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Artigo de método

De células inteiras MALDI-TOF espectrometria de massa é um método rápido e preciso para analisar os diferentes modos de ativação de macrófagos

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DOI:

10.3791/50926

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26 de dezembro de 2013

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1Unité de Recherche sur les Maladies Infectieuses Tropicales et Emergentes (URMITE), CNRS UMR 7278, INSERM U1095, Aix Marseille Université, 2Service de médecine interne, post-urgence et thérapeutique, Hôpital de la Timone

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o uso de espectrometria de massa MALDI-TOF de células inteiras em células eucarióticas. Aqui, ilustramos a precisão dessa técnica analisando os múltiplos estados de ativação dos macrófagos em resposta ao seu microambiente.

Resumo

MALDI-TOF é uma técnica de espectrometria de massa usados ​​extensivamente na química e bioquímica. Tem sido também aplicado na medicina para identificar moléculas e biomarcadores. Recentemente, tem sido utilizado em microbiologia para identificação rotineira de bactérias cultivadas a partir de amostras clínicas, sem preparação ou fraccionamento passos. Nós e outros autores aplicada esta célula inteira de massa MALDI-TOF técnica de espectrometria com sucesso para células eucarióticas. As aplicações atuais variam de identificação do tipo de célula para avaliação da cultura de células e aplicações de diagnóstico de controle de qualidade. Aqui, descrevemos seu uso para explorar os vários fenótipos de polarização de macrófagos em resposta a citocinas ou bactérias mortas pelo calor. Ele permitiu a identificação de impressões digitais específicos de macrófagos, que são representativas da diversidade de respostas proteômica de macrófagos. Esta aplicação ilustra a precisão e simplicidade do método. O protocolo que descrevemos aqui pode ser útil for estudar a resposta imune do hospedeiro, em condições patológicas, ou pode ser estendida a aplicações de diagnóstico mais amplas.

Introdução

A espectrometria de massa de tempo de voo de ionização/dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS) é uma técnica popular de espectrometria de massa para estudar amostras biológicas. O uso de um feixe de laser e uma matriz absorvente de energia permite um processo de ionização suave: a evaporação e a gênese de grandes biomoléculas de carga única. Esse processo é chamado de dessorção/ionização, justificando a sigla MALDI. Esses íons são então acelerados pela aplicação de tensão e entram em um analisador TOF que permite a separação desses íons e a quantificação de suas respectivas massas1.

MALDI-TOF MS tem sido amplamente utilizado em biologia, química e medicina para identificar moléculas e biomarcadores2-4 ou para monitorar modificações pós-traducionais em proteins5,6. Recentemente, vários grupos aplicaram o MALDI-TOF MS para a identificação de microrganismos a partir de amostras clínicas7,8. Esta aplicação microbiológica agora é usada rotineiramente em ambientes clínicos. O MALDI-TOF de célula inteira tem muitas vantagens em comparação com as aplicações clássicas do MALDI-TOF MS. Amostras contendo células inteiras são processadas diretamente, evitando etapas demoradas para fracionar ou separar grandes quantidades de material. Além disso, não é necessária a caracterização dos vários picos: todo o espectro é considerado como uma impressão digital da amostra, e os algoritmos de correspondência comparam o espectro testado com um banco de dados de espectros de referência.

Nós e outros aplicamos essa técnica de análise de células inteiras a células eucarióticas. Muitas aplicações podem ser derivadas desta técnica: (1) identificar os principais tipos de células de uma amostra mista9-11; (2) avaliar a viabilidade das culturas de células ao longo do tempo (incluindo aplicações industriais de controle de qualidade)12; (3) monitorar os estados de ativação de um único tipode célula 13; (4) avaliar a transformação maligna de uma amostra clínica14,15.

Aqui, descrevemos o uso de MALDI-TOF MS de células inteiras para explorar os vários fenótipos de polarização de macrófagos em resposta a citocinas ou bactérias mortas pelo calor. Os macrófagos desempenham um papel fundamental na resposta imune a patógenos microbianos. Eles detectam agentes infecciosos nos tecidos por meio de receptores de reconhecimento de padrões capazes de detectar padrões microbianos conservados, como o lipopolissacarídeo (LPS)16. Os macrófagos são células apresentadoras de antígenos profissionais que interagem com as células T para montar a resposta imune adaptativa. As células T influenciam os macrófagos liberando citocinas que reforçam ou regulam a atividade microbicida dos macrófagos. Por analogia com a polarização dos linfócitos Th1/Th2, macrófagos inflamatórios, microbicidas e tumoricidas foram classificados em macrófagos M1 e macrófagos imunorreguladores como macrófagos M217-19. O termo M1 refere-se à ativação clássica de macrófagos por citocinas do tipo I, como interferon (IFN)-γ e fator de necrose tumoral (TNF), ou produtos bacterianos, como LPS18,20-23, enquanto macrófagos ativados por vias alternativas (interleucina (IL)-4, IL-10, Fator de Crescimento Transformador-β1 são considerados macrófagos M219,24,25. A alta plasticidade fenotípica e funcional dos macrófagos em resposta ao seu microambiente torna esses macrófagos úteis para analisar mudanças sutis por uma abordagem MALDI-TOF MS.

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Protocolo

No presente protocolo, a técnica MALDI-TOF de células inteiras é usada para obter um espectro de massa considerado como uma impressão digital da amostra. Uma análise bioinformática permitiu a comparação e a classificação dessas impressões digitais. Havia três partes principais neste protocolo:

  1. A preparação das amostras biológicas: macrófagos controle e macrófagos estimulados com diferentes agonistas.
  2. A análise de cada tipo de amostra com réplicas técnicas por células inteiras MALDI-TOF MS.
  3. A análise de bioinformática de dados brutos.

Prepare soluções estéreis para isolamento e cultura de células. Preparar e armazenar todos os reagentes a 4 °C

1. Preparação de monócitos humanos

  1. Preparar o meio de cultura celular. Adicionar 55 ml de soro humano AB+ ou soro fetal bovino (SFB) e 5 ml da solução antibiótica (penicilina a 10.000 UI/ml e estreptomicina a 10.000 μg/ml; concentração final de 100 UI/ml para penicilina e 100 μg/ml para estreptomicina) ao meio RPMI 1640 (500 ml).
    1. Isole as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de leucopacks (concentrados de leucócitos).
      1. Prepare tubos de 50 ml contendo 15 ml de Ficoll. Dilua o sangue em solução salina (vol/vol, 1/10). Depositar 30 ml de PBMC diluídos em Ficoll conforme descrito anteriormente26.
      2. Centrifugar a 700 x g durante 20 min. Recuperar PBMCs na interface entre Ficoll (densidade de 1,077 g/ml) e plasma diluído. Diluir PBMCs em meio de cultura e centrifugar a 300 x g por 5 min.
    2. Preparar monócitos CD14+ a partir de PBMCs usando esferas magnéticas revestidas com anticorpos anti-CD14.
      Nota: Manter os produtos e as células a 4 °C até à obtenção de monócitos.
      1. Prepare o tampão de corrida consistindo de solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,2, albumina sérica bovina a 0,5% (BSA) e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 2 mM.
      2. Dissocie suavemente PBMCs peletizados (107 células por ensaio) em 80 μl de tampão de corrida.
      3. Adicione 20 μl de MicroBeads CD14 aos PBMCs. Misture e incube PBMCs por 15 min. Lave os PBMCs com 5 ml de tampão de funcionamento e centrifugue a 300 x g por 5 min. Dissocie suavemente PBMCs peletizados em 500 μl de tampão de corrida para 108 PBMCs.
        Nota: use 500 μl de tampão de corrida para concentrações de PBMC inferiores a 108 PBMCs.
      4. Prossiga para a separação magnética.
        Nota: para menos de 2 x 108 PBMCs, use a coluna MS; para mais de 2 x 108 PBMCs e menos de 2 x 109 PBMCs, use a coluna LS.
      5. Enxágue a pré-coluna e a coluna com tampão corrido (500 μl para coluna MS ou 3 ml para coluna LS).Adicione PBMCs à pré-coluna (aguarde até que células não rotuladas passem pela coluna). Enxágue 3 vezes com tampão corrido (500 μl para coluna MS ou 3 ml para coluna LS). Remova a pré-coluna.
      6. Colocar a coluna sobre tubos de 15 ml. Adicione o tampão de corrida (1 ml para a coluna MS ou 5 ml para a coluna LS) na coluna e elua as células CD14+ aplicando uma pressão na coluna.
      7. Centrifugar o eluído a 300 x g durante 5 min. Rejeitar o sobrenadante. Lavar o grânulo de monócitos com 10 ml de meio de cultura.
        Nota: Analise a pureza da preparação de monócitos usando anticorpos anti-CD14 e citometria de fluxo (classicamente superior a 95%).
  2. Diferenciação de monócitos em macrófagos.
    1. Incubar monócitos (106 monócitos por alvéolo em placas de 6 poços) em 3 ml de meio de cultura contendo 10% de AB+ sérico humano a 37 °C. Após 4 dias, substitua o meio de cultura contendo soro humano por 3 ml de meio de cultura contendo 10% de FBS por mais 3 dias.
    2. Identifique a população celular obtida como macrófagos derivados de monócitos (MDM) por citometria de fluxo (ver Figura 1).
      1. Substituir o meio de cultura por 3 ml de PBS. Raspe os MDMs com um policial de borracha e colete as suspensões do MDM. Centrifugue a 400 x g por 5 min. Adicione PBS contendo 2% de BSA aos MDMs peletizados e agite suavemente a suspensão celular. Ajustar a concentração celular (106 MDM em 200 ml de PBS) e incubar a 4 °C.
      2. Adicione 10 ml de anticorpos anti-CD14 e 10 ml de anticorpos anti-CD68 à suspensão de MDM e incube a 4 °C por 20 min no escuro.
        Nota: esses anticorpos devem ser marcados com dois fluorocromos diferentes consistentes com a análise de citometria de fluxo. Por exemplo, anticorpos anti-CD14 podem ser conjugados com ficoeritrina acoplada (para coloração de monócitos) e anticorpos anti-CD68 com Alexa Fluor 647 acoplada (para coloração de macrófagos).
      3. Centrifugue MDMs a 400 x g por 5 min. Remova os sobrenadantes. Dissocie suavemente o pellet celular e incube MDMs em 250 ml de paraformaldeído a 3% (PFA) por 15 min em temperatura ambiente. Centrifugue MDMs fixados por PFA a 400 x g por 5 min. Lave os MDMs com 3 ml de PBS e centrifugue os MDMs a 400 x g por 5 min. Dissocie suavemente o pellet de MDM em 400 ml de PBS.
      4. Analise a diferenciação de monócitos (que expressam CD14, mas não CD68) em monócitos (que expressam CD68, mas não CD14). Nota: classicamente, mais de 95% das células são MDM.
  3. Estimulação de MDMs em 18 horas.
    1. Substitua o meio de cultura dos MDMs aderentes por meio de cultura fresco de 3 ml (contendo 10% de FBS).
    2. Para induzir uma polarização M1 ou M2, use as seguintes citocinas recombinantes humanas: IFN-γ e TNF para polarização M1 e IL-4 para polarização M2. Os macrófagos M1 também são obtidos por estimulação com LPS. Note-se que as soluções-mãe de citocinas são conservadas a -80 °C e que a solução-mãe de LPS é conservada a -20 °C.
      1. Diluir a solução-mãe de IFN-gγ (1 mg/ml) a 1/100 em meio de cultura para obter uma diluição de 10 ng/ml. Adicionar 6 μl desta diluição de IFN-γ aos MDM para obter uma concentração final de IFN-γ de 20 ng/ml.
      2. Diluir a solução-mãe de TNF (1 mg/ml) a 1/100 em meio de cultura para obter uma diluição de 10 ng/ml. Adicionar 6 μl desta diluição de TNF aos MDM para obter uma concentração final de TNF de 20 ng/ml.
      3. Diluir a solução-mãe de IL-4 (1 mg/ml) a 1/100 em meio de cultura para obter uma diluição de 10 ng/ml. Adicionar 6 μl desta diluição de IL-4 aos MDM para obter uma concentração final de IL-4 de 20 ng/ml.
      4. Adicionar 3 μl da solução-mãe de LPS (1 mg/ml) aos MDM para obter uma concentração final de LPS de 1 μg/ml.
    3. Para estimular MDMs com bactérias, use bactérias mortas pelo calor. Lave as bactérias vivas com PBS e aqueça-as a 95 °C por 1 hora. O uso de Orientia tsutsugamushi (cepa Kato (CSUR R163), Mycobacterium bovis (Bacillus Calmette-Guérin, BCG CIP cepa 671203) e Coxiella burnetii (Nine Mile na fase I) foi porque esses patógenos são conhecidos por infectar macrófagos. Assim, prepare uma suspensão de O. tsutsugamushi a 109 bactérias / ml. Adicione 50 μl aos MDMs . Repita o mesmo passo para M. bovis e C. burnetii.
  4. Preparação de amostras biológicas para MALDI-TOF MS.
    1. MDMs estimulados por lavagem com PBS sem Ca2+ ou Mg2+ (as células podem aglutinar na presença de Ca2+ ou Mg2+). Raspe os MDMs com um policial de borracha e colete as suspensões do MDM. Lave novamente os MDMs em PBS sem Ca2+ ou Mg2+ a 400 x g por 5 min para descartar a contaminação por FBS.
    2. Ajuste a concentração celular (2 x 106 MDMs por ensaio). Centrifugue MDMs a 400 x g por 5 min e descarte os sobrenadantes. Colete pellets celulares em 20 μl de PBS sem Ca2+ ou Mg2+.
    3. Analise as amostras imediatamente ou armazene-as em PBS a -80 °C antes da análise.

2. Análise de macrófagos por Maldi-TOF MS de célula inteira

  1. Elaboração da matriz CHCA.
    1. Adicione 500 μl de acetonitrila, 250 μl de ácido trifluoroacético a 10% e 250 μl de água de cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) a um frasco. Diluir 10 mg de CHCA nesta solução até uma concentração final de 10 mg/ml. Misture e sonice por pelo menos 20 min.
      Nota: a sonicação melhorará a saturação da matriz, mas esta etapa não é obrigatória.
    2. Centrifugue a 13.000 x g por 5 min. Descarte o pellet e guarde o sobrenadante.
      Nota: preparar a solução da matriz imediatamente antes da utilização. Uma solução de matriz que contém cristais não permite uma boa ionização das moléculas da amostra, e isso pode afetar a qualidade dos espectros.
  2. Preparação do alvo de aço MALDI.
    1. Umedeça o alvo de aço polido com água quente da torneira. Esfregue com papel de limpeza de precisão. Adicione 70% de etanol e esfregue. Enxágüe com água esfregando. Adicione etanol 70% e esfregue com papel de precisão.
    2. Mergulhe o alvo em etanol a 70% e sonice por pelo menos 15 min. Cubra o alvo com 500 μl a 1 ml de ácido trifluoroacético a 80%. Esfregue e limpe com papel de precisão. Enxágüe com água HPLC sem esfregar. Seque o alvo em temperatura ambiente.
      Nota: um alvo limpo incorretamente pode afetar a qualidade dos espectros.
  3. Preparação de depósitos.
    1. Coloque o alvo limpo em um suporte horizontal e nivelado para obter depósitos uniformes.
    2. Descongele suavemente as amostras de MDM no gelo. Nota: o descongelamento rápido e vigoroso pode alterar as amostras, afetando assim a qualidade dos espectros. Homogeneizar MDMs (pipetando para frente e para trás a suspensão celular) antes da deposição de 1 μl (contendo aproximadamente 1 x 105 células) no alvo MALDI. Adicionar 1 μl da solução de matriz MALDI na amostra. Evite misturar manchas com a pipeta. A mistura de manchas com pipetas altera a qualidade dos espectros. Depor 12-16 amostras/ensaio (réplicas técnicas).
    3. Evaporar espontaneamente à temperatura ambiente. Nota: a evaporação ocorre gradualmente e leva à formação de cristais de matriz/amostra. Os depósitos podem ser imediatamente analisados ou armazenados no escuro por vários dias antes da análise (até 2 semanas).
    4. O usuário deve controlar se as citocinas ou bactérias mortas pelo calor usadas no experimento não fornecem picos dentro da faixa de espectros de macrófagos estimulados. Aqui, verificamos que as citocinas e bactérias mortas pelo calor sozinhas não forneceram nenhum sinal dentro da faixa estudada (0-20 kDa).
  4. Ajuste do espectrômetro de massa e aquisição de dados.
    1. Insira o alvo de aço contendo amostras no espectrômetro de massa.
    2. Configure o espectrômetro de massa e execute a aquisição de dados. Use a configuração padrão para aquisição automatizada dos dados.
    3. Nota: uma visão detalhada da configuração do software flexControl é fornecida no apêndice/Tabela 1. Isso pode variar de acordo com o espectrômetro de massa e o software usado.

3. Análise de Bioinformática

Nota: a análise bioinformática foi realizada utilizando o software de análise estatística R, gratuito e de código aberto, juntamente com bibliotecas de análise específicas (MALDIquant). R pode ser baixado gratuitamente de seu site http://cran.r-project.org/. Uma descrição detalhada do script é fornecida como material suplementar.

  1. Carregamento e pré-tratamento de dados brutos.
    1. Armazene dados brutos no computador associado ao espectrômetro de massa em vários arquivos e pastas. Recupere a pasta raiz do experimento com todas as subpastas. Copie a pasta raiz para o computador pessoal para análise.
    2. Use as bibliotecas readBrukerFlexData e MALDIquant para carregar e analisar dados brutos.
      Nota: readBrukerFlexData permite o carregamento de dados brutos do espectrômetro de massa em um objeto específico em R para análise posterior. Consulte a descrição do MALDIquant para obter mais informações27.
    3. Analise espectros.
      gerados Nota: cada espectro consiste em uma lista de picos com suas respectivas massas e intensidades (abundância relativa). Use a raiz quadrada das intensidades para melhorar a visualização gráfica dos espectros. Corrija o plano de fundo usando um algoritmo de recorte de pico não linear sensível à estatística para estimativa de linha de base27. Use uma relação sinal-ruído de 6 para detectar picos. Considere que os picos detectados são semelhantes entre os espectros quando os valores de massa/carga (m/z) estão dentro de uma janela de 2.000 ppm.
  2. Definição e cálculo da pontuação. Classifique os espectros usando um agrupamento hierárquico com um algoritmo de enfermaria para aglomeração e uma matriz de dissimilaridade baseada na distância de Jaccard.
    Nota: o índice de Jaccard mede a semelhança entre conjuntos de amostras booleanas (ou seja, a presença/ausência de uma lista de picos).
  3. Comparação de espectros e visualização.
    1. Analise gráficos de espectros brutos. Nota: o eixo x representa a razão m/z (em Daltons) e o eixo y representa a intensidade (abundância relativa).
    2. Avalie a semelhança entre os espectros por agrupamento hierárquico. Representam semelhança (ou divergência) como dendrograma.
    3. Avalie a reprodutibilidade por meio da representação virtual em gel. Nota: a representação virtual de visualização em gel é um gráfico de mapa de calor modificado em que a abundância relativa é codificada por cores com intensidades crescentes de azul.

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Resultados

O objetivo do presente protocolo é demonstrar a precisão da MALDI-TOF MS em células inteiras para avaliar a resposta dos macrófagos ao seu microambiente.

Figura 1 descreve a preparação de macrófagos estimulados a partir de amostras de sangue. Figura 2 representa a análise de monócitos e MDMs por citometria de fluxo. Observe que os monócitos expressavam CD14, mas não CD68 (Figura 1A). Por outro lado, os MDMs expressavam CD68, mas não CD14 (

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Discussão

Este protocolo descreve o uso de MALDI-TOF-MS em células inteiras eucarióticas. Aqui, ilustramos a precisão do método analisando os múltiplos estados de ativação dos macrófagos em resposta ao seu microambiente.

O sucesso do protocolo depende de algumas etapas críticas. Primeiro, qualquer contaminante da solução pode alterar os espectros. Por exemplo, é importante lavar as células em PBS para remover o meio de cultura e as proteínas séricas antes da deposição no alvo. Uma concentração celular d...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses. RO, JLM e CC são inventores de uma patente internacional WO 2011/154650, denominada "Procédé d'identification de cellules de mammifères par spectrométrie de masse MALDI-TOF".

Agradecimentos

Richard Ouedraogo é apoiado por uma bolsa do Ministère de la Santé (PHRC 2010). Agradecemos a Laurent Gorvel, Christophe Flaudrops e Nicolas Amstrong pela assistência técnica.

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