Enriquecimento e purgação de células-tronco embrionárias humanas pela detecção de antígenos da superfície celular usando os anticorpos monoclonais TG30 e GCTM-2

Resumo

Descrevemos o uso dos anticorpos monoclonais TG30 (CD9) e GCTM-2 para a detecção combinada de antígenos da superfície celular via fluorescência ativada de classificação celular (FACS) para a identificação e enriquecimento de células-tronco embrionárias humanas vivas (hESC) utilizando seleção positiva e também o uso de seleção negativa para expurgar hESCs de uma população de células mistas.

Resumo

As células-tronco embrionárias humanas (hESC) podem se auto-renovar indefinidamente in vitro, e com as pistas apropriadas podem ser induzidas a se diferenciar em potencialmente todas as linhagens celulares somáticas. Derivados diferenciados do HESC podem potencialmente ser usados em terapias de transplante para tratar uma variedade de doenças degenerativas celulares. No entanto, os protocolos de diferenciação do HESC geralmente produzem uma mistura de tipos de células de alvo e fora do alvo diferenciadas, bem como células residuais indiferenciadas. Para a tradução de derivados diferenciados do laboratório para a clínica, é importante ser capaz de discriminar entre células indiferenciadas (pluripotentes) e diferenciadas, e gerar métodos para separar essas populações. A aplicação segura de tipos de células somáticas derivadas do HESC só pode ser realizada com populações pluripotentes livres de células-tronco, uma vez que os hESCs residuais poderiam induzir tumores conhecidos como teratomas após o transplante. Para isso, descrevemos aqui uma metodologia para detectar antígenos de superfície celular associada à pluripotência com os anticorpos monoclonais TG30 (CD9) e GCTM-2 via fluorescência ativada de classificação celular (FACS) para a identificação de TG30^Hi-GCTM-2^{Hi hESCs} por meio de seleção positiva. Utilizando a seleção negativa com nossa metodologia TG30/GCTM-2 FACS, conseguimos detectar e purgar hESCs indiferenciados em populações em estágio inicial (TG30^Neg-GCTM-2^Neg). Em um estudo posterior, amostras pluripotentes livres de células-tronco de células TG30^Negdiferenciadas TG30-2^Neg selecionadas usando nosso protocolo TG30/GCTM-2 FACS não formaram teratomas uma vez transplantadas em camundongos imunocompreendidos, apoiando a robustez do nosso protocolo. Por outro lado, a passagem consecutiva mediada por TG30/GCTM-2 FACS de pluripotente enriquecido TG30^Hi-GCTM-2^Hi hESCs não afetou sua capacidade de auto-renovar in vitro ou sua pluripotência intrínseca. Portanto, as características da nossa metodologia TG30/GCTM-2 FACS fornecem um ensaio sensível para obter populações altamente enriquecidas de hPSC como insumos para ensaios de diferenciação e para livrar potencialmente tumorigênico (ou residual) hESC de populações de células derivadas.

Introdução

O HPSC (hPSC) inclui células-tronco embrionárias humanas (hESC) e células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hIPSC). O HPSC pode se auto-renovar indefinidamente em condições culturais apropriadas sem perder sua capacidade conhecida como "pluripotência". A pluripotência é definida como o potencial para uma célula se diferenciar em essencialmente qualquer linhagem celular somática, incluindo células representativas de cada uma das três camadas de células germinativas embrionárias. O notável potencial do hPSC fornece um meio para uma grande variedade de aplicações baseadas em células, incluindo opções terapêuticas. Por exemplo, há distúrbios envolvendo morte celular e degeneração, onde a funcionalidade normal das células no corpo humano está comprometida, como na insuficiência cardíaca, lesões na coluna vertebral, diabetes, doença de Parkinson, alguns cânceres e outras patologias clínicas. Pacientes que sofrem dessas condições poderiam potencialmente ser tratados transplantando células somáticas saudáveis e funcionais que foram derivadas do HPSC em laboratório. No entanto, os protocolos atuais de diferenciação do HPSC não são 100% eficientes e produzem uma mistura de tipos de células de alvo e fora do alvo diferenciados, bem como hPSCs residuais que não sofreram diferenciação, em vez de continuar a se auto-renovar^1-3. A presença de até mesmo um pequeno número de hPSC em uma amostra de células somáticas derivadas do HPSC destinadas ao transplante em pacientes constitui um sério risco clínico, pois essas células por sua natureza inerente à formação de tecidos das três camadas de germes embrionários, poderiam potencialmente formar in vivo um tipo de tumor conhecido como teratoma. Portanto, apenas populações de células-alvo determinadas a estar livres de células-tronco pluripotentes podem ser consideradas seguras para o transplante em pacientes. Existem várias abordagens relatadas para potencialmente realizar a eliminação de hPSCs residuais após a diferenciação, (para revisão ver Polanco e Laslett⁴). Já relatamos anteriormente o uso dos anticorpos monoclonais TG30 (CD9) e GCTM-2 acoplados à fluorescência de células ativadas (FACS) para identificar células-tronco pluripotentes e discriminá-las de células em estágio inicial de diferenciação em culturas das linhas^5-7do HESC .

Uma vantagem do uso de anticorpos para detectar antígenos da superfície celular é que as células-alvo são geralmente viáveis após a ligação de anticorpos e/ou rotulagem. Portanto, as células-alvo podem ser coletadas após a rotulagem de anticorpos e reculturadas para expansão e outras aplicações antes do transplante. Uma ressalva para os antígenos da superfície celular expressos no hPSC é que eles não são exclusivos do estágio pluripotente e são, em muitos casos, re-expressos temporalmente durante o desenvolvimento e, portanto, serão detectados em alguns tipos de células diferenciadas. Portanto, se o objetivo é usar anticorpos para detectar células pluripotentes humanas e purgá-las de uma amostra de células derivadas do HPSC, anticorpos selecionados também não devem reagir com antígenos nos tipos de células diferenciadas específicas destinados ao transplante. Infelizmente, há um número limitado de anticorpos que detectam marcadores de superfície celular em hPSCs ⁴ao vivo, tornando limitadas as opções de seleção. Além disso, alguns estudos apontaram que a detecção de um único marcador de superfície celular não é suficiente para eliminar todos os hPSC, sugerindo que qualquer tentativa de eliminar todas as subpopulações pluripotentes hPSC deve depender de métodos que usam dois ou mais anticorpos detectando diferentes epítopos expressos pelos hPSCs ^9-10. Como mencionado acima, apenas células derivadas do HPSC que poderiam ser determinadas como populações de células-tronco pluripotentes são apropriadas para transplante humano. Alcançar esse nível de stringency pode não ser alcançado com uma única passagem através de uma tecnologia de triagem celular mediada por anticorpos. A recultura da população enriquecida de células-alvo diferenciadas e rodadas subsequentes de classificação celular podem ser necessárias para obter definitivamente amostras pluripotentes livres de células-tronco.

Em nosso laboratório, caracterizamos extensivamente dois anticorpos de superfície celular hES, TG30 (CD9) e GCTM-2, para a detecção de células pluripotentes vivas. Nossos estudos mostraram que a detecção combinada de ambos os TG30 e GCTM-2 se correlaciona fortemente com a expressão de genes associados à pluripotência canônica nas linhas ^5-7do HESC . O imunoprofilamento TG30/GCTM-2 FACS mostrou consistentemente que as culturas hESC constituem um gradiente contínuo quantitativo da expressão TG30/GCTM-2 ^5-7. Estabelecemos arbitrariamente quatro populações (P) de células dentro deste gradiente TG30/GCTM-2: P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low),P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid) e P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) ^5-7. Nossa caracterização dessas populações de células P4, P5, P6 e P7 mostrou que as subfrações P6 e P7 expressam um grande número de genes associados à pluripotência e formam eficientemente colônias semelhantes a troncos quando reculturadas pós-FACS ^2-3. Por outro lado, as células P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) expressam um grande número de marcadores de diferenciação e constituem os tipos celulares espontaneamente diferenciados que normalmente ocorrem na expansão das culturas das linhas ^5-6do HESC . Decidimos testar a potencialidade de nossos TG30/GCTM-2 FACS para a eliminação seletiva de hPSCs residuais após a diferenciação em estágio inicial, e também para o enriquecimento de populações pluripotentes de células-tronco. O protocolo descrito abaixo mostra como coletar e recultura diferenciadas células P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) pós-FACS para realizar a purgação de P7 pluripotente (TG30^Hi-GCTM-2^Hi). Além disso, explicamos também a coleta e a recultura das células P7 pluripotentes (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)para obter uma cultura enriquecida de células pluripotentes, que poderiam ser posteriormente utilizadas como uma população de insumos definida para potencialmente aumentar a eficiência e consistência dos ensaios de diferenciação.

Protocolo

O protocolo a seguir foi realizado utilizando culturas a granel padrão hESC-MEL1¹¹ fornecidas pela instalação StemCore na Universidade Monash (Melbourne). Esta linha celular é rotineiramente cultivada em uma camada de fibroblastos embrionários de camundongos mitoticamente inativados (MEFs) em bFGF complementado hESC/KOSR media⁷ e é mantida com dissociação enzimática (Colagenase) cada 5-7 dias⁸. as culturas hESC cresceram para ~80% de confluência em frascos de 75 cm² (T75) são usados como populações de entrada para este protocolo. Todos os procedimentos de manipulação celular descritos abaixo devem ser realizados em condições assépticas em um gabinete de biosegurança classe II filtrado pelo HEPA.

Dois dias antes de realizar um ensaio TG30/GCTM-2 FACS, prepare as placas de cultura T75 (descritas na seção 1) que devem ser usadas para a recultura de células recuperadas pós-FACS (descritas na seção 4).

1. Semeadura de MEFs e Preparação de MeioS Condicionados por MEF

1.1 DIA -2: Chapeamento de MEFs em frascos T75

1. Pipeta 10 ml de gelatina de 0,1% w/v em cada frasco T75 e inclinação para cobrir a superfície uniformemente.
2. Incubar por 30 minutos à temperatura ambiente em um armário de biossegurança.
3. Solução de gelatina aspirada.
4. Adicione 20 ml MEF-médio ao frasco e pré-equilibre a 37 °C/5% de CO₂ por 30 min em uma incubadora de cultura celular.
5. Placa mitoticamente inativada MEFs em frascos preparados nas seguintes densidades. Para 1/3 sementes de densidade MEF 1,4 x 10⁴ células/cm² (T75= 1 x 10⁶ MEFs). Para sementes MEF de densidade total 5,3 x 10⁴ células/cm² (T75 = 4 x 10⁶ MEFs).

Nota: Usamos rotineiramente MEFs que foram mitoticamente inativados por γ-irradiação. Um protocolo de preparação de MEFs irradiados γ pode ser encontrado em Michalska¹².

6. Incubar culturas MEF irradiadas a 37 °C/5% DE CO₂ durante a noite. Os frascos de 1/3 podem ser incubados por 1-4 dias sem alteração mef-média. Estes frascos são usados para replacar células pós-FACS (como no protocolo 4). Frascos MEF completos são incubados durante a noite para gerar CM de acordo com a etapa 1.2.

1.2 DIA -1: Preparação do meio condicionado ao MEF (CM)

1. Aspirar MEF-médio de frascos T75 full-MEF.
2. Adicione um meio pré-equilibrado de 25 ml hESC/KOSR suplementado com 5 ng/ml humano FGF-2 por frasco T75. Incubar a 37 °C/5% de CO₂ por 24 horas.
3. Colete o meio mef (CM) em um tubo de cultura tecidual estéril, complemente recentemente CM com 10 ng/ml humano FGF-2 e filtro usando um filtro de polietroésulfone de 0,22 μm.
4. Para produzir CM adicional, repita as etapas 1.2.2 e 1.2.3 diárias sobre a mesma cultura MEF por uma semana.

No dia da realização de um ensaio TG30/GCTM-2, substitua o mef-médio em frascos MEF T75 de 1/3 MEF com CM e pré-equilíbrio por pelo menos 30 minutos antes da semeadura de quaisquer células hESC ou derivados de hESC recuperadas do procedimento conforme descrito abaixo. Cm é usado fresco ou armazenado a 4 °C por até 2 semanas. Cm é usado neste protocolo, pois em nossas mãos aumenta a viabilidade das células pós-FACS em comparação com a mídia não-condicionada (resultados não mostrados).

2. Executando um ensaio TG30/GCTM-2 FACS: Dissociação de culturas a granel hESC em células únicas

Nota: Prechill 20% FBS/DMEM-F12 médio a 4 °C.

1. Aspire a mídia hESC/KOSR de dois frascos T75 com uma linha hESC cultivada.
2. Enxágüe as células em cada T75 com DPBS de 10 ml e aspire para remover.
3. Adicione 3 ml solução de dissociação Do TrypLE Express em cada frasco T75. Incubar a 37 °C/5% de CO₂ por 5 min.
4. Bata o lado dos frascos para obter o desalojamento completo das células. Verifique em microscópio. Se as células não se desalojarem facilmente, incubar por mais 2-3 min a 37 °C/5% de CO₂.
5. Adicione 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (mantido a 4 °C) a cada frasco T75. Usando uma pipeta estéril de 10 ml, triturar suavemente as células dissociadas várias vezes contra a parede do frasco para obter uma suspensão celular predominantemente única.
6. Coloque um coador de células de 70 μm em um tubo de polipropileno estéril de 50 ml. Use uma pipeta estéril de 10 ml para forçar as suspensões de célula única hESC agrupadas dos dois frascos T75 através do coador.
7. Descarte o coador de células, substitua a tampa do tubo e centrífugue a suspensão hESC agrupada a 1.000 x g por 2 min.
8. Descarte o supernascimento e lave as células reutilizando suavemente a pelota em 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (pré-4 °C).
9. Realize uma segunda centrifugação a 1.000 x g por 2 min.
10. Descarte o supernaente, adicione 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (prechilled a 4 °C) e triturar suavemente para células resusgaspend. Coloque o tubo de 50 ml no gelo. Este tubo será usado para o procedimento de imunossuagem da Amostra de Classificação descrito abaixo.
11. Tome 20 μl da suspensão de célula única hESC (etapa 2.10) para contagem de números de celular usando um hemotocitómetro. Você deve esperar um rendimento de 10-15 milhões de células por frasco T75.

Nota: O FBS é usado nesta parte do protocolo para aumentar a viabilidade celular pós-FACS.

3. Coloração imunofluorescente dos antígenos de superfície celular TG30 e GCTM-2

1. Alíquota de 150 μl (~100.000 células) de uma suspensão celular única hESC (a partir da etapa 2.11) em cada um dos seis tubos de microcentrifuuge de 1,5 ml. Estes seis alíquotas serão utilizados para os controles de coloração necessários para calibrar o ensaio na máquina FACS. A suspensão celular restante de ~9 ml será a amostra de classificação na qual a cultura dissociada será co-detida para detecção de TG30 e GCTM-2, de acordo com as Tabelas 1 e 2.
2. Realize reações vinculantes de anticorpos primários em 20% FBS/DMEM-F12. Os volumes finais de reação devem ser ~9 ml para a Amostra de Classificação e 200 μl para os controles. Inclua controles isótipos como anticorpos primários. Coloque os tubos horizontalmente no gelo e misture suavemente por 30 minutos em uma plataforma de balanço.
3. Centrífuga reações primárias de anticorpos a 1.000 x g por 2 min.
4. Descarte o supernascimento e lave as células reutilizando a pelota em 20 ml 20% FBS/DMEM-F12 (pré-4 °C) para a Amostra de Classificação e 200 μl para os controles.
5. Faça uma segunda rodada a 1.000 x g por 2 min.
6. Realize reações vinculantes de anticorpos secundários em 20% FBS/DMEM-F12. Os volumes finais de reação devem ser de 2,5 ml para a Amostra de Classificação e 200 μl para os controles. Prepare o tubo de reação PE-anti-mouse CD90.2 nesta fase. Coloque os tubos horizontalmente no gelo e misture suavemente por 30 minutos em uma plataforma de balanço.

Nota: Durante este tempo de incubação, é conveniente coletar CM e preparar frascos 1/3 MEF T75 com CM como na seção 1.2.

7. Centrífuga reações secundárias de anticorpos a 1.000 x g por 2 min.
8. Descarte o supernascimento e lave as células DUAS VEZES, reutilizando a pelota em 20 ml 20% FBS/DMEM-F12 (pré-4 °C) para a Amostra de Classificação e 200 μl para os controles.
9. Faça uma rotação a 1.000 x g por 2 minutos após cada lavagem e coloque tubos no gelo.
10. Descarte supernacantes e pelotas de células resuspend em 20% FBS/DMEM-F12 suplementados com iodeto de propídio (PI) a 0,3 μg/ml. Use 2-3 ml para a Amostra de Classificação e 300 μl para os controles.

Nota: NÃO adicione PI ao tubo de controle com células não manchadas.

11. Use uma micropipette P1000 para forçar cada suspensão celular individual através de um coador de células de tampa de 35 μm, acoplado a tubos de poliestireno de 5 ml.
12. Centrífuga a 50 g/min para forçar através da suspensão de células residuais nas tampas do coador.
13. Resuspenda cada suspensão celular tocando as laterais dos tubos e coloque no gelo. Suas células estão prontas para o FACS. Por favor, prossiga imediatamente.

4. Cultura pós-FACS de células de subfração TG30/GCTM-2 em frascos de 75 cm² (T75)

1. Já reportamos anteriormente como configurar uma máquina FACS para imunoprofilamento TG30/GCTM-2⁷. O procedimento permite a recuperação de hESCs únicos viáveis, livres de MEFs, e dentro dos portões de P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low),P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid) e P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) - ver Figura 1E. Configure a máquina FACS para TG30/GCTM-2 FACS como em nosso relatório anterior para recuperar as subfrações de células a serem usadas em seguida.
2. Adicione 1 ml CM, preparado como na etapa 1.2, a cada um dos dois tubos de teste de fundo redondo de poliestireno de 5 ml antes de coletar células da máquina FACS. Coloque no gelo.
3. Recupere 400.000 células cada uma das subfrações celulares P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)e pluripotente P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) subfrações de células usando TG30/GCTM-2 FACS.
4. Centrifugar os tubos de coleta a 1.000 x g por 5 min.
5. Aspire os supernantes. Adicione 1 ml pré-acolibrado 37 °C/5% CO₂ CM para resuspensar cada pelotização celular usando um micropipetador P1000. Semente as células para cada fração em um frasco pré-equilibrado 1/3 MEF T75 com CM (preparado conforme o passo 1.2)
6. Cultura a 37 °C/5% DE CO₂ por 24 horas em uma incubadora de cultura celular.
7. Aspirar CM diariamente e substituir por CM recém-preparado (como na etapa 1.2) por aproximadamente duas semanas. Culturas de células pluripotentes P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) mostram colônias humanas semelhantes a troncos após uma semana e atingem ~80% de confluência em 9-11 dias. Culturas de células P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) crescem principalmente como um gramado de células semelhantes a fibroblastos que atingem a confluência em 11-13 dias. Nesta fase, se necessário, as culturas celulares P4 e P7 podem ser usadas para a recultura consecutiva mediada pelo TG30/GCTM-2 FACS das subfrações P4 ou P7 (Ver Figuras 2 e 3).

Resultados

hESC-derivados que são pluripotentes sem células-tronco podem ser obtidos pela passagem consecutiva de células da subfração P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg).

Relatórios anteriores estabeleceram que nas culturas padrão hESC uma mistura de subpopulações coexistem exibindo um gradiente de expressão de genes associados à pluripotência^5,6,13. A detecção combinada de antígenos da superfície celular como TG30 (CD9) e GCTM-2 permite a discriminação de uma série de subconjuntos de células no estágio pluripotente e em vários estágios de diferenciação inicial, como indicado por sua expressão de marcadores de células-tronco e fatores de transcrição específicos de linhagem^5,6,13. De acordo com relatórios anteriores, conseguimos discriminar as células P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low),P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid)e P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) na linha hESC-MEL1 utilizada para este estudo (Figura 1). Com este resultado, passamos a coletar células P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) e células P7 pluripotentes (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) para posterior cultura em estudos descritos abaixo.

Investigamos se, usando uma abordagem de seleção negativa, poderíamos expurgar hESCs indiferenciados de populações celulares submetidas a uma diferenciação muito inicial (TG30^Neg-GCTM-2^Neg). Utilizamos um número definido de células P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) que foram consecutivamente cultivadas pós-FACS(Figura 2A) por aproximadamente duas semanas, e reanalisada usando TG30/GCTM-2 FACS antes de replacar em cada passagem. Os resultados mostraram que a subfração P4 enriqueceu para os tipos de células diferenciadas TG30^Neg-GCTM-2^Neg após a passagem consecutiva, e uma pequena presença de células P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) na passagem inicial(Figura 2A, Passagem 1) eventualmente desapareceram após novas passagens, tornando-se amostras pluripotentes sem células-tronco(Figura 2A, Passagem 3).

O enriquecimento de células hESC pluripotentes pode ser alcançado através da coleta de células TG30^Hi-GCTM-2^Hi cells.

Com base em observações anteriores usando este ensaio, esperaríamos um enriquecimento de hESCs pluripotentes coletando células P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) que devem formar colônias hESC. Por isso, também investigamos células TG30/GCTM-2 FACS mediadas por células P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi). Nestas culturas P7, o imunoprofilamento TG30/GCTM-2 FACS foi realizado antes de replacar células em cada passagem e apenas células P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) foram reculturadas. Dessa forma, observou-se que a maioria das células estava localizada nas subfrações associadas à pluripotência (P6 e P7), indicando um enriquecimento de células pluripotentes que também mantinham capacidade de diferenciar e gerar uma pequena porcentagem das células P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)(Figura 3A). Além disso, as culturas das células P7 apresentaram um grande número de colônias semelhantes ao HESC durante a passagem (Figura 3B),indicando também a manutenção do estado pluripotência.

Figura 1. Estratégia de classificação representativa para obter subfrações TG30/GCTM-2 FACS. (A): As suspensões de células hES dissociadas são classificadas como células únicas e possíveis aglomerados ou dobras são fechados com a dispersão dianteira para altura e área (FSC-H e FSC-A). (B): Detritos potenciais são removidos com FSC-A e SSC-A, e apenas células intactas são mais classificadas. (C): As células não viáveis são excluídas com base na fluorescência de iodeto de propidium (PI) (FSC-A e FL3-A). (D): As células alimentadoras MEF foram fechadas por seleção negativa com base na expressão do mouse CD90.2-PE (FL2-A e SSC-A). (E): A fração hESC viável isolada, livre de alimentadores MEF, é finalmente fracionada em subpopulações P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low),P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid)e P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi). O portão negativo (TG30^Neg-GCTM-2^Neg, chamado P4) foi definido de acordo com a autofluorescência de fundo para as células não manchadas e também para controles isótipos. (F): Percentuais das diferentes subpopulações fechadas típicas de uma análise de citometria de fluxo TG30/GCTM-2. Clique aqui para ver a figura maior.

Figura 2. Culturas consecutivas representativas de células P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)representativas da linha hESC-MEL1. (A): Os lotes TG30/GCTM-2 FACS que mostram subconjuntos fechados de células (P4, P5, P6 e P7) discriminadas pelo nível de expressão detectada dos marcadores de superfície celular TG30 e GCTM-2. Uma população inicial de 400.000 hESC-derivados exibindo P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) é coletada a partir de culturas a granel da linha hESC-MEL1. Estas células P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) são consecutivamente passagens pós-FACS em condições de suporte para renovação do HESC em frascos T75, até atingirem a confluência (11-13 dias). Antes de cada passagem, o TG30/GCTM-2 FACS é realizado para coletar e recultura apenas os tipos de células diferenciadas P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg). (B): Morfologia típica do gramado de células P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)após 14 dias. (C): Colônias esporádicas semelhantes a hESC vistas após 14 dias misturadas com o gramado de células P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) apenas na passagem 1, são provavelmente geradas pela contaminação P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) células. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver a figura maior.

Figura 3. Células P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) derivadas das linhas hESC podem ser passagem consecutivas pós-FACS sem perder suas propriedades pluripotentes intrínsecas. Representante TG30/GCTM-2 FACS imunoprofilando as diferentes passagens consecutivas, mostrando os subconjuntos discriminados de células (P4, P5, P6 e P7) de acordo com o nível de expressão de TG30 e GCTM-2. (A): Uma população inicial de 400.000 células mostrando características P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) é recuperada de culturas a granel da linha hESC-MEL1. As células P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) são consecutivamente percoradas pós-FACS em condições de suporte para renovação do HESC em frascos T75, até atingir ~80% de confluência (9-11 dias). O imunoprofilamento TG30/GCTM-2 FACS é realizado antes de replacar células em cada passagem e apenas as células P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) são reculturadas. Os resultados mostram que as células P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) conservam suas características pluripotentes com a posterior passagem, incluindo conservação da expressão (TG30^Hi-GCTM-2^Hi),formando colônias semelhantes a hESC (mostradas em B) e mantendo a capacidade de diferenciar como pode ser inferida a partir da recapitulação de uma pequena fração de P4 diferenciado (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) em cada um dos gradientes FACS. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver a figura maior.

Amostra (volumes de reação)	Anticorpo primário	Anticorpo secundário	PE Rat Anti-Mouse CD90.2 b	Iodida de propidium c
Amostra de classificação (~9 ml para ABs primários, 2,5 ml para ABs secundários)	(TG30 + GCTM-2) um	AF 488 cabra anti-rato IgG2a + AF 647 cabra anti-rato IgM	+	+
Controle-1: TG30 (200 μl)	TG30	AF 488 cabra anti-rato IgG2a	-	+
Controle-2: GCTM-2 (200 μl)	GCTM-2	IgM anti-rato de cabra AF 647	-	+
Control-3: Anti-mouse CD90.2 (200 μl)	-	-	+	+
Controle-4: Ficoerythrin (PE) (200 μl)	Isótipo de Mouse IgG2a	R-phycoerythrin cabra anti-mouse IgG2a	-	+
Controle-5: Isótipo de imunoglobulina do rato (200 μl)	Isótipo de Mouse IgG2a + isótipo IgM	AF 488 cabra anti-rato IgG2a + AF 647 cabra anti-rato IgM	-	+
Controle-6: Células não manchadas (200 μl)	-	-	-	-

Mesa 1. Classificar amostra e controles para classificação FACS. ^um A amostra de classificação é imunos detida simultaneamente com anticorpos TG30 e GCTM-2. ^b PE-anti-mouse CD90.2 é usado para reconhecer células do mouse e remover MEFs de hESCs durante FACS¹⁴. ^c As células não viáveis são excluídas usando iodeto de propídio em uma concentração final de 0,3 μg/ml. Reagente adicionado (+), não adicionado (-) ao tubo de reação.

anticorpo	anfitrião	Isotipo	Diluição de trabalho
TG30 (1,4 mg/ml)	rato	IgG2a	1:1,000
GCTM-2 (hibrinato supernatante)	rato	grão-mestre	1:5 ~ 1:10 a
AF 488 cabra anti-rato IgG2a	cabra	Policlonal	1:500
IgM anti-rato de cabra AF 647	cabra	Policlonal	1:500
R-phycoerythrin (PE) anti-rato IgG2a	cabra	Policlonal	1:1,000
Anti-mouse CD90.2	rato	IgG2b	1:100
Mouse purificado IgG2a, κ Isótipo Controle	rato	IgG2a	1:200
IgM do rato purificado, κ Isótipo Controle	rato	grão-mestre	1:200

Mesa 2. Detalhes e diluições de anticorpos para classificação FACS. a ^Devido à expressão extremamente muito alta de GCTM-2 na superfície celular dos hESCs não é possível alcançar a saturação com este anticorpo. Cada lote de supernanato hibrinato GCTM-2 deve ser titulado contra um controle padrão ou um lote anterior para obter resultados semelhantes com hESCs em escala e evitar sobre a coloração.

Nome do meio	composição
hESC/KOSR médio	Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mix F-12 (DMEM/F-12) complementado com 20% de Substituição de Soro de Knockout (KOSR), 2 mM GlutaMAX, 1% Aminoácidos Não essenciais MEM, 0,1 mM 2-Mercaptoetanol, 10 ng/ml fator de crescimento do fibroblasto humano 2 (FGF-2) e Caneta/Estreptococos em 1x.
Meio MEF	Dulbecco's Modified Eagle Medium, alta glicose (DMEM) suplementado com 10% de Soro Bovino Fetal (FBS), 2 mM GlutaMAX e Caneta/Estrepto em 1x.

Mesa 3. Composição da mídia cultural.

Discussão

No contexto clínico, os tipos de células somáticas diferenciadas são o produto final desejado para transplante e aplicações terapêuticas, e o HPSC é uma fonte auto-renovadora e escalável para gerar essas células somáticas ou seus progenitores em laboratório. A presença de hESCs residuais indiferenciados com um potencial inerente à formação de teratoma é um risco de segurança quando se considera células somáticas derivadas do HESC para transplante em pacientes. Para uma revisão deste e de outros riscos associados à terapia celular, consulte Sharpe et al. ¹⁶ Portanto, para realizar tais aplicações, é imprescindível que os pesquisadores busquem gerar populações de células-alvo que também são livres de células-tronco pluripotentes. Para isso, demonstramos aqui que utilizando nossa metodologia TG30/GCTM-2 FACS é possível monitorar para a presença de células pluripotentes (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) em uma população celular diferenciada e obter derivados viáveis diferenciados pelo HESC que podem ser enriquecidos e reculturados pós-FACS. Embora não seja possível obter amostras 100% pluripotentes sem células-tronco com um único passe do nosso protocolo, os derivados enriquecidos do hESC podem ser reculturados e após a passagem consecutiva 100% de pureza de células somáticas é alcançada. A viabilidade demonstrada das células somáticas para expansão pós-FACS também permite potencialmente a produção de um número adequado de células adequadas para potenciais terapias de transplante.

Os resultados encorajadores deste estudo piloto nos levaram a realizar uma investigação mais abrangente usando nosso protocolo TG30/GCTM-2 em um estudo comparativo com várias linhas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC)^{linhas 15}. Nesse estudo, descobrimos que amostras pluripotentes sem células-tronco obtidas usando nosso protocolo TG30/GCTM-2 FACS não geraram teratomas quando transplantadas em camundongos imunes. Portanto, podemos afirmar com confiança que, com o uso deste protocolo in vitro, culturas celulares de diferenciação em estágio inicial determinadas a serem livres de células TG30^Hi-GCTM-2^Hi não desenvolvem teratomas in vivo. Isso suporta fortemente a robustez do nosso ensaio, fornecendo uma abordagem potencial para eliminar o risco de formação de teratoma antes do uso de células derivadas do HPSC em aplicações clínicas.

Por outro lado, também mostramos que o ensaio TG30/GCTM-2 FACS pode ser usado para recuperar uma população de células pluripotentes com alto nível de expressão desses dois antígenos de superfície (TG30^Hi-GCTM-2^Hi). Estudos anteriores mostraram que as células TG30^Hi-GCTM-2^Hi apresentam a maior correlação com a expressão^{oct4 oi} e formam o maior número de colônias semelhantes a hESC^5,6,13,15. Por isso, argumentamos que a rede de pluripotência é ativada em seus níveis máximos em células de expressão TG30^Hi-GCTM-2^Hi. Consideramos que o uso do nosso protocolo TG30/GCTM-2 FACS e a recuperação de células P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) poderia permitir a purificação em larga escala de culturas hESC vivas enriquecidas, como entradas para ensaios diferenciados.

Em conclusão, demonstramos aqui a potencialidade de nossos ensaios FACS com base na expressão combinada de antígenos superficiais TG30 e GCTM-2 tanto para a purgação quanto para o enriquecimento dos hESCs. Estudos futuros com protocolos de diferenciação direcionada de hPSCs provavelmente também serão informativos quanto a essa potencialidade. Estamos cientes de que em alguns ensaios onde os derivados diferenciados do HESC expressam temporalmente o TG30 (CD9) ou o GCTM-2, esses dois anticorpos podem não ser apropriados ou suficientes para expurgar células pluripotentes de uma população diferenciada em um determinado ponto de tempo no ensaio⁶. Portanto, há uma necessidade contínua de encontrar novos anticorpos que reconheçam especificamente os hESCs vivos para superar a possível limitação da reação cruzada com alguns tipos de células diferenciadas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM/F-12	Life Technologies	11320082	Nome Longo: Dulbecco's Modified Eagle Meio: Mistura de Nutrientes F-12
KOSR	Life Technologies	10828028	Nome Longo: Knockout Serum Replacement
GlutaMAX	Life Technologies	35050061	Nome Longo: Suplemento GlutaMAX
Aminoácidos Não Essenciais Life	Technologies	11140050	Nome longo: MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais
Mercaptoetanol	Life Technologies	21985023	Nome Longo: 2-Mercaptoetanol
DPBS	Life Technologies	14190250	Nome Longo: Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, sem cálcio, sem magnésio
TrypLE Express	Life Technologies	12604039	Nome Longo: TrypLE Express (1x), sem Vermelho de Fenol
AF-488	Life Technologies	A21131	Nome Longo: Alexa Fluor 488 cabra anti-rato IgG2a
AF-647	Life Technologies	A21238	Nome Longo: Alexa Fluor 647 cabra anti-rato IgM
PE-anti IgG2a	Life Technologies	P21139	Nome Longo: R-Ficoeritrina Cabra Anti-Rato IgG2a (&gama; 2a) Conjugado
DMEM	Life Technologies	11965-092	Nome longo: Dulbecco's Modified Eagle Medium, alta glicose
Pen/Strep	Life Technologies	15140-122	Nome longo: Penicilina-estreptomicina,
água destilada	Life Technologies	15230-089.	Nome longo: Água destilada estéril
PI	SIGMA	P4864	Nome longo: Solução de iodeto de propídio
FBS	SIGMA	12203C	Nome longo: Gelatina de soro bovino fetal
	SIGMA	G-1890	Nome longo: Gelatina de pele suína
Humano FGF-2	Millipore	GF003AF-100UG	Nome longo: Fator de crescimento de fibroblastos básico, humano recombinante, livre de animais
Filtro 0,22 μ m	Millipore	SCGPU02RE	Nome Longo: Stericup-GP, 0.22 μ m, polietersulfona, 250 ml, radioesterilizado
70 μ m Filtro de Células	Becton Dickinson	352350	Nome Longo: Filtro de Células com 70 μ m Malha de nylon
35 μ m Filtro de células com tampa, tubo de 5 ml	Becton Dickinson	352235	Nome longo: tubo de ensaio de fundo redondo de poliestireno de 5 ml, com uma tampa de filtro de células (35 μ m)
Tubo de ensaio de fundo redondo de poliestireno de 5 ml	Becton Dickinson	352054	Nome longo: tubo de ensaio de fundo redondo de poliestireno de 5 ml,
controle de isotipo IgG2a	Becton Dickinson	554126	Nome longo: rato purificado IgG2a, κ Controle de Isotipo
IgM Controle de Isotipo	Becton Dickinson	553472	Nome Longo: IgM de Rato Purificado, κ Controle de isotipo
PE-CD90.2	Becton Dickinson	553014	Nome longo: PE Rat Anti-Mouse CD90.2
Calibração de 8 picos	Becton Dickinson	559123	Nome longo: Partículas de calibração do arco-íris (8 picos)
Tubo de polipropileno estéril de 50 ml	Greiner Bio-One	227261	Nome longo: Tubo de polipropileno de 50 ml com fundo cônico, frasco estéril
T75	Greiner Bio-One	658175	Nome longo: CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Frascos
TG30	Merck Millipore	MAB4427	Nome longo: TG30 Anticorpo, clone TG30
GCTM-2	Merck Millipore	MAB4346	Nome longo: GCTM-2 não está disponível comercialmente, mas TG343 e anticorpo monoclonal equivalente é
Tabela 4. Lista de materiais e reagentes
Máquina FACS	Becton Dickinson		FACSVantage SE com FACSDiva opção
Microscópio invertido	Olympus		IX71
Tabela 5. Lista de equipamentos.