O transplante celular representa uma estratégia para o tratamento da degeneração da retina caracterizada pela perda de fotorreceptor. Aqui descrevemos um método de enriquecimento de fotorreceptores transplantáveis e seu enxerto subretinal em camundongos adultos.
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Artigo de método
Transplante subretinal de células precursoras do fotoreceptor purificado MACS na retina do rato adulto
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A deficiência visual e a cegueira devido à perda das células de sensoriamento de luz da retina, ou seja, fotorreceptores, representam a principal razão para a incapacidade nos países industrializados. A substituição de fotorreceptores degenerados por transplante celular representa uma possível opção de tratamento em futuras aplicações clínicas. De fato, estudos pré-clínicos recentes demonstraram que fotorreceptores imaturos, isolados da retina do camundongo neonatal no pós-natal dia 4, têm o potencial de se integrar à retina do camundongo adulto após o transplante subretinal. As células doadoras geraram uma morfologia fotorreceptora madura, incluindo segmentos internos e externos, um corpo de células redondas localizado na camada nuclear externa, e terminais sinápticos próximos a células bipolares endógenas. De fato, relatórios recentes demonstraram que os fotorreceptores doadores se integram funcionalmente aos circuitos neurais dos camundongos hospedeiros. Para uma futura aplicação clínica de tal abordagem de substituição celular, suspensões purificadas das células de escolha devem ser geradas e colocadas na posição correta para a adequada integração ao olho. Para o enriquecimento dos precursores do fotorreceptor, a classificação deve ser baseada em antígenos de superfície celular específicos para evitar a modificação genética das células doadoras. Aqui mostramos a classificação celular associada a magnético (MACS) - enriquecimento de precursores fotorreceptor de haste transplantáveis isolados da retina neonatal de camundongos repórteres específicos do fotorreceptor com base no marcador de superfície celular CD73. A incubação com anticorpos anti-CD73 seguidos por anticorpos secundários conjugados por micro-contas permitiu o enriquecimento de precursores fotorreceptor de haste pelo MACS para aproximadamente 90%. Em comparação com a citometria de fluxo, o MACS tem a vantagem de que pode ser mais fácil aplicado aos padrões GMP e que altas quantidades de células podem ser classificadas em períodos relativos curtos de tempo. A injeção de suspensões celulares enriquecidas no espaço subretinal de camundongos adultos do tipo selvagem resultou em uma taxa de integração 3 vezes maior em comparação com suspensões celulares não sortidas.
Introdução
A visão é um dos principais sentidos dos humanos. O comprometimento desse sentido e da cegueira são uma das principais razões para a incapacidade nos países industrializados. A causa predominante para comprometimento da visão ou cegueira é a degeneração da retina, caracterizada pela perda celular fotorreceptora, pois pode ser observada na degeneração macular, retinite pigmentosa, distrofia cone-rod e outras condições. Até o momento, uma terapia eficaz para restaurar a visão perdida não está disponível. Em 2006 e 2008, dois laboratórios diferentes relataram, independentes um do outro, um transplante bem sucedido de células precursoras de fotorreceptor de varas em retinas de camundongos adultos do tipo selvagem1,2. Assim, decorrente da possibilidade de transplante de células precursoras fotorreceptores também em uma retina degenerada, para substituir fotorreceptores degenerados e restaurar a visão. De fato, foi demonstrado recentemente que tais células precursoras fotorreceptoras transplantadas provocam critérios morfológicos de fotorreceptores maduros do tipo selvagem, como segmentos externos devidamente desenvolvidos3, terminais sinápticos próximos a células bipolares endógenas e um corpo de células redondas localizados na camada nuclear externa2-4,bem como a capacidade de integrar-se funcionalmente ao circuito neural hospedeiro5-7. Um dos principais princípios dessa estratégia é o uso do pós-natal dia 4 (PN 4, PN0 é definido como dia de nascimento) retinas de camundongos jovens, resultando em uma mistura de diferentes tipos de células para transplante. No pano de fundo de uma futura aplicação terapêutica, essa mistura deve ser purificada para células precursoras fotorreceptoras. CD73 foi descrito como o primeiro marcador de superfície celular específico para fotorreceptores jovens na retina8-10. Aqui, demonstramos um método de purificação celular precursora fotoreceptor baseado neste marcador de superfície celular e com o uso da técnica de classificação celular associada a magnético (MACS). O MACS pode ter vantagens em comparação com as técnicas de classificação celular ativadas por fluorescentes, devido aos tempos de triagem rápidos e ao ajuste mais fácil às condições de GMP. Poderíamos demonstrar um enriquecimento de ~90% e uma taxa de integração até 3 vezes maior ao transplantar a população enriquecida para o espaço subretinal em retinas adultas do tipo selvagem. Assim, o enriquecimento celular precursor do fotoreceptor baseado em MACS e o transplante subretinal são técnicas confiáveis e promissoras para o desenvolvimento de uma estratégia terapêutica regenerativa para o tratamento da degeneração da retina.
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Protocolo
Uso ético e cuidado com a declaração dos animais:
Todos os experimentos em animais foram realizados em estrita conformidade com as leis da União Europeia e da Alemanha (Tierschutzgesetz) e aderiram à Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmômica e De Visão. Todos os experimentos em animais foram aprovados pelo comitê de ética animal do TU Dresden e do Landesdirektion Dresden (número de aprovação: 24D-9168.11-1/2008-33).
1. Antes de iniciar a dissociação celular e a classificação celular
- Rotule três tubos de reação de 15 ml com: Lavagem (W), Fração positiva (+) e fração negativa (-).
2. Dissociação da retina
- Decapitar os filhotes PN 4 usando uma tesoura.
- Enxágüe a cabeça dos filhotes em pouco tempo em 70% de etanol seguido de lavagem na PBS.
- Transfira a cabeça para o HBSS frio e enuclear o olho (repita este passo para todas as cabeças). Para enuclear, abra as pálpebras e fixe o olho com fórceps curvos na região do nervo óptico. Em seguida, puxe o olho cuidadosamente para fora da órbita.
- Depois de enuclear todos os olhos, isole a retina: introduza uma tesoura fechada no nervo óptico e abra as lâminas. Peal o RPE/chorid para fora. Remova as lentes e vasos sanguíneos usando fórceps curvos.
- Transfira as retinas isoladas para um tubo de reação de 1,5 ml contendo a solução papain (fornecida pelo kit de dissociação papain).
- Incubar as retinas na solução papan por 30-60 min em um banho de água ou shaker (400 rpm) a 37 °C.
- Enquanto as retinas incubam na solução papain, pipeta 1 ml de solução ovomucóide para um tubo de reação de 15 ml (rótulo "1").
- Adicionar 60 μl de DNase I (10 mg/ml) + 60 μl de solução ovomucoid (fornecida pelo kit) + 520 μl de EBSS a um tubo de reação de 15 ml (rótulo "2").
- Após a incubação do papain, transfira a solução de papain contendo as retinas parcialmente digeridas para o tubo de reação "2".
- Usando uma pipeta polida de fogo, realize a dissociação mecânica (10x para cima e para baixo).
- Pipeta a suspensão de célula única ao tubo de reação "1". Tente gerar 2 camadas colocando suavemente a suspensão da célula em cima da solução ovomucoid.
- Centrífuga por 5 min a 300 x g (aproximadamente 1.300 rpm).
- Descarte o supernatante e resuspenque as células em 500 μl de tampão MACS.
3. Classificação celular usando classificação celular associada magnética (MACS)
- Adicione o anticorpo anti-CD73 de rato X μl aos 500 μl, a fim de alcançar uma concentração final de 10 μg/ml.
- Incubar 5 minutos no gelo.
- Encha o tubo de reação de 15 ml a 10 ml com tampão MACS e centrífugue por 5 minutos a uma velocidade de 300 x g.
- Remova o supernatante.
- Resuspenque a pelota em 480 μl de tampão MACS e adicione 120 μl de microesferas IgG anti-rato de cabra.
- Incubar 15 min no gelo; não agitar, agitar ou misturá-lo.
- Encha o tubo de reação de 15 ml a 5 ml com tampão MACS e centrífugue por 5 min a 300 x g.
- Como o tubo de reação é centrifuado:
- Ajuste uma coluna LS no suporte magnético.
- Coloque o filtro de pré-configuração em cima da coluna LS.
- Hidrate o filtro de pré-esparação e a coluna LS com tampão MACS de 3 ml e colete o tampão MACS no tubo de lavagem (W).
- Remova o supernatante.
- Resuspenda a pelota em 500 μl tampão MACS.
- Carregue a suspensão celular de 500 μl no filtro e adicione 1 ml de tampão MACS ao filtro e colete a fração negativa no tubo de reação de fração negativa (-).
- Em seguida, adicione 3 x 3 ml de tampão MACS à coluna para lavar as células que não estão ligadas à coluna
- Uma vez que estes 9 ml estejam através da Coluna LS, remova a coluna do suporte magnético e instale-a em cima do tubo de reação de fração positiva (+).
- Carregue rapidamente 5 ml de tampão MACS na coluna LS e coloque o êmbolo na Coluna LS e pressione-o até que todo o buffer esteja através da coluna.
- Centrifugar o tubo de reação contendo a fração positiva por 5 min a 300 x g.
- Remova o supernatante, resuspenda em 500 μl de tampão MACS e mantenha a 4 °C.
- Conte a quantidade total de células usando um dispositivo comum de contagem de células.
- Prepare uma suspensão celular a partir da fração classificada positiva contendo 2 x 105 células/μl no buffer MACS e mantenha a 4 °C
4. Transplante de células precursoras do fotoreceptor classificados pelo MAC na Retina do Rato
- Certifique-se de ter todas as seguintes soluções prontas: 1 ml de PBS ou HBSS estéreis, 10 μl DNAse I, 1-2 ml estéril desionizado H2O, alíquotas das frações de suspensão celular a 4 °C.
- Anestesiar o camundongo adulto (ou seja, 2-4 meses de idade) com uma injeção intraperitoneal de cloridrato de medetomidina (0,01 mg/10 g de peso corporal), cetamina (0,75 mg/10 g de peso corporal). Em seguida, faça uma injeção subcutânea de Buprenorfina (0,05 mg/kg de peso corporal) para alívio da dor.
- Dilatar pupilas com queda de Fenilefrino 2,5%-Tropicamid 0,5%.
- Fixar o mouse no suporte da cabeça do mouse e colocar sob microscópio estéreo.
- Aplique uma gota de gel vísico para evitar a secagem do olho.
- Faça um pequeno buraco na borda entre esclera e córnea (respectivamente ora serrata) usando uma agulha estéril de 30 G 1/2.
- Corte uma lâmina de cobertura comum em peças pequenas (aproximadamente 5 mm x 5 mm) usando uma caneta de diamante, coloque uma dessas peças em cima da córnea, permitindo visualização direta da retina.
- Lave a seringa microliter presterilizada várias vezes com água deionizada.
- Carregue a seringa microliter com 1 μl de suspensão celular, direcione a agulha tangencialmente através da conjuntiva e esclera e coloque sob controle visual na metade nasal da retina.
- Faça um furo suavemente na retina até chegar ao espaço subretinal, injete a suspensão da célula no espaço subretinal.
- Observe o descolamento bolhoso da retina, que deve ser uniforme, cobrindo aproximadamente 1/4 do espaço da retina sem qualquer sangramento.
- Retire a seringa suavemente, o orifício da retina sela automaticamente.
- Lave a seringa microlitera várias vezes com água deionizada.
- Solte o mouse do suporte da cabeça.
- Acorde o rato injetando cloridrato de atipamozole para reversão do efeito de cloridrato de medetomidina.
- Coloque o mouse para acordar na câmara escura quente (aproximadamente 25 °C).
- Nos próximos 2 dias após o transplante, a Buprenorfina (0,05 mg/kg de peso corporal) deve ser administrada por injeção subcutânea pela manhã e à tarde para alívio da dor.
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Resultados
Para avaliar a capacidade dos fotorreceptores de haste de integrar-se à retina do rato, foi utilizada uma linha de repórteres de camundongos, na qual o GFP é impulsionado pelo zíper de leucina de retina neural (Nrl, Nrl-GFP) promotor11. Nrl é o marcador mais antigo de fotorreceptores de vara iniciando sua expressão em E12.5 durante toda a idade adulta, permitindo uma rotulagem específica de células fotorreceptoras de vara de doador.
PN 4 Filhotes de NRL-GFP foram decapitados e olhos...
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Discussão
O transplante subretinal de células precursoras fotorreceptoras representa uma ferramenta confiável para alcançar a integração dessas células sensíveis à luz em retinas hospedeiras em números significativos1,2. Isso pode permitir o estabelecimento de uma terapia celular para o tratamento de doenças degenerativas da retina no futuro6. A população de doadores de células, atualmente isoladas das retinas PN 4, é uma mistura de diferentes tipos de células, das quais apenas as células precursoras do fotoreceptor se integram a...
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Gostamos de agradecer a Anand Swaroop por fornecer ratos NRL-GFP, Jochen Haas para suporte técnico, e Sindy Böhme e Emely Lessmann pela criação animal.
Este trabalho foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - Centro de Terapias Regenerativas Dresden, o Programa de Concessão de Sementes crtd, o SFB 655, e o ProRetina e.V. fundação, o Programa de Pós-Graduação DIGS-BB Dresden, e a Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sistema de dissociação de papaína | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | DNase I fornecido não é usado no método |
| Rato purificado anti-rato CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Concentração de estoque 0,5 mg/ml |
| Cabra Anti-Rato IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Volume total de 2 ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Usado para contar o número total de células |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Usado para dissociação das retinas |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Usado para contar o número total de células |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | ||
| Domitor | Pfizer | 76579 | |
| Cetamina 10% | Ratiopharm | 7538843 | |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | |
| Fenilefrina 2,5%-Tropicamida 0,5% | Farmácia University Clinics Dresden | ||
| Filtros de pré-separação | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separador | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Vidro polido a fogo Pasteur | pipeta Marca | 74777 20 | A pipeta' As pontas precisam ser polidas a fogo e autoclavadas. |
| Suporte para tubos MACS de 15 ml | Miltenyi | 130-091-052 | |
| Câmara de contagem de células | Carl Roth | T728.1 | |
| Tubos estéreis de 15 ml | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | pode ser usado em vez de Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | pode ser usado em vez de Leica M651 MSD |
| Microscópio estéreo invertido Olympus CKX41 | Olympus | CKX41 | |
| Capuz de cultura de células Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo Scientific | 51025411 | |
| reação de 1,5 ml | Sarstedt | 727706400 | |
| 2 ml | Sarstedt | 72695 | |
| Centrífuga Eppendorf 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | |
| Suporte de cabeça de mouse | myNeurolab | 471030 | |
| BD Microlance 3 30 G 1/2 in | BD Seringa de microlitro Pharmingen | 304000 | |
| Hamilton 5 µ l, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | entregue sem agulhas |
| Agulha especial Hamilton RN 34 G | Hamilton | 065-207434 | Sem corte, 12 mm de comprimento |
| Vannas-Tü Tesoura de Mola bingen - Lâminas de 5 mm Retas | Ferramentas de Ciência Fina | 15003-08 | |
| Dumont #7 Fórceps - Titânio Ferramentas | de Ciência Fina | 11272-40 | |
| Caneta de diamante | Tools-tech | ||
| 15 mm x 15 mm Capa de lama | Faíscas | MIC3366 |
Referências
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- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).
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- Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
- Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).
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Reimpressões e permissões
