido, até agora, a única no ensaio confiável vitro testado na maioria dos estudos, ainda não há uma notável falta de evidências sobre o impacto dessas interintervenções em: 1) a capacidade de morte de células T citotóxicas, 2) o efeito antiviral de células T na replicação viral, 3) o perfil de secreção de citoquinas, e 4) o efeito sobre a ajuda das células T CD4 + em outros subconjuntos de células.

Citocina coloração intracelular (ICS) é um fluxo muito útil e amplamente utilizado o ensaio baseado citometria que é usado para detectar a produção de citocinas em vários tipos de células em ambos os ratos e os seres humanos. Também tem sido utilizada para investigar o efeito de anticorpos de bloqueio de vias inibitórias. Em ensaios de ICS, a secreção de citocinas é bloqueada pela adição de Brefeldina e / ou monensina. Citocinas presos no interior das células são, então, detectados com anticorpos fluorescentes utilizando citometria de fluxo policromática. A duração do ensaio é normalmente limitada a 6 ou 12 horas após a estimulação de antigénio e uma vez que ambos Brefeldina A monensina, que são tipicamente adicionados a cerca de 2 horas de adição de antigénio, são tóxicos para as células. O ensaio ICS é uma técnica poderosa que tem sido útil in o estudo sobre o efeito da administração in vivo de bloqueio intervenção anticorpo em ratinhos em que as células foram extraídas após um certo período de tempo após a exposição ao anticorpo ^9. No entanto, há várias limitações para a aplicação desta abordagem experimental para avaliar o impacto do bloqueamento dos receptores inibitórios em amostras humanas. Ao realizar as intervenções de anticorpos de vias inibitórias em um estimulação de 6 ou 12 horas in vitro (tipicamente o caso com amostras humanas), o bloqueio dos receptores inibitórios na maioria dos casos, não altera a frequência de resposta de células T específicas de antigénio, como medida por ensaios padrão ICS ^{6, 7.} Medidas de produção por célula de citocinas, medidas pela intensidade média ou mediana de fluorescência deram resultados inconsistentes ^{6, 7, 10.} Por outro lado, quando o ICS é realizada a um ponto final de tempo após a estimulação (isto é, seis dias), as alterações no número de secretoras de citocinas cvaras podem ser observados. As diferenças são um efeito combinado da proliferação alterada, a sobrevivência, e alterações na função efetora que se acumulam ao longo do período de tempo especificado ^6. Uma maneira de superar parcialmente estas limitações é a incubar durante mais longos períodos de tempo (por exemplo, 36 hr, 60 hr, etc.) Com o antigénio antes da adição do bloqueador de secreção de citoquinas, sem esperar pela proliferação de ocorrer. Nós utilizamos com sucesso este método para determinar a cinética da secreção de citoquinas por células T CD4 e CD8 específicas para o HIV ^11,12; no entanto, esta abordagem não é capaz de detectar pequenas respostas e não dará um resultado integrado da secreção total de citocina ocorrendo dado que a estimulação. Portanto, o ICS não é um método sensível para detectar o impacto de bloqueio de vias inibitórias sobre a quantidade de citoquinas produzidas por células T activadas em comparação com citocina quantificação de ARNm ou medições da secreção de citocinas no supernatant no mesmo intervalo de tempo. Além disso, a maioria das citocinas produzidas por células T activadas agir de maneira autócrina ao contribuir para o feedback positivo ou negativo circula através da interacção com as células apresentadoras de antigénios. Portanto, a adição de Brefeldina A monensina ou durante o ensaio ICS impede a secreção de citocinas e, assim, a estimulação de células T não é óptima. Finalmente, a detecção de várias citocinas com o ICS é limitada pela disponibilidade e sensibilidade dos anticorpos para a detecção de citocinas com citometria de fluxo, bem como por limitações no número de fluorocromos que podem ser utilizados em simultâneo, em qualquer dado painel.

Desenvolvemos uma abordagem experimental in vitro, altamente sensível para avaliar o impacto de vias imunorreguladores na regulação da secreção de citoquinas por células T CD4 + específicas para o HIV e subsequentemente auxílio de CD4 de células apresentadoras de antígenos (APCs) e células assassinas naturais (células NK). Este método também pode ser utilizado para avaliar o impact do bloqueio de moléculas inibidoras sobre a função das células T CD8 por esgotar as células T CD4 de PBMC ou estimulando com peptídeos ideais que são reconhecidos apenas por células T CD8. Em contraste com os ensaios de coloração de citocinas intracelulares, decidimos não interferir com a secreção de citoquinas por células T CD4 + específicas para o HIV, a fim de ser capaz de: 1) realizar uma quantificação mais precisa dos níveis de citocinas produzidos, 2) investigar um painel mais alargado de citocinas ou moléculas efectoras, e 3) avaliar o impacto de citoquinas produzidos por células específicas para o HIV T CD4 em outros subconjuntos de células. Nós estimular CD8 PBMC esgotadas com um HIV-1 Gag conjunto de peptídeos na presença de anticorpos bloqueadores da via imunorregulador de interesse. Após o tempo desejado de incubação, geralmente 48 horas, coletamos os sobrenadantes para medir a secreção de citocinas com matrizes de contas e recolher as pelotas de células, quer para análise fenotípica das diferentes subpopulações de células ou para a análise da transcrição. De nota, em tseu ponto 48 hr tempo, nós não detectar uma população significativa de proliferação de células T ^12. Esta é uma abordagem flexível e várias adaptações deste projeto pode ser aplicado para analisar as diferentes hipóteses. Por exemplo, os subconjuntos de células individuais (tais como as células T CD4 + específicas para o HIV ou DP-1 de células T CD4 elevadas, etc.) Podem ser classificados após 12 horas de incubação, antes de nova incubação durante 36 horas seguida por recolha dos sobrenadantes e peletes de células investigar mais especificamente o impacto das intervenções de bloqueio na secreção de citocinas por subpopulações definidas de PBMC.

Protocolo

1. A exaustão e Isolamento de PBMC através Ficoll Separação

1. Depleção das células T CD8 + por adição de células CD8 + humano Esgotamento cocktail de 50 ul / ml de sangue total.
2. Misturar bem e incubar durante 20 min à temperatura ambiente (18-25 ° C).
3. Depois de incubação, misturam sangue total com HBSS (Solução Salina Equilibrada de Hank sem Ca ^{2 +} ou Mg ^{2 +)} e camada sobre Histopaque. Gire a 340 rcf durante 30 min (sem freio, aceleração lenta).
4. Recolhe PBMC e transferir para um novo cónica 50ml. Lavar 2x com 45 ml de RPMI 1640 suplementado com 50 UI de penicilina, 50 ug / ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, e 1% de HEPES por centrifugação durante 10 min a 340 rcf.

2. Bloqueio de Anticorpos e estimulação antigênica específica das células

1. Ressuspender as células em 2x10 ⁶ por estado em meio RPMI 1640 contendo 10% de soro humano, suplementado com 50 UI de penicilina, 50 ug / ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, e 1% de HEPES,representando 500 ul por condição.
2. Alíquota de 500 ul de suspensão de células por tubo de FACS.
3. Dependendo da via de investigados, adicionar PD-L1, IL-10Rα anticorpos de bloqueio e / ou controlos de isotipo de 10 ug / ml e incubar durante 15 min a 37 ° C, 5% de CO _2.
4. Estimular as células com um conjunto de peptídeos de HIV-1 Gag a 1 ug / ml / péptido concentração final. Também incluem um controle "nenhum estímulo" para cada condição de bloqueio. Incubar a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 48 horas.

3. Coleta e análise de sobrenadante

1. Após 48 horas, girar tubos de FACS para 7 min a 340 rcf.
2. Cuidadosamente recolher 2 x 225 mL de sobrenadante em tubos Eppendorf para Luminex matrizes talão sem perturbar o sedimento.
3. Inactivar vírus no sobrenadante com 25 uL de 0,5% de PBS-Tween para obter uma concentração final de 0,05% de PBS-Tween.
4. Armazene coletadas sobrenadantes que não são immediately utilizado numa -80 ° C congelador.
5. Medir as concentrações de citocinas desejados usando kit Millipore Luminex acordo com o protocolo do fabricante.

4. Coleta e análise fenotípica das células através de Citometria de Fluxo

1. Após recolha do sobrenadante, lavagem de células, em 3 ml de PBS. Gire células por 7 min a 340 rcf e decantar o excesso de lavagem.
2. Mancha para a viabilidade utilizando um Kit Stain celular Morto VIVO / MORTO fixável de acordo com o protocolo do fabricante.
3. Lavar as células em PBS durante 7 min a 340 rcf e a 4 ° C. Ressuspender em 100 ul de PBS, 1% de FBS.
4. Se coloração para monócitos ou outras células apresentadoras de antígenos, receptores Fc bloco adicionando 1,4 mL de reagente de bloqueio e FcR vórtice para misturar.
5. Incubar durante 10 minutos a 4 ° C.
6. Adicionar anticorpos de superfície, vórtice, e incubar durante 20 min a 4 ° C no escuro.
7. Lavar as células com PBS, 1% de FBS, decanta-se o excesso de lavagem, e adiciona-se 200 ul de paraformaldeido a 4%. Incubarà temperatura ambiente durante 20 min no escuro.
8. Lave as células com PBS 1% FBS, ressuspender em 250 mL PBS 1% FBS, e adquirir em uma Multilaser citômetro de fluxo (por exemplo, BD LSRII ou Fortessa).

5. A análise das células por meio de qRT-PCR

1. Para as células não analisados ​​via citometria de fluxo: após a coleta do sobrenadante, as células lisam em 300 mL RLT Qiagen tampão contendo 1% de beta-mercaptoetanol. Se não continuar com o protocolo, as células podem ser congeladas a -80 ° C após este ponto.
2. Isolar ARN utilizando um kit de isolamento de ARN seguindo o protocolo do fabricante.
3. Sintetizar ADNc a partir de ARN usando um kit de síntese de cDNA, seguindo o protocolo do fabricante.
4. Realizar PCR quantitativa utilizando a tecnologia de SYBR Green.
5. Criar uma mistura de iniciadores para cada um dos iniciadores utilizados, incluindo genes de manutenção (por exemplo, IL-13, IL-10, IFN-γ, GAPDH) por adição de iniciadores a nucleases-livre de água para se obter uma concentração final de 10iM. Mantenha no gelo.
6. Criar um master mix para cada primer, adicionando 10,5 mL de água livre de nuclease, 12,5 mL SYBR verde, e 1 ml mistura de iniciadores por placa também. Mantenha no gelo.
7. Pipetar 24 ul de mistura principal em cada poço da placa que vai ser usado.
8. Adicionar 1 mL de cDNA para cada poço de acordo com modelo.
9. Tampe poços e placa de centrifugação por 3 min a 800 rcf.
10. Executar placa em uma máquina de qRT-PCR, por exemplo, um instrumento Stratagene Mx3005P.

6. Adaptação para o intracelular de citocinas Coloração em 48 horas

Adicionar Brefeldina A monensina e 6 horas antes da coloração de citocinas intracelulares. Brefeldina é adicionado a uma concentração de 10 ug / ml, enquanto a monensina é adicionado de acordo com as instruções do fabricante. Por conveniência, Brefeldina pode ser adicionado 12 h antes de manchar a uma concentração de 5 ug / ml.

1. Depois de mancha de superfície, lavar as células com PBS 1% FBS e mancha nocitocinas intracelular, tais como a IL-12, IFN-γ, e TNF-α usando um kit de fixação / Solução permeabilização e protocolo.
2. Lave as células, ressuspender em 250 mL PBS 1% FBS, e executado em um multilaser citômetro de fluxo (por exemplo, BD LSR II ou Fortessa).

7. Adaptação para Classificando Células

1. 16 horas após a estimulação, mancha de viabilidade utilizando Kit Stain celular Morto VIVO / MORTO fixável de acordo com o protocolo do fabricante. Manter as células em gelo durante todo o procedimento.
2. Lavar as células com PBS, durante 7 min a 340 rcf e a 4 ° C. Ressuspender em 100 ul de PBS, 1% de FBS.
3. Adicionar anticorpos de superfície, vortex para misturar e incubar as células em gelo, no escuro, durante 20 min.
4. Lavar as células com PBS, 1% de FBS a 340 rcf e a 4 ° C e ressuspender em 500 ul de meio RPMI 1640 frio contendo 10% de soro fetal bovino, suplementado com 50 UI de penicilina, 50 ug / ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, e 1% HEPES.
5. Células do filtro com 5 ml poliestirenorene tubo de fundo redondo com tampa de Cell-filtro.
6. Preparar os tubos de recolha para classificar por adição de 200 ul de meio RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal bovino, suplementado com 50 UI de penicilina, 50 ug / ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, e 1% de HEPES a cada tubo. Mantenha todos os tubos em gelo durante a classificação.
7. Vivo classificar os subconjuntos de células de interesse em um instrumento (por exemplo, BD FACS Aria II), localizado em uma instalação equipada para material de risco biológico.
8. Após as células foram classificadas, as células lugar de volta na incubadora por período de tempo desejado e seguir com a análise coleção sobrenadante / Luminex e análise coleção pellet celular / PCR.

Resultados

Para as medições de citocinas utilizando este sistema in vitro, é essencial ser capaz de distinguir as respostas específicas de antigénio, em comparação com o controlo sem estimulação. De uma maneira geral, considerou-se respostas positivas como os valores da estimulação antigénica que dão aumento de, pelo menos, três vezes nos níveis de citocinas em comparação com o controlo sem estimulação e que estavam dentro do intervalo linear do ensaio. Estamos usando alta sensibilidade ensaios matriz talão que podem dete...

Discussão

Coleção sobrenadante é uma parte fundamental deste projeto experimental. Quando a colher os sobrenadantes para o ensaio de Luminex, as alíquotas foram feitos e mantidos a -80 ° C para evitar a degradação das proteínas devido a ciclos de congelação-descongelação. Congelamento e descongelamento pode ser processos duras para proteínas e minimizando congelar-degelo, o sinal será maximizado em ensaios. Portanto, é mais fácil obter dados repetitivo e mais precisa quando se trabalha a partir de aliquotas que foram congelamento...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Hanks Solução salina balanceada sem Ca2+ ou Mg2+	Sigma	H9394
RPMI 1640	Sigma	R0883
Histopaque-1077	Sigma	10771
Soro Humano AB	Gemini BioProducts	100-512
Penicilina/Estreptomicina	Mediatech	30 001 CI
L-glutamina	Mediatech	25 005 CI
HEPES tampão	Mediatech	25060CI
FcR reagente de bloqueio, humano	Miltenyi	130-059-901
RosetteSep Humano CD8 + Depleção Coquetel	Célula-Tronco	15663
VIVO / MORTO Kit de Coloração de Células Mortas Corrigíveis, para excitação UV	Invitrogen	L23105
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Improm-II Sistema de Transcrição Reversa	Promega	A3800
Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix	Agilent	600830
BD Cytofix/Cytoperm Kit de Solução de Fixação/Permeabilização	BD	554714
Tween-20	Fisher	BP337100
IFN-γ primer	Invitrogen		PARA: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA
GAPDH primer	Invitrogen		PARA: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG