De células inteiras MALDI-TOF espectrometria de massa é um método rápido e preciso para analisar os diferentes modos de ativação de macrófagos

Resumo

Este protocolo descreve o uso de espectrometria de massa MALDI-TOF de células inteiras em células eucarióticas. Aqui, ilustramos a precisão dessa técnica analisando os múltiplos estados de ativação dos macrófagos em resposta ao seu microambiente.

Resumo

MALDI-TOF é uma técnica de espectrometria de massa usados ​​extensivamente na química e bioquímica. Tem sido também aplicado na medicina para identificar moléculas e biomarcadores. Recentemente, tem sido utilizado em microbiologia para identificação rotineira de bactérias cultivadas a partir de amostras clínicas, sem preparação ou fraccionamento passos. Nós e outros autores aplicada esta célula inteira de massa MALDI-TOF técnica de espectrometria com sucesso para células eucarióticas. As aplicações atuais variam de identificação do tipo de célula para avaliação da cultura de células e aplicações de diagnóstico de controle de qualidade. Aqui, descrevemos seu uso para explorar os vários fenótipos de polarização de macrófagos em resposta a citocinas ou bactérias mortas pelo calor. Ele permitiu a identificação de impressões digitais específicos de macrófagos, que são representativas da diversidade de respostas proteômica de macrófagos. Esta aplicação ilustra a precisão e simplicidade do método. O protocolo que descrevemos aqui pode ser útil for estudar a resposta imune do hospedeiro, em condições patológicas, ou pode ser estendida a aplicações de diagnóstico mais amplas.

Introdução

A espectrometria de massa de tempo de voo de ionização/dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS) é uma técnica popular de espectrometria de massa para estudar amostras biológicas. O uso de um feixe de laser e uma matriz absorvente de energia permite um processo de ionização suave: a evaporação e a gênese de grandes biomoléculas de carga única. Esse processo é chamado de dessorção/ionização, justificando a sigla MALDI. Esses íons são então acelerados pela aplicação de tensão e entram em um analisador TOF que permite a separação desses íons e a quantificação de suas respectivas massas¹.

MALDI-TOF MS tem sido amplamente ....

Protocolo

No presente protocolo, a técnica MALDI-TOF de células inteiras é usada para obter um espectro de massa considerado como uma impressão digital da amostra. Uma análise bioinformática permitiu a comparação e a classificação dessas impressões digitais. Havia três partes principais neste protocolo:

1. A preparação das amostras biológicas: macrófagos controle e macrófagos estimulados com diferentes agonistas.
2. A análise de cada tipo de amostra com réplicas técnicas por células inteiras MALDI-TOF MS.
3. A análise de bioinformática de dados brutos.

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Resultados

O objetivo do presente protocolo é demonstrar a precisão da MALDI-TOF MS em células inteiras para avaliar a resposta dos macrófagos ao seu microambiente.

Figura 1 descreve a preparação de macrófagos estimulados a partir de amostras de sangue. Figura 2 representa a análise de monócitos e MDMs por citometria de fluxo. Observe que os monócitos expressavam CD14, mas não CD68 (Figura 1A). Por outro lado, os MDMs expressavam CD68, mas não CD14 (

Discussão

Este protocolo descreve o uso de MALDI-TOF-MS em células inteiras eucarióticas. Aqui, ilustramos a precisão do método analisando os múltiplos estados de ativação dos macrófagos em resposta ao seu microambiente.

O sucesso do protocolo depende de algumas etapas críticas. Primeiro, qualquer contaminante da solução pode alterar os espectros. Por exemplo, é importante lavar as células em PBS para remover o meio de cultura e as proteínas séricas antes da deposição no alvo. Uma concentração celular d.......