As bactérias produzem compostos secretados que têm o potencial de afetar a fisiologia de seus vizinhos microbianas. Aqui nós descrevemos uma tela de co-cultura, que permite a detecção de tais quimicamente mediadas entre espécies interações misturando os micróbios do solo com cepas repórter transcrição fluorescentes de Bacillus subtilis em meios sólidos.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Usando Coculture detectar quimicamente mediada interespécies Interações
Neste artigo
Resumo
Resumo
Na natureza, as bactérias raramente existem isoladamente, pois eles estão em lugar cercado por um conjunto diversificado de outros microorganismos que alteram o meio ambiente local através da secreção de metabólitos. Estes metabolitos têm o potencial de modular a fisiologia ea diferenciação de seus vizinhos microbiana e são prováveis fatores importantes para a criação e manutenção de comunidades microbianas complexas. Nós desenvolvemos uma tela à base de co-cultura de fluorescência para identificar tais interacções microbianas quimicamente mediados. A tela envolve a combinação de uma transcrição repórter tensão fluorescente com micróbios ambientais em meios sólidos e permitindo que as colônias de crescer em co-cultura. O repórter transcricional fluorescente é projetado de modo que a estirpe bacteriana escolhido fluorescência quando é expressar um fenótipo de interesse particular (ou seja, a formação de biofilme, esporulação, a produção de fator de virulência, etc.) A triagem é realizada sob condições de crescimento where este fenótipo não é expresso (e, por conseguinte, a estirpe repórter é tipicamente não fluorescente). Quando um micróbio ambiental segrega um metabolito que activa este fenótipo, difunde-se através do ágar e ativa a construção repórter fluorescente. Isto permite que a indução de-produzir metabolito micróbio para ser detectado: eles são as colónias não fluorescentes mais proximais às colónias fluorescentes. Assim, esta tela permite a identificação de micróbios ambientais que produzem metabólitos difusíveis que ativam uma resposta fisiológica especial em uma cepa repórter. Esta publicação aborda como: a) selecionar as condições de co-cultura de rastreio adequados, b) preparar o repórter e micróbios ambientais para o rastreio, c) executar a tela de co-cultura, d) isolar putativo induzindo organismos, e e) confirmar a sua atividade em uma tela secundária. Nós desenvolvemos este método para triagem de organismos do solo que ativam biofilme matriz de produção em Bacillus subtilis
Introdução
Estamos interessados em compreender como os metabólitos que as bactérias segregam afetam a fisiologia eo desenvolvimento de micróbios vizinhos. Muitos metabolitos têm sido caracterizados pelos seus efeitos bioactivos sobre os outros micróbios. Dois exemplos bem descritos incluem os antibióticos, os quais inibem o crescimento de outros micróbios e as moléculas de quorum sensing, que alteram a expressão génica global de outros micróbios. No entanto, as bactérias produzem muitos outros produtos naturais de moléculas pequenas que não têm bioatividades conhecidos 1. Nós supomos que as bactérias têm evoluído e preservada a capacidade de produzir alguns destes ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Selecione um gene repórter e construir um repórter fluorescente Transcriptional
Para B. subtilis:
- Veja o artigo Jove em referência 19 para um protocolo que descreve a construção de repórteres transcricionais fluorescentes em Bacillus subtilis.
Por outras espécies bacterianas:
- Identificar um gene que é regulada positivamente durante a resposta fisiológica de interesse. Isto pode basear-se na literatura existente ou análise de transcrição do micróbio em condições particulares.
- Construir um repórter transcricional fluorescente para e....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Esta tela foi utilizado para identificar organismos do solo que segregam uma substância que altera a fisiologia do B. subtilis. Os resultados descritos aqui focar o tipo de células produtoras de matriz de B. subtilis, que produz a proteína e exopolissacarídeo que são necessários para a formação de biofilme robusta nesta bactéria. Nós selecionamos o promotor do operon Tapa-sipW-tasa para nossa construção repórter fluorescente (P tapa-YFP). Este operão codifica o componente e.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Uma das limitações inerentes a este protocolo é que ele conta com o cultivabilidade de organismos microbianos. Como tem sido bem documentada 24, mais a vida microbiana no planeta não pode (ainda) ser cultivadas sob as condições de cultura exploradas até o momento. Assim, um grande número de interações entre espécies microbianas que estão ocorrendo em ambientes naturais vai passar despercebido usando essa abordagem. No entanto, uma vez que o nosso desejo é o de identificar não só a existência de tais interacçõ.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
O autor agradece a Roberto Kolter (Harvard Medical School) para o seu conselho e assistência durante o desenvolvimento desta tela co-cultura de valor inestimável. Ela também graças Matthew Powers para a leitura do manuscrito para a clareza e Chia-yi Cheng para a assistência com a obtenção Figura 6.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Espectrofotómetro | Qualquer espectrofotómero capaz de medir valores de 600 absorvância. | ||
| Caldo Luria, Lennox | VWR | 80017-484 | Podem ser necessárias fontes de mídia alternativas. |
| Contas de vidro, 3 mm | VWR | 26396-508 | |
| Pontas de carregamento de gel, redondas | VWR | 29442-666 | |
| Varetas de vidro | VWR | 59060-069 | |
| Estreoscópio de dissecação de fluorescência | Zeiss | N/A | O autor utilizou um estereoscópio de dissecação Zeiss Stemi SV6 com uma fonte de luz fluorescente EXFO X-cite 120, um cubo de filtro YFP de passagem longa, uma objetiva acromática de 0,63X, oculares de 10X e um Câmera digital Axio HRC HR. A maior parte da triagem foi feita com a montagem de foco em 2.0-3.2X. Qualquer estereoscópio de dissecação com recursos de fluorescência é bom, desde que você tenha os filtros corretos para o FP que está usando. É melhor se houver um obturador que permita alternar facilmente entre campo claro e fluorescência, bem como um palco que permita a iluminação de cima e de baixo. Se você deseja capturar imagens, uma câmera acoplada também é necessária. |
Referências
- Berdy, J. Bioactive microbial metabolites. J. Antibiot. 58, 1-26 (2005).
- Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol. Rev. 33, 152-163 (2009).
- Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
