A ligação covalente de BMP-2 em superfícies com uma monocamada auto-montada Abordagem

Resumo

Descreve-se um método para realizar a imobilização eficiente de BMP-2 em superfícies. A nossa abordagem é baseada na formação de uma monocamada auto-montada para alcançar a ligação da BMP-2 por meio dos seus resíduos de amina livres covalente. Este método é uma ferramenta útil para o estudo de sinalização na membrana celular.

Resumo

A proteína morfogenética óssea 2 (BMP-2) é um factor de crescimento incorporados na matriz extracelular do tecido ósseo. BMP-2 atua como gatilho da diferenciação de células mesenquimais em osteoblastos, estimulando, assim, a cura e formação de osso novo. O uso clínico de humano recombinante BMP-2 (rhBMP-2) em conjunto com andaimes suscitou controvérsias recentes, com base no modo de apresentação e a quantidade a ser entregue. O protocolo aqui apresentado fornece um meio simples e eficaz para entregar a BMP-2 para os estudos in vitro em células. Descrevemos como para formar uma monocamada auto-montada que consiste num ligante heterobifuncional, e mostram o passo de ligação posterior para obter a imobilização covalente de rhBMP-2. Com esta abordagem, é possível conseguir uma apresentação sustentada de BMP-2, enquanto que a manutenção da actividade biológica da proteína. Na verdade, a superfície de imobilização de BMP-2 permite investigações orientadas, impedindo anúncios inespecíficasorption, enquanto reduz a quantidade de factor de crescimento e, mais notavelmente, dificultando a libertação não controlada da superfície. Ambos os eventos de sinalização de curto e longo prazo são desencadeadas por BMP-2 está a ter lugar quando as células são expostas a superfícies que apresentam covalentemente imobilizada a rhBMP-2, tornando esta abordagem adequada para estudos in vitro sobre as respostas celulares a BMP-2 de estimulação.

Introdução

A proteína morfogenética óssea 2 (BMP-2) é um membro do factor de crescimento transformante (TGF-β) familiar e actua como indutor da formação de novo osso, bem como regulador de vários tecidos durante o desenvolvimento embrionário e adulto homeostase ^1-3. Cada monómero do biologicamente activo homodimérica proteína BMP-2 contém um motivo "nó de cisteína", que é altamente conservada em todos os ^quatro BMPs. Seis dos sete resíduos de cisteína que formam ligações dissulfureto intramoleculares que estabilizam cada monómero, enquanto a sétima cisteína está envolvido na dimerização, formando uma ligação intramolecular entre os dois monómeros de ^5,6. Este nó de cisteína altamente conservado define a estrutura tridimensional da proteína BMP-2 e determina as suas propriedades únicas, tais como a resistência ao calor, desnaturantes e ácida de pH ^7-9. BMP-2 liga-se a serina / treonina-quinase de receptores transmembranares, induzindo deste modo a transdução de sinal ^{10-12. Dependendo do modo de oligomerização do receptor, diferentes vias de sinalização são activados: uma cascata de sinalização Smad-independente leva a indução de fosfatase alcalina através de sinalização de p38, enquanto que uma via dependente de Smad activado pelos resultados da fosforilação do receptor no complexo de Smad translocação nuclear e activação da transcrição de genes-alvo específicos, tais como o inibidor da diferenciação (Id), 12-14.}

No osso, a BMP-2 induz a diferenciação de células estaminais mesenquimais em osteoblastos, estimulando, assim, a cicatrização e formação de novo de osso. Actualmente, expressa de forma recombinante BMP-2 é aplicada clinicamente para melhorar a cicatrização de sítios fracturados. Uma estratégia comum na engenharia de tecido ósseo é a utilização de factores de crescimento injectáveis, que é menos invasiva em relação aos sistemas de distribuição local. No entanto, estudos in vivo e aplicações clínicas têm demonstrado que a sua meia-vida biológica curta, loc inespecíficazação e rápida de domiciliação de BMP-2 pode levar a vários problemas locais, ectópica e sistêmicas ^15. Assim, para obter uma apresentação eficaz, o aprisionamento ou imobilização de BMP-2 no interior de ou sobre materiais é necessário para o seu local de entrega e mantida no local alvo. Entrega sustentada pode ser conseguida com métodos de retenção não covalentes, tais como a retenção física, adsorção ou complexação de iões ^16. No entanto, sabe-se que a adsorção não específica de proteínas para as superfícies podem resulta em desnaturação das moléculas de ^17. Para a ligação de fatores de crescimento covalente, diferentes tipos de suportes foram desenvolvidos ao longo da última década. A utilização de moléculas de ligação bifuncionais, que se destinam a grupos amino ou carboxilo da proteína, por exemplo, é um tipo de abordagem que não requer, necessariamente, a modificação de proteínas para alcançar a sua imobilização. De facto, enquanto que a modificação de proteínas oferece a vantagem de controlar a orientação da proteína,a introdução dos domínios artificiais, as etiquetas e cadeias peptídicas específicas do local pode alterar a actividade biológica dos factores de crescimento ^17. Assim, para contornar a desnaturação devido à interacção com o material de apoio, as superfícies podem ser previamente funcionalizados, por exemplo, com uma monocamada auto-montada (SAM) de uma molécula de ligação, seguido de acoplamento do fator desejado ^18. Usámos uma abordagem baseada no SAM para imobilizar covalentemente BMP-2 para uma superfície de direccionamento dos seus resíduos de amina livre e têm mostrado que a proteína imobilizada retém a sua actividade biológica tanto a curto e longo prazo ^19. Este protocolo fornece uma maneira simples e eficiente para entregar BMP-2 em células para estudos in vitro sobre os mecanismos que ocorrem na membrana celular e regulam a sinalização intracelular responsável pela sinalização osteogênica.

Protocolo

1. Síntese de 11-Mercaptoundecanoyl-N-hidroxissuccinimida (NHS-MU)

1. Adicionar gota a gota uma solução de 500 mg de N-hidroxissuccinimida e 30 mg de 4 - (dimetilamino) piridina em 10 ml de acetona (aa) a 1 g de ácido 11-mercaptoundecanóico em 40 ml de diclorometano (aa), à temperatura ambiente (RT).
2. Arrefecer a reacção até 0 ° C e adicionar gota a gota 1,1 g de N, N '-diciclohexilcarbodiimida em 10 ml de diclorometano (sob atmosfera de azoto). Manter a reacção a baixa temperatura durante 1 hora e, em seguida, agita-se à TA durante a noite.
3. Filtrar o precipitado e secá-lo, sob pressão reduzida. Purifica-se o produto por cromatografia flash com o benzeno de petróleo e acetato de etilo (aa) em uma proporção de 1:1.

2. Preparação de Layers Ouro Homogêneos

1. Lamelas de vidro limpos com toalhetes de precisão e sonicar las durante 5 minutos em uma solução contendo uma mistura de 1:1 de acetato de etilo (pa) e metanol (pa). Rinse substratos com metanol e secar sob fluxo de nitrogênio.
2. Colocar os substratos limpos no dispositivo de revestimento por pulverização. Evacuar a câmara. Retirar a camada de óxido de cromo superior da meta de cromo por pulverização catódica para 60 seg. Coloque as amostras debaixo da viga e revesti-los com uma camada de crómio de 10 nm, seguido por revestimento com uma camada de ouro de 40 nm de metal.

3. Imobilização de superfície de BMP-2

1. Dissolve-MU-NHS em N, N-dimethlyformamide (DMF) a uma concentração final de cerca de 1 mM e incubar substratos de ouro na solução de MU-NHS à TA durante 4 h sob atmosfera de azoto.
2. Sonicar superfícies em DMF durante 2 minutos, enxaguar com DMF e MeOH e secar sob fluxo de azoto.
3. Prepara-se uma solução estoque de rhBMP-2 em HCl 4 mM estéril com uma concentração de 100 ug / ml (de loja alíquotas a -80 ° C). Para diluições de trabalho (3,5 ug / ml), dilui-se a solução de reserva em PBS / NaCl (PBS contendo 1 M de NaCl) e umdjust para pH 8,5, imediatamente antes de usar.
4. Incubar superfícies funcionalizadas MU-NHS na solução de trabalho de rhBMP-2, a 4 ° C durante a noite. Retirar o sobrenadante da incubação. Sonicar superfícies em PBS / NaCl durante 2 min e lavagem 3 x com PBS estéril / NaCl.

4. Superfície Caracterização

1. Para bloquear a adsorção inespecífica do anticorpo, incubar as superfícies com BSA 5% (w / v) em solução de PBS durante 1 hora à temperatura ambiente, seguido por incubação com um anticorpo anti-BMP-2 do anticorpo (a 1:100 em 1% (w / v ) solução de BSA / PBS) durante 1 hora à temperatura ambiente. Lave as superfícies duas vezes com PBS e sonicado por 30 seg.
2. Incubar substratos com anticorpo secundário conjugado com HRP (1:1000 em 1% (w v) / solução de BSA / PBS) durante 30 min à temperatura ambiente, em seguida, lavar duas vezes com PBS.
3. Use Ampliflu ensaio Vermelho para medir a atividade enzimática HRP a 570 nm com um leitor de placas.

5. Análise da atividade biológica

1. Semente 1 x 10 ⁵ rato mioblastos C2C12 por poço em 6-bem plmados em meio de crescimento, que consiste em um DMEM de glicose elevada contendo piruvato suplementado com 10% FBS, 1% de penicilina / estreptomicina e incubar durante 24 horas a 37 ° C / 5% de CO _2.
2. Starve células em DMEM isento de soro durante 3-5 horas antes da semeadura sobre as superfícies decoradas com imobilizada BMP-2.
3. Para efeitos de investigação da indução de sinalização de curto prazo, substituir o meio por 200 ul de DMEM fresco isento de soro e colocar os imobilizadas BMP-2 superfícies superiores das células. A superfície deve ser tratado com pinças de ponta fina para evitar arranhões.
4. Remova suavemente superfícies e aspirar o meio com uma pipeta, lavar as células duas vezes com PBS. Continuar a análise das respostas das células.
5. Para a análise da actividade biológica de longo prazo, de células de placa sobre as superfícies e cultura los a 37 ° C / 5% de CO ₂ em condições de soro baixo (2% de FBS) durante seis dias.

Resultados

Em nossa configuração, o ouro foi escolhido como excipiente, uma vez que fornece um sistema biologicamente inespecífica, mas quimicamente ajustável. Além disso, a aplicação de camadas auto-montagem implica muitas vantagens: SAM adsorver espontaneamente através dos seus grupos "cabeça-" sobre metais e monocamadas de formulário com poucos defeitos, enquanto os grupos terminais funcionais pode ser modificado. Assim, eles proporcionam uma plataforma para adaptar as propriedades da interface de um modo ainda altamente adaptá...

Discussão

Neste protocolo, descrevem a preparação de superfícies funcionalizadas com bioactivo rhBMP-2. Esta abordagem compreende dois passos: 1) a formação inicial de uma monocamada auto-montagem (SAM) de um ligante bifuncional sobre a superfície de ouro, 2) de imobilização covalente da proteína de rhBMP-2. Em trabalhos anteriores, que validou a ligação efectiva do ligante bifuncional e o factor de crescimento, e demonstraram que a superfície imobilizada-rhBMP-2 mantém a sua actividade biológica ^19. A bioactividade de...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
N-hidroxisuccinimida	Sigma-Aldrich	130672
4-(dimetilamino)piridina	Sigma-Aldrich	522805
Acetona	AplicaçãoChem	A2282
Ácido 11-mercaptoundecanóico	Sigma-Aldrich	674427
Diclormetano	Merck	106050
N,N'-diciclohexilcarbodiimida	Sigma-Aldrich	D80002
Benzeno de petróleo	Merck
Lamínulas de vidro	Carl Roth	M 875
Ethylacetate	AppliChem	A3550
Metanol	Carl Roth	4627
N,N-dimetilformamida	Carl Roth	T921
rhBMP-2	R& D Systems	355-BM	Sem transportador; expresso em E.coli
PBS	PAA	H15-002
NaCl	Carl Roth	HN00.2
Poli(dimetil siloxano) (PDMS)	Dow Corning
Kit de elastômero de silicone Sylgard 184	Dow Corning
Anti-rhBMP-2	Sigma	B9553
Anticorpo secundário anti-camundongo de cabra IgG-HRP	Santa Cruz	sc-2005
Ampliflu Red ensaio	Sigma	90101
Meio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco (1x), líquido	Gibco	41966	Soro
Fetal Bovino de Alta Glicose (FBS)	Sigma	F7524	Filtrado estéril, testado em cultura de células
Pen/Strep	Gibco	15140
Tripsina 0,05% (1x) com EDTA 4Na	Gibco	25300
Glicina (0,1 M)	Riedel-de-Haë n	33226
IGEPAL CA-630 (1%)	Sigma	I8896	Tampão de lise (ensaio ALP)19
Cloreto de magnésio (MgCl2)(1 mM)	Carl Roth	HNO3.2
Cloreto de zinco (ZnCl2) (1 mM)	Carl Roth	3533.1
p-nitrofenilfosfato (pNPP)	Sigma	S0942	Substrato de fosfatase
Anti-misina cadeia pesada (MHC)	Estudos de desenvolvimento Banco de hibridoma, Universidade de Iowa	MF20	Anticorpo monoclonal
Alexa Fluor 488 IgG anti-camundongo de cabra	Invitrogen	A11001
DAPI	Sigma	D9542
Equipamento
Banho Ultrsonic (Sonorex Super RK 102H), Frequência 35 kHz	BANDELIN electronic GmbH Co. KG
MED 020 Sistema de revestimento por pulverização catódica	BAL-TEC AG		Condições de revestimento Cr: 120 mA, 1,3 x 10-2 mbar, 30 sec Au: 60 mA, 5,0 x 10-2 mbar, 45 seg
Leitor de placas Tecan Infinite M200	Tecan