O uso de chips microfluídicos para Imagens ao vivo e estudo das respostas Lesão em Drosophila Larvas

Resumo

Larvas de Drosophila são um sistema modelo atraente para geração de imagens ao vivo devido à sua cutícula translúcido e genética poderosas. Este protocolo descreve como utilizar um dispositivo de PDMS de camada única, o chamado "chip larva 'para geração de imagens ao vivo de processos celulares dentro de neurônios do 3 ^º instar as larvas Drosophila.

Resumo

Imagens ao vivo é uma técnica importante para o estudo de processos biológicos celulares, no entanto, isso pode ser um desafio em animais vivos. A cutícula translúcida da larva Drosophila o torna um organismo modelo atraente para estudos de imagem ao vivo. No entanto, um desafio importante para as técnicas de imagem ao vivo é imobilizar e posicionar um animal no microscópio de forma não invasiva. Este protocolo apresenta um método simples e fácil de usar para a imobilização e imagem larvas Drosophila em um polidimetilsiloxano (PDMS) dispositivo micro, o que chamamos de "chip larva. O chip larva é composta por uma microcâmara de PDMS-encaixe perfeito que está ligada a uma lamela de vidro fina, que, aquando da aplicação de um vácuo através de uma seringa, para imobilizar o animal e traz estruturas ventrais, tais como o cabo de nervo, nervos segmentais, e corpo músculos da parede, próximo à lamela. Isso permite que imagens de alta resolução, e mais importante, evita o uso de anesthetics e produtos químicos, o que facilita o estudo de uma ampla variedade de processos fisiológicos. Uma vez que as larvas recuperar facilmente a imobilização, que pode ser facilmente submetido a múltiplas sessões de imagem. Isto permite estudos longitudinais mais cursos de tempo variando de horas a dias. Este protocolo descreve passo-a-passo como preparar o chip e como utilizar o chip para imagens ao vivo de eventos neuronais no 3 ^º larvas. Estes eventos incluem o rápido transporte de organelas em axônios, respostas de cálcio por lesão, e os estudos de lapso de tempo do tráfico de proteínas foto-conversível em longas distâncias e escalas de tempo. Outra aplicação do chip é estudar regenerativa e respostas degenerativas lesão axonal, por isso, a segunda parte deste protocolo descreve um procedimento novo e simples para ferir axônios dentro de nervos periféricos por um esmagamento do nervo segmentar.

Introdução

A mosca da fruta, Drosophila melanogaster, tem sido utilizada como um organismo modelo para mais de 100 anos, e tem-se revelado fundamental na definição de sinalização fundamental e as vias de desenvolvimento que são conservados a partir de invertebrados para humano. Imagens ao vivo é uma abordagem importante para o estudo dos mecanismos celulares, eo plano corporal simples e cutícula translúcida da larva Drosophila torna um sistema atraente para geração de imagens ao vivo, especialmente porque há muitas ferramentas genéticas disponíveis para expressar proteínas fluorescente etiquetado em tipos específicos de células.

Um desafio importante para as técnicas de imagem ao vivo é imobilizar e posicionar um animal para microscopia de forma não invasiva. Abordagens de imobilização convencionais incluem a dissecção ^1,2 ou a utilização de clorofórmio, as quais matam o animal. Os anestésicos éter ⁴ e isofluorano ^5-8 também têm sido utilizados. Embora os anestésicos proporcionar muitas vantagens, Eles também inibem a atividade neural e fisiologia importante (incluindo o coração) ^9-11, portanto, pode afetar o processo de estudo e criar stress no animal. Também há preocupações de segurança humanos para trabalhar com éter e isofluorano.

Nós desenvolvemos um método livre de drogas para imobilizar larvas Drosophila em um único dispositivo micro camada de PDMS, que chamamos de "chip larva ^'12. Este protocolo irá descrever como obter ou fazer o chip larva, e como utilizá-lo para imagens ao vivo no início de encenou larvas 3 ^º. O chip é composto de um microcâmara confortável-encaixe, que, aquando da aplicação de um vácuo através de uma seringa, imobiliza o animal por meio de força mecânica suave. O método de imobilização traz estruturas ventral como o cordão nervoso, os nervos segmentares e músculos da parede do corpo, nas proximidades de uma lamela de vidro. Isso permite que imagens de alta resolução de tais estruturas com alta aper numéricatura objetivos (alta ampliação).

Vantagens do chip larva sobre outras técnicas convencionais incluem o seguinte: (i) O uso do chip larva substitui o uso de produtos químicos, permitindo a visualização in vivo dos animais não anestesiados. (Ii) As larvas se recuperar imediatamente após o lançamento do chip (em contraste com um período de recuperação de 2 horas para isofluorano ^8,13). Isto permite uma imagem em escalas de tempo grandes, que variam de milissegundos a minutos, a horas e dias. (Iii) A utilização de PDMS, o que é um material permeável ao gás, permite a difusão contínua de oxigénio / ar do ambiente para dentro do corpo da praga. (Iv) O chip é fácil e seguro de usar, e (v) é reutilizável e pode ser fabricado a um custo mínimo.

Além de instruções para usar o chip de larva, este protocolo prevê vários exemplos de seu uso para estudar eventos neuronais no 3 ^º larvas. Estes incluem imagens ao vivo de Axonal transporte, as respostas de cálcio por lesão, e os estudos de lapso de tempo do tráfico de proteínas foto-conversível em longas distâncias e escalas de tempo.

Outra aplicação do chip é para estudar as respostas neuronais a lesão axonal. Por este um procedimento adicional é descrito (em parte 3) para ferir os axônios dentro nervos periféricos por um esmagamento do nervo segmentar. Este ensaio simples pode ser realizada tanto de forma rápida e reprodutível sob um estereomicroscópio dissecção padrão, o que permite que muitos animais a serem tratados ao mesmo tempo. As respostas celulares à lesão pode ser estudada por imagens ao vivo no chip larva.

Protocolo

1. Fazer o Chip PDMS

Para fazer com que um chip de PDMS do molde SU-8, siga os passos de 1,1-1,7. Se um chip é na mão, mas precisa montado para uso, pule para o passo 1.8.

1. Misture 45 g de base de PDMS e 4,5 g de agente (proporção 10:1) a cura de um kit de PDMS em um pequeno recipiente de plástico descartável e misture-os cuidadosamente, com uma vareta de plástico.
2. Colocar o recipiente num recipiente de vácuo (por exemplo, um secador) durante 10 minutos para remover quaisquer bolhas.
3. Coloque o molde SU-8, na parte inferior de um diâmetro de 150 mm de prato plástico e verter lentamente a mistura de PDMS no molde. Tome cuidado para não gerar bolhas ao derramar o PDMS.
4. Curar o PDMS no forno (ou um incubador) a 650 ° C durante 4 h.
5. Retire o molde PDMS/SU-8 curado do forno e deixe esfriar por alguns minutos.
6. Usando uma lâmina de barbear, cortar o PDMS curados ao longo da borda do molde SU-8 e retirá-la da SU-8 molde.
7. Divida a laje PDMSPDMS em fichas individuais, usando uma lâmina de barbear.
8. Usando uma agulha de distribuição de 21 L, fazer um buraco na porta de vácuo (ilustrado na Figura 1A) do chip de PDMS.
9. Dê uma distribuição agulha 23 G e torça a ponta da agulha de sua base algumas vezes para quebrar a agulha ponta fora do cubo de bloqueio.
10. Inserir a agulha da ponta 23 L em um pequeno pedaço de tubo de polietileno de modo a que o tubo de cobre, pelo menos, um milímetro da agulha. Em seguida, utilizar uma lâmina de barbear para cortar o excesso de tubo para longe da agulha. Isto cria um anel de plástico em torno de uma extremidade da agulha, o que vai criar um selo, quando inserido na porta de admissão de vácuo.
11. Para uso com um microscópio invertido (Figuras 1B e 2A-B): inserir a ponta de agulha 23 G no orifício do canal de vácuo. Para uso com um microscópio vertical (Figuras 1C e 2C-D): picar um segundo furo no lado do chip PDMS com uma dispe 21 Lnsing agulha, o buraco vai fornecer acesso para o primeiro buraco do lado. Em seguida, insira a agulha ponta 23 G com anel de tubulação no orifício lateral. Coloque um pedaço de fita adesiva de dupla face sobre a parte superior do chip PDMS para vedar o orifício superior (Figura 1C).
12. Pegue um pedaço de tubo de polietileno que é de aproximadamente 20 cm de comprimento. Conectar um lado do tubo para a ponta da agulha que é inserida dentro do orifício de vácuo.
13. Conecte o outro lado da tubulação para uma das portas de uma válvula de 3 vias (ver '3-way torneira 'na lista de materiais)
14. Anexar uma seringa de 20 ml em uma das duas portas restantes. A última porta é aberta para o ambiente.

2. Usando o Chip Zergling de Imagens ao vivo

1. Limpe o chip PDMS com fita adesiva transparente. Fixe um pedaço de fita para o fundo do chip. Verifique se a fita está tocando toda a superfície de PDMS e, em seguida, retire a fita.
2. Repita o passo acima de 2 a 3 vezes para garantir que nãoexistem partículas de óleo (ou retidos a partir de experiências anteriores) sobre a superfície do chip PDMS. Uma vez que o chip PDMS é reutilizável, isto é muito importante para remover os resíduos de óleo, uma vez que podem afectar a adesão do PDMS de vidro e resultar em selagem inadequada.
3. A transferência precoce (isto é forrageamento) larvas 3 ^º a uma placa de Petri contendo água. (O ^rd larvas fase A alimentar 3 instar são os alimentos, ao invés de a parede do frasco de cultura). Lavar os larvas em água para remover o meio de cultura.
4. Dê uma lamela de vidro limpa e coloque uma pequena gota de óleo halocarbônico 700 em seu centro.
5. Utilizando uma pinça, escolher com cuidado um limpo, early-encenado 3 ^º instar larva da água (a larva deve ser ~ 3,5-4 mm de comprimento). Colocar o animal brevemente em um leve limpa ou papel toalha para remover o excesso de água, e, em seguida, coloque-o sobre a queda do petróleo. A redução deve ser suficientemente pequeno de tal modo que a traqueia de larvas não são revestidos. Deixe o sta larvay sobre a gota de óleo por 10 segundos.
6. Retire a larva da gota de óleo e, em seguida, coloque-o sobre uma lamela de vidro limpo.
7. Transfira a larva para outra lamela de vidro limpo. Esta etapa remove o excesso de óleo.
8. Preste atenção à orientação larva. For Imaging o cabo e os nervos segmentares neurais, o lado ventral de larva deve sentar-se na lamela. Seu lado dorsal, caracterizada por dois tubos traqueais longitudinais, deve estar voltado para cima. Nota: esta é a orientação da larva prefere naturalmente.
9. Suavemente colocar o chip PDMS no topo da larva. A larva deve estar alinhado ao meio centro da MicroChamber, com a cauda voltada para a porta de vácuo. Tenha cuidado para que a larva não toque nas bordas da câmara. Isto é especialmente importante para os terminais anterior e posterior da traqueia. Nota: este passo é o melhor feito sob microscópio estereoscópico.
10. Empurre o chip PDMS contra a lamela de vidro para conseguir uma boa vedação. Certifique-se de que a larva é totalmentedelimitada pela MicroChamber quando o chip PDMS está tocando a lamela de vidro.
11. Alternar a válvula de 3 vias em tais que a seringa pode extrair o ar da microcâmara de PDMS (através da tubagem) para criar um vácuo.
12. Com uma mão, segure a lamela chip de PDMS / vidro com firmeza. Use a outra mão para puxar o êmbolo da seringa. Retire 2-2,5 ml de ar, até sentir resistência no punho seringa, para criar vácuo. O vácuo produz um vedante estanque entre o chip de PDMS, óleo, e interfaces de lamela e restringe a mobilidade da larva.
13. Alternar a válvula de modo a que o chip PDMS é isolado a partir da seringa e do ambiente. Como resultado, o nível de vácuo relativamente estável é mantida na microcâmara, sem a necessidade de segurar o êmbolo da seringa.
14. Verifique a larva sob o estereoscópio para certificar-se que a totalidade do corpo do animal é colocado no interior da microcâmara, e que o animal permanece imóvel. A traquéia deve ser visível. O resto doChip de PDMS deve estar em contato com a lamela. Nota: Ver Figuras 2E e 2F para exemplos de animais corretamente imobilizadas no chip. Algumas orientações incorretas são mostrados nas Figuras 2G e 2H.
15. Colocar o chip larva (chip PDMS + lamela de vidro) sobre o microscópio. O chip de larva, a tubulação ea seringa deve ser manuseado com cuidado para evitar desprendimento do chip PDMS da lamela. Para um microscópio vertical, fixe o lado 'top' do chip para o palco microscópio com fita dupla face (Figura 1C).
16. Utilize uma objectiva de grande ampliação (de imersão em óleo, 40-63X é recomendado) para localizar a estrutura (s) do animal de interesse e realizar a imagem. Em alguns casos, um aumento inferior pode ser necessária para identificar a região desejada para imagiologia antes de mudar para uma ampliação maior.
17. Quando imagem está completado, libertar o vácuo pela comutação da válvula para a posiçãoque é aberto para o ambiente.
18. Retire o chip PDMS da lamela. A larva deve ser imediatamente móveis.
19. Fórceps para remover a larva da microcâmara e colocar gentilmente a larva em uma placa de agar de uva-suco para recuperação.

3. Induzir uma lesão do nervo esmagamento de nervos larval segmentares

1. Siga o passo 2.3 para isolar cedo encenado 3 ^ª larvas do genótipo desejado. Tal como descrito no passo 2.3 banhar as larvas em água para remover o alimento.
2. Use uma mosca CO ₂ estação anesthetization padrão, com CO ₂ pad mantidos sob um microscópio estereoscópico dissecação, para subjugar as larvas. As larvas devem se tornar immotile após a colocação em CO ₂ pad para 1-2 min.
3. Agora coloque uma única larva anestesiado em uma placa de ágar suco de uva sob o microscópio estereoscópico. Vire animais lado ventral até visualizar o cordão nervoso ventral e segmentar os nervos através da cutícula ( Figura 3). Certifique-se de que a larva é completamente imóveis.
4. Usando Dumostar número 5 fórceps, beliscar os nervos segmentares firmemente através da cutícula para 5-10 seg. Quando isto é feito correctamente, a cutícula permanece intacta e a parede do corpo não é perfurada. Nota: A lesão pode ser realizada em diferentes posições ao longo do eixo ântero-posterior do corpo, enquanto o cabo de nervo ventral, glândulas salivares, intestino e não está danificado. O local da lesão é mais eficaz para o fim do segmento abdominal 3 ^rd, como mostrado na Figura 3D. Lesão neste local danos a maioria dos nervos e é o mais fácil de se reproduzir sem matar o animal.
5. Após a lesão, gire o animal para que seu lado ventral para baixo a placa de uva. Ele deve ser capaz de mover a cabeça e comer. Se a lesão foi bem sucedida, então a metade posterior da larva será paralisado.
6. Manter os animais feridos na placa de ágar suco de uva a 25 e# 176; C para o tempo desejado de acordo com o objetivo experimental. Para motoneurônios, o coto proximal começa a brotar dentro de 8-10 horas de lesão ^14, e do coto distal começa a degenerar dentro de 6-8 hr ^15. Para a classe IV da neurônios sensoriais, o coto proximal começa a brotar dentro de 4-6 horas, eo início do coto distal a degenerar dentro de 3-4 horas após a lesão. Nota: com drivers adequados Gal4 e repórteres fluorescentes, o surgimento e degeneração pode ser observado no chip larva (por exemplo, ver a Figura 6).

Resultados

O chip larva é composta por um único bloco de camada de PDMS, (um chip PDMS), cujo desenho é apresentado no esquema na Figura 1. (Veja também o arquivo suplementar DXF para projetar seu próprio molde). A microcâmara de larva, a porta de vácuo, e os canais de perímetro (Figura 1A) são 140 mM recortes no chip de PDMS. A ficha é posicionada na parte superior de um dos primeiros estágios 3 larva ^terceiro instar, que assenta no topo de uma lamela com óleo (Figuras 1B e 1 C). A interface óleo-vidro entre a lamela e chip PDMS permite uma vedação para ser criada por aplicação de um vácuo suave. Esta vedação retém as larvas no interior da câmara, e uma vez que o início encenado ^3o estádio de larva é ligeiramente mais espessa do que a câmara, a câmara de selagem cria alguns constrição física no animal, de forma eficaz imobilizante e limitando o seu movimento. Neste estado imobilizada, certo ventralestruturas do corpo, como o cordão nervoso ventral e segmentar são empurrados perto de lamela. Isso é vantajoso para a imagem latente, uma vez que no estado imobilizado estas estruturas podem estar dentro da distância de trabalho de 40X e 63X objetivos. Depois o vácuo é liberado, a larva possa ser facilmente removido da microcâmara, permitindo experiências adicionais a serem executadas. Esta abordagem imobilização puramente mecânico pode manter 90% de larvas vivas, após períodos de imobilização contínuas de até 1 hr ^12.

O vácuo é criado através de uma simples seringa de 20 ml, por conseguinte, todo o aparelho é fácil de transportar de um microscópio estereoscópico, onde o posicionamento da câmara é realizada, de um microscópio confocal ou epifluorescência, onde imagens ao vivo é executada. A seringa é ligada à porta de vácuo através de tubos de polietileno e 23 g de agulhas de distribuição (com cubos de bloqueio removidos), tal como descrito nos passos 1,6-1,14. Para microscópios invertidos, a tubageme seringa estão ligados através do topo do chip (Figuras 1B, 2A, e 2 B). Para microscópios verticais, que são ligados através de uma porta do lado do chip (Figuras 1C, 2C, e 2 D). A configuração para microscópios invertidos é um pouco mais fácil de usar. A seringa é puxado para criar um vácuo suave (cerca de 10 psi), que se liga a interface óleo-de vidro e de PDMS, para formar uma vedação estanque entre a lamela e o dispositivo de PDMS, captura e imobilizando-a larva no interior da câmara.

A colocação da larva na microcâmara (passos 2,7-2,10 no protocolo) é crítica para a imobilização efectiva e sobrevivência (Figuras 2E-H). Se o animal é demasiado grande para a câmara, (Figura 2G), ou se a sua cabeça ou traqueia fiquem presos entre o bordo da câmara e as tampaslábio (Figura 1H), então é improvável sobreviver ao processo.

A seguir estão vários exemplos do uso do chip larval para estudar várias respostas celulares nos neurônios (Figuras 4-7, S1 e S2 Filme Filme).

Imagem de transporte axonal rápido: O chip larva foi usado para a imagem do transporte mediado por kinesin das vesículas sinápticas dentro axônios periféricos individuais (Figura 4 e S1 Filme) O anterógrada (~ 1,0 mM / seg) e retrógrada (~ 0,8 mM / seg. ) movimento dessas vesículas podem ser facilmente estudada a partir de filmes coletados em um microscópio confocal disco giratório.

Posicionamento do animal para microcirurgia a laser:. Uma dendrito do neurônio sensorial foi seccionado usando um laser de corante UV pulsada (Figura 5 e S2 Filme) Protocolos para o uso de tseu método de microcirurgia pode ser encontrada em outros lugares ^16,17. A técnica de imobilização eficiente permite mudanças rápidas de escala de tempo no neurônio feridos, tais como alterações de cálcio intracelular (detectadas pelo geneticamente codificado Ca ^{2 +} GCamp3.0 indicador ^18), a ser detectados e medidos (Figura 5).

Estudo das respostas regenerativas e degenerativas lesão: Se o animal é deixado em repouso entre as sessões de imagem, o chip de larva, então, ser usadas para estudar os eventos celulares que ocorrem durante uma grande variedade de intervalos de tempo. Por exemplo, tanto 'regenerativo' e respostas degenerativas lesão axonal, que acontecem em uma escala de tempo de 15 horas, podem ser visualizados no chip larva (Figura 6). Neste exemplo, os axônios dos neurônios motores octopaminergic ficaram feridas através do esmagamento do nervo segmentar (Figura 3), descrito na parte 3 do protocolo. O coto proximal do axónio,que sofre nova brotação, e os axônios distais, que formam varizes e, em seguida, tornar-se fragmentado através do processo de degeneração Walleriana, pode ser trabalhada e estudada em diferentes intervalos de tempo após a lesão.

Acompanhando as proteínas fluorescentes photoconvertible ao longo do tempo in vivo: O desenvolvimento de proteínas fluorescentes, cuja fluorescência photoconvertible altera irreversivelmente após a exposição à luz UV) permite marcar especificamente um subconjunto de proteínas dentro de uma célula, e rastrear o destino das proteínas marcadas ao longo do tempo ^{19 , 20.} Esta técnica é mais frequentemente realizada em cultura de células, no entanto, com o chip larva se pode controlar as proteínas photoconvertible geneticamente codificados dentro de células definidas in vivo. Como um exemplo, mostra-se que a proteína de fusão Denda2-α-tubulina, expressa na classe IV da neurônios sensoriais, pode ser photoconverted em corpos celulares (Figuras 7A e B). O transporte das proteínas photoconverted pode ser rastreado ao longo do tempo: dentro de dois dias que poderíamos detectar uma quantidade significativa de proteínas photoconverted dentro dos terminais do axônio dos neurônios sensoriais, que se encontram ~ 1 milímetro de distância do local original no corpo da célula (Figuras 7A e 7, C).

Todos os exemplos descritos (Figuras 4-7 e Filmes S1 e S2) foram fotografadas usando um sistema confocal de disco giratório, que consiste de um scanner de Nipkow CSU10 e uma câmara EMCCD C9100-50, montado sobre um observador axio com 63X (1,5 NA) objetivo de óleo, e conduzido usando software de aquisição Volocity.

Figura 1. desenhos esquemáticos para usar o chip de larva.
(A) O chip larva é composta do chip PDMS, indicado em luz azul, aderida a uma lamela de vidro. O chip contém 140 mM canais microfluídicos grossas, indicados em branco. O MicroChamber central é projetado para caber confortavelmente um início encenado 3 ^º instar larva Drosophila (caricaturado em verde claro). Um arquivo DXF contendo dimensões exatas que podem ser usados ​​para projetar o molde é fornecido como dados complementares. Escala bar = 1,5 mm. (BC) colaterais vistas de esquemas para o carregamento de uma larva em um chip de larva. A larva fica lado ventral para baixo em uma lamela, e seu corpo se encontra dentro do 140 mM profundo MicroChamber. Uma seringa de 20 ml é ligado à porta de entrada de vácuo e é utilizado para induzir um vácuo suave. A interface óleo-PDMS-vidro halocarbônico está vinculado à vácuo em um selo apertado, o que restringe a larva no MicroChamber. Este selo é facilmente reversívelliberando a pressão a partir da seringa, após o que o animal recupere imediatamente motilidade. Para microscópios verticais (B), o vácuo da seringa é ligada através de tubos de polietileno-50 a partir do topo do chip. Para microscópios invertidos (C), estas ligações são feitas a partir do lado do chip, enquanto o "topo" do chip está ligado ao estágio de microscópio através de fita adesiva de dupla face.

Figura 2. Imagens de chips de PDMS e correto posicionamento da larva.
(AD). Fotografias mostrando PDMS chips para microscópios invertidos e verticais. A agulha 23 G de distribuição da ponta tenha sido inserido no orifício de vácuo, que permite a ligação por meio de tubos de vácuo (seringa). Barra de escala = 1,5 mm. (EH). Drosophila. imobilizado E e F mostram exemplos de animais corretamente imobilizadas. O animal menor em F é preferível se várias imagens em escalas de tempo (> 12 horas) será conduzida. G mostra um animal que é muito grande, e H mostra um pequeno animal que está mal posicionados. Barra de escala = 1,5 mm. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 3. Nerve lesão por esmagamento de nervos segmentares em larvas de Drosophila.
(A) dos desenhos animados do ensaio esmagamento do nervo. Os nervos segmentares numa ^rd 3 (B) Vista do sistema nervoso larval de um animal dissecado 20 horas após esmagamento do nervo. Imunomarcação para membranas neuronais com anticorpos anti-HRP (vermelho) destaca os lóbulos cerebrais, cordão nervoso ventral, e os nervos segmentares longas que contêm motoneuron e axônios dos neurônios sensoriais. Um subconjunto de neurônios motores individuais são marcadas pela expressão de UAS-mCD8-GFP (verde) a condução com o driver m12-Gal4. Os corpos celulares e dendritos de esses neurônios se encontram no cordão nervoso ventral, enquanto seus axônios projeto para músculos da parede do corpo através dos nervos segmentares. (Este controlador também dirige a expressão da GFP no músculo 12 para cada hemisegmento larvas, o qual em conjunto pode ser visto como listras antero-posterior em ambos os lados do animal). A região danificada pela queda é realçado com linhas pontilhadas azuis. Barra de escala = 70 m. (C) Feche acima das vistas dos axônios danificados, 20 horas após a lesão. À esquerda: oaxônio proximal sofreu brotando e novo crescimento. Direita: o axônio distal é fragmentado, com pouca GFP remanescente, devido à degeneração Walleriana e liberação de detritos. Barra de escala = 10 m. (D) As imagens do esmagamento do nervo em um início de 3 ^º instar larva. A seta vermelha aponta para o cordão nervoso ventral. A localização do esmagamento é em direcção ao fundo do terceiro segmento, como descrito no texto de protocolo (Protocolo 3). As imagens em D foram publicados originalmente em J. Cell Biol 191, 211-223, doi:.. 10,1083 (2010) Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 4. Time-lapse imagem do transporte axonal de vesículas sinápticas peptidérgicos. Arato peptídeo natriurético atrial ANF marcadas com GFP, UAS-GFP ^ANF-21, foi expressa dentro motoneurons específicas usando o driver eve-RRa-Gal4 ^22. Imagens ao vivo de nervos segmentares revela o rápido transporte de ANF-GFP rotulados vesículas peptidérgicos nos axônios. Veja também S1 Filme. (A) quadros individuais de axônios de motoneurônios de imagens de lapso de tempo ao vivo. Setas verdes, vermelhos e azuis indicam exemplos de anterógrada, vesículas estacionários e retrógrados, respectivamente. Escala bar = 5 mm. (A ') prazos individuais do filme foram fundidos usando ImageJ. (B) A quimógrafo gerada a partir de lapso de tempo de imagem do transporte ANF-GFP, foi gerada a partir de uma coleção de quadros individuais que medem um minuto de tempo de imagem usando o plug-in 'quimógrafo múltipla "para ImageJ ^23. (C) Quantificação de velocidades segmentais médios, que foram calculados a partir das encostas de vestígios segmentados em kymographs. A barra verde apresents velocidade anterógrada segmentar (n = 543) ea barra azul apresenta velocidade retrógrada segmentar (n = 548) de vesículas de 10 kymographs. (D) Quantificação da densidade de partículas. Densidade de partícula foi medido pelo número de anterógrada (mostrado na barra de verde), partículas estacionário (mostrado na barra vermelha) e retrógradas (mostrado em azul bar) por 100 mm de comprimento a partir de 10 kymographs axónio. Os dados desta figura também foram publicados anteriormente em Ghannad-Rezaie et al, PLoS One 7 (1), e29869, doi:. 0.1371/journal.pone.0029869 (2012).

Figura 5. O uso do chip de larva para microcirurgia laser e imagens de cálcio.
A dendritos de um neurônio sensorial Classe IV é seccionado por com pulsos de alta potência de laser de um laser de corante UV pulsada. Os protocolos para a utilização deste método para microcirurgia podem ser encontradas em outros lugares ^16. A imobilização eficaz no chip larva permite mudanças rápidas nos níveis de cálcio intracelular a ser estudados por imagens ao vivo. Neste exemplo, o indicador GCaMP3.0 cálcio geneticamente codificado foi expressa na Classe IV dendrítica arborização (C4da) neurônios sensoriais utilizando o driver PPK-Gal4. (A) imagens de lapso de tempo de intensidade GCaMP3.0 eram falsas coloridas de acordo com a cor escala de intensidade para indicar as mudanças de intensidade ao longo do tempo. Quadros individuais foram extraídas de um filme de lapso de tempo (S2 Filme) fotografada em um microscópio confocal disco giratório em 5 frames / seg. (B) Quantificação da dinâmica do cálcio em resposta a microcirurgia laser. A mudança de dobragem normalizada de soma GCaMP3.0 intensidade de fluorescência (ΔF/F0) de neurónios individuais foi representada graficamente contra o tempo (n = 7, mostrado a cinzento). O ΔF/F0 média foi representado em laranja. Observou-se o aumento da intensidade de pico GCaMP3.0 entre 1-2 seg após a lesão. Fundo foi subtraída a partir da intensidade de fluorescência L-CaMP3.0 cru. Os dados desta figura, também foram publicados anteriormente na Ghannad-Rezaie et al, (2012) PLoS um 7 (1):. E29869. doi: 10.1371/journal.pone.0029869 ^12.

Figura 6. Imagem axonal surgimento e degeneração usando o chip de larva. Imagens confocal representativas do coto proximal (esquerda) e coto distal (direita) de axônios de motoneurônios octopaminergic em diferentes momentos após o esmagamento do nervo. As imagens foram tiradas em locais similares, como mostrado na Figura 3C. Estes neurónios estão marcadas por expressão de um transgene de UAS-mCD8-RFP condução utilizando o Tdc2-Gal4 ^24,25 condutor. Os corpos celulares para esses neurônios se encontram no cordão nervoso ventral ^24. Três axónios individuais podem ser vistos no interior de um único nervo segmentar, e são facilmente resolvida a partir de uma outra. Esta é uma situação ideal para o estudo de eventos celulares individuais, tais como a fragmentação de axónios em degeneração, a qual está completa dentro de 15 horas para estes neurónios. As imagens foram obtidas a partir de animais vivos usando o chip larva em 63X de ampliação em um microscópio confocal disco giratório. Barras de escala = 10 mm para painéis da esquerda (tocos proximais) e 20 mm para painéis à direita (tocos distal). Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 7. Usando a larvachip para rastrear proteínas fluorescentes photoconverted mais longos tempos e distâncias em animais vivos.
Neste exemplo, uma proteína de fusão da proteína fluorescente photoconvertible Dendra2 ^19, fundido com α-tubulina, é expressa a partir de um transgene-UAS-Dendra2 α-tubulina na Classe IV arborização dendrítica (C4da) neurónios sensoriais, utilizando o controlador ppk-Gal4 ^26. (A) Esquema do experimento fotoconversão. Os corpos celulares dos neurónios C4da encontram na periferia e estendem axónios através de nervos segmentares para formar terminais sinápticos no cordão nervoso. O Dendra2-α-tubulina dentro de um subconjunto de corpos celulares na metade posterior do animal é sujeito a fotoconversão por iluminação UV durante 6 seg usando um filtro de DAPI padrão com lâmpada de Hg (animados esquerda). Depois de um tempo, o photoconverted Dendra2-α-tubulina pode ser detectado nos terminais sinápticos no cordão nervoso ventral. Isto indica que a proteína tubulina foi tranostentou a uma grande distância (de ~ 1-2 mm). Imagens em escala de bar = 1 mm (B) exemplo de Dendra2-α-tubulina em um corpo celular do neurônio sensorial classe IV antes e depois fotoconversão. Barra de escala = 5 mm. (C) imagens de exemplo de terminais sinápticos para a classe IV neurônios sensoriais em ambas 0 h ou 48 h após fotoconversão dos corpos celulares. O aspecto específico da photoconverted Dendra2-α-tubulina nos terminais sinápticos após tempo implica que a proteína percorrida a partir do corpo celular axonal de terminal. Fotoconversão e imagem em todos os pontos de tempo foi realizada no chip de larva. Escala bar = 15 mm. Clique aqui para ver imagem ampliada.

S1 Filme. microcirurgia laser e de imagem de cálcio de um neurônio C4da. Um laser UV pulsada foi usado para um transecto primramo dendríticas ary. Transecção Laser induzido um aumento rápido na GCaMP intensidade, que se iniciou no local da lesão e viajou para o corpo celular. UAS-GCaMP3.0 ¹⁸ foi expressa usando o C4da específico motorista PPK-Gal4 ^26. Os filmes eram falsas colorida para indicar os níveis de intensidade relativa de GCaMP3.0. A imagem time-lapse foi realizada com microscopia confocal disco giratório em 5 frames / seg.

S2 Filme. transporte axonal rápido da ANF-GFP em neurónios motores.
O rato peptídeo natriurético atrial ANF marcadas com GFP, UAS-GFP ^ANF-21, foi expressa dentro motoneurons específicas usando o driver eve-RRa-Gal4 ^22. O transporte destes vesículas peptidérgicas dentro nervos segmentares larvais foi fotografada no chip larva em 300 ms / quadro usando um disco rotativo do microscópio confocal.

Suplementar Figura 1 (arquivo DXF)
DXF para a fabricação de moldes de silicone. O arquivo foi criado para máscara de fotorresiste negativo (máscara arquivado escuro para SU-8) em uma pastilha de silício de 4 polegadas. A segunda linha contém 5 moldes para fazer os chips larva utilizados neste protocolo. Cada uma dessas fichas (na linha 2) contém uma câmara de ~ 5,4 milímetros x 1,5 mm projetado para caber numa fase inicial 3 ^º instar larva. A primeira linha (linha 1) contém uma câmara maior (~ 5,4 milímetros x 2 mm), enquanto que a terceira linha (linha 3) contém uma câmara mais pequena (~ 4,4 milímetros x 1,5 milímetros). Estes podem ser utilizados com larvas de tamanhos maiores e menores, respectivamente. Barra de escala = 2 mm.

Discussão

Fazer ou obter o chip larva:

O chip larva consiste num bloco de PDMS (denominado o "chip PDMS ') ligado a uma lamela de vidro. O protocolo no passo 1 descreve o procedimento para fazer e usar chips de larva, assumindo um molde de SU-8 está disponível. O molde SU-8 é microfabricados por photolithographically padronização uma espessa camada de SU-8 photoresist 140 mM em uma pastilha de silício (para detalhes, ver ¹² Ghannad-Rezaie et al.). Como a microfabricação do molde SU-8 exige o acesso a equipamento especializado, recomendamos requisitá-lo a partir de uma instalação de microfabricação (por exemplo. A facilidade LNF na Universidade de Michigan ^14), ou a partir de uma fundição, enviando-lhes o design de chips que é fornecido como arquivo suplementar. Se alguém deseja mudar o design do chip PDMS (por exemplo, para uso com larvas de diferentes tamanhos), um software CAD que lida com arquivos DXF (ex. Autocad) pode ser usado. Uma SU-8 molde também pode ser feita em casa seguindo as instruções na Mondal et al. ²⁷ Muitos leitores podem achar que é conveniente para simplesmente obter um chip PDMS amostra para experimentar a técnica antes de fabricar seus próprios chips. Este será disponibilizado gratuitamente, mediante solicitação.

O uso do micro "chip larva" para imagens ao vivo:

O método de imobilização no chip larva evita a utilização de anestésicos, e envolve, em vez da pressão, através da aplicação de um vácuo, para restringir o movimento do animal. Enquanto os animais podem sobreviver imobilização no chip para várias horas ^{de 12,} um período curto de imobilização (5-15 min) é recomendado. Isso é tempo suficiente para a imagem de muitos eventos celulares de interesse, incluindo alterações de cálcio intracelular, ou transporte axonal rápido. Este também é o tempo suficiente para manipulações desejados em animais vivos, como base de laser microcirurgia, fotodegradação e photoconverSion.

Para estudar eventos longitudinalmente ao longo de um período de tempo maior em um único animal, os animais podem ser colocados no chip e fotografada várias vezes, separadas por períodos de repouso. Placas de ágar suco de uva são ideais para o descanso entre as sessões de imagem, uma vez que proporcionam uma fonte de alimento fácil e umidade. Várias sessões de imagem afetam a sobrevivência larval até certo ponto, uma vez que cada sessão acarreta alguns riscos para danificar o animal (ver parte 2 na solução de problemas, abaixo). Os animais podem ser rotineiramente fotografada> 5 vezes ao longo de dois dias, com uma taxa de sobrevivência superior a 50%. Uma vez que os animais não são anestesiados, são saudáveis ​​e móveis imediatamente após a libertação do vácuo no chip. Assim, não há necessidade de tempo de recuperação entre as sessões de imagem, de modo que o espaçamento de tempo entre as sessões é flexível e pode ser ajustada para os objetivos do experimento.

Solução de problemas:

A técnica mais comum éprocessa com chip de larva e soluções recomendadas são as seguintes:

(1) O animal está se movendo muito. Muita mobilidade pode interferir com os objetivos de imagem. As razões mais comuns para este no chip larva são a) o animal é muito pequeno para o chip, ou b) a pressão de vácuo aplicado durante a fase de imobilização está comprometida. O chip larva descrita neste protocolo é projetado para o início de encenou larvas 3 ^º. O tamanho ideal para o animal é 3,5-4 mm de comprimento (ao longo do eixo ântero-posterior). Para garantir que a pressão de vácuo é suficiente puxar a seringa 2-2,5 ml, ou até se sentir resistência no punho. Uma indicação de que o vácuo está em funcionamento é que pequenas bolhas no canal de perímetro pode ser visto movendo lentamente para a fonte de vácuo. Outra indicação é que a lamela deve sempre viajar com o chip quando o chip é levantada a partir do topo (e este é o método recomendado para o transporte da câmarauma vez que as larvas é posicionada e o vácuo é ligado). O vácuo pode ser comprometida se há fissuras no tubo, ou se houver óleo na tubagem. Isto pode ser facilmente resolvidas por substituição do 23 L de distribuição de ponta de agulha e de polietileno de 50 tubos (de passos 1,6-1,14).

(2) O animal morre depois de imagem no chip. O processo destina-se a causar o mínimo de stress sobre o animal, e animais de genótipo de tipo selvagem tem uma taxa de sobrevivência de> 90%, mesmo após uma hora de imobilização sobre o chip ^12. Uma vez que alguns genótipos podem ser menos resistentes ao estresse do chip, verifique primeiro que tipo selvagem animais (por exemplo, Canton S) sobreviver à técnica de imobilização. a) A causa mais comum para a letalidade é o posicionamento incorreto da larva (ver Figuras 2G-H). Se partes da cutícula, cabeça ou traquéia não são inteiramente dentro da câmara, então eles podem ser danificados durante a imobilização, e umalarva que é demasiado grande para o chip (> 4 mm) é menor probabilidade de sobrevivência. b) Uma causa menos comum para a letalidade é a utilização de um excesso de pressão ou de vácuo, quando o carregamento do chip. Quando posicionado adequadamente no chip, a pressão gerada pelo vácuo é bem tolerada. No entanto o excesso de pressão, quer do vácuo ou na fase inicial de posicionar o animal pode ser um problema. É melhor aprender o grau de pressão necessária empiricamente por testes com tipo selvagem larvas do tamanho correto. c) Se muito óleo halocarbônico cobre traquéia do animal o animal pode, potencialmente, ter problemas com a sobrevivência a longo prazo. O óleo desempenha vários papéis importantes no chip: é importante para a criação do vácuo, as ópticas durante o exame, e neutraliza a dessecação no chip. No entanto óleo excessivo deve ser evitado. (Isto pode também levar a óleo no tubo e seringa comprometer a vácuo). Os casacos protocolo sugerido apenas o lado ventral da larva com óleo, então removes excesso de óleo por colocação da larva em uma lamela limpa antes de se transferir para a lamela final para geração de imagens. d) fototoxicidade pode ser experimentado a partir da sessão de imagem. Como acontece com qualquer aplicativo de imagem ao vivo, é ideal para usar os tempos de exposição de curta duração, com baixa intensidade de luz laser, o que é melhor alcançada usando uma câmera de alta sensibilidade ou detector. Tentar minimizar iluminação com luz UV, incluindo a luz de amplo espectro criado por fontes de luz de Hg.

Outras questões e direções futuras:

Uma vez que este método não utiliza anestésicos, coração do animal continua a bater. Isso cria alguma mobilidade inevitável, o que afeta de imagem em alguns locais mais do que outros. Os exemplos aqui apresentados demonstram que o cabo ventral do nervo, nervos segmentais, e da parede do corpo pode ser facilmente trabalhada, sem a interferência do batimento cardíaco. Nos casos em que o batimento cardíaco afeta imagem, os movimentos regulares às vezes pode ser corrigido para comem software de análise (por exemplo, o Estabilizador de Imagem plugin para o ImageJ). Isso funciona bem quando os objetos individuais estão se movendo em uma escala de tempo rápido (por exemplo, ~ 1 mícron / seg para o transporte axonal rápido) ou em uma escala de tempo muito lento (minutos a horas). No entanto, quando o objecto (s) de interesse com o movimento de uma gama de velocidades e direcções, pode ser mais difícil de corrigir para os movimentos de batimento cardíaco induzido.

Outra questão é pequena variabilidade na óptica de animal para animal, ou entre várias sessões de imagem do mesmo animal no chip. Quanto mais profundo o objeto de interesse está dentro do animal, maior será essa variação será. Nervos segmentares e cordão nervoso ventral são normalmente muito profundo dentro de então animal para ser trabalhada em um microscópio regular. No entanto, a pressão moderada com experiência no chip de larva empurra estas estruturas muito próximo da cutícula e lamela. A distância exata destas estruturas da lamela terá pequenas variações de trial a julgamento. A variação para objetos fechar a cutícula, como os corpos celulares dos neurônios sensoriais, é menor. Por conseguinte, é importante, em particular para fazer as medições de intensidade, para utilizar um grande número de animais e ensaios independentes para explicar a variabilidade em óptica.

Enquanto os exemplos mostrados aqui têm-se centrado sobre os processos dentro dos neurônios, a abordagem deve ser passíveis de imagiologia qualquer estrutura no animal que pode ser trazido dentro da profundidade de focagem da objetiva do microscópio. Isto inclui a cutícula, músculos da parede do corpo, e seus NMJs. Traqueia no lado ventral do animal e, potencialmente, partes do tracto digestivo, também pode ser convertido em imagem. O animal pode igualmente ser posicionada com o lado dorsal para a lamela para imagiologia de curto prazo das estruturas perto da superfície dorsal. A capacidade de estruturas de profundidade da imagem dentro do animal é limitada pela distância de trabalho do objectivo microscópio utilizado. Estruturas como imdiscos aginal são inacessíveis para grande ampliação (por exemplo, 40x) objetivos.

Os chips larva descritos neste protocolo são projetados para as larvas no início da 3 ^ª etapa instar (que variam em tamanho 3,5-4 mm). No entanto, muitas questões interessantes exigem imagens em diferentes estágios larvais. Chips menores para acomodar 2 ^ª larvas instar, ou chips maiores para acomodar final 3 ^ª estádios podem ser facilmente projetados usando o mesmo princípio. (Figura Suplementar 1 contém um arquivo DXF facilmente modificável para fazer moldes de silicone com tamanhos de câmara alterados). O simples princípio da vedação reversível pode mesmo ser aplicado a outros microorganismos, tais como C. elegans ou peixe-zebra, com a variante principal é o tamanho da câmara. A futura direção útil é criar um chip que pode imobilizar muitos animais ao mesmo tempo, a utilização para fins de triagem. No entanto, para isso, o desenho teria de ser significativamente diferentea partir do dispositivo atual, em que as questões de posicionamento do animal em o chip precisa ser tratada por cada animal de forma independente.

O ensaio esmagamento do nervo para o estudo de respostas de lesões nos nervos periféricos das larvas:

O ensaio esmagamento do nervo descrito aqui para nervos segmentares larval é um método simples para a introdução de uma lesão axônios periféricos em Drosophila. As vantagens deste método são: a) é simples de conduzir com ferramentas padrão encontrados em um laboratório de Drosophila (a fonte de CO ₂ e fórceps estereoscópico), b) pode ser realizada rapidamente para muitos animais, fazendo com que a análise bioquímica de cordões nervosos após a lesão viável ^14, c) as respostas celulares e moleculares para esta lesão são altamente reprodutível ^14,15,28 e pode ser utilizado para descobrir processos que também são importantes em vertebrados neurónios ^29,30.

Métodos alternativos para ferir os neurônios é focusa laser de alta potência, por exemplo, um-UV pulsada ou laser de femtosegundos, para cortar um axônio via microcirurgia a laser ^17,31-33. O chip larva é um método ideal para o posicionamento do animal para tal microcirurgia. No entanto, por causa das pequenas diferenças na óptica entre ensaios, discutidas acima, o método à base de laser pode ser mais difícil de reproduzir de larvas, especialmente nos nervos segmentares larvares. Além disso, a base de laser lesão axonal requer mais tempo para posicionar cada um dos animais, por conseguinte, é mais difícil de realizar em grande escala (com um grande número de animais).

Solução de problemas:

A questão técnica mais comumente encontradas a partir do esmagamento do nervo é a morte de danos aos órgãos internos. Ao realizar a paixão, é importante para não prender o cabo ventral do nervo, glândulas salivares, ou intestinos. Também é importante não perfurar a cutícula. Estas questões devem ser evitados, trazendo a pinça em um ângulo de 45 ° para a sup cutículae (ver Figura 3).

A qualidade da pinça tem um grande impacto sobre a eficácia do esmagamento e sobrevivência depois. Recomendamos número Dumostar 5 fórceps. Para manter a sua nitidez, a pinça deve ser manuseado com cuidado, não utilizados para outros fins, e substituído, uma vez que tornam-se sem corte ou dobrados.

O tamanho do animal também pode influenciar a eficácia do esmagamento. Pequenos animais (menos de 3 mm de comprimento) são muito menos propensos a sobreviver à lesão. Com grandes animais, (3 ^rd errante estádios), é mais difícil localizar os nervos e evitar danos para as maiores glândulas salivares e intestino, e há menos tempo para estudar as respostas de lesão antes pupation. O esmagamento do nervo é mais eficazmente conduzida em larvas cedo instar 3 ^º (que são ~ 3-4,5 mm de comprimento ao longo do eixo ântero-posterior).

A fonte de alimentação que o animal é levantado em cima podem afectar oforça da cutícula e sobrevivência após a queda. Recomenda-se a criação de animais em alimentos feitos a partir de uma receita de levedura-glicose padrão.

O melhor método para aprender a fazer o esmagamento de forma eficaz é a prática em muitos animais, primeiro com o objetivo principal de conseguir a sobrevivência (e não pupation) 24 horas após a queda. Iniciantes normalmente têm uma taxa de sobrevivência de baixo (por exemplo, 10%), mas uma vez que a técnica é aprendida, as taxas de sobrevivência pode chegar a 90%.

Outras questões e direções futuras:

O ensaio de esmagamento fornece um método poderoso para estudar o surgimento de axônio proximal ao local da lesão e degeneração de axônios e sinapses distais ao local da lesão. Enquanto as taxas de degeneração variar entre diferentes tipos de neurónios, que são altamente reprodutíveis dentro de um determinado tipo de neurónio, fornecendo prova da reprodutibilidade do ensaio de lesão.

Em contraste, o "regenerativa" brotandoresposta observada nos axônios proximais é mais difícil de estudo. Todos os axônios no nervo segmentar iniciar extensa brotando perto do local da lesão (por exemplo, veja a Figura 6 e Figura 3). No entanto, o grau de germinação pode variar de neurônio para neurônio, e é difícil de quantificar. Um grau semelhante e variabilidade na germinação pode ser observado após lesões mais focais de neurónios motores individuais em nervos segmentares introduzidas por meio de um laser de corante pulsado UV. Nós interpretamos que a direcionalidade nondiscriminate do surgimento deve-se à ausência de pistas de orientação nos nervos segmentares. Em contraste, os axônios dos neurônios sensoriais feridas por laser de perto de seus corpos celulares passam por um novo crescimento axonal na mesma direção que o axônio perdeu ^34. Os axônios nesta região do animal são provavelmente expostos a informação posicional mais específica para orientação dos axônios em regeneração. O ambiente dentro de nervos segmentares é improvável que tenha muito resemblanCE para o ambiente que os axônios originalmente navegou durante a sua orientação no embrião, portanto, não se espera que tenha informações para orientar os axônios em regeneração.

Outra limitação para o estudo da regeneração utilizando o ensaio de esmagamento do nervo segmentar é que axônios sensitivos e neurónios motores feridos ainda tem uma distância significativa para cobrir (0,25-1 mm) para atingir a sua meta, e um período de tempo limitado (<3 dias) antes que os animais sofre pupação. Um estudo recente identificou uma manipulação genética do receptor da hormona prothoraciotropic que triplica a duração do ^3o estádio larval ^35. Esta manipulação vai estender o período de tempo para estudar a recuperação e degeneração dos neurônios após a lesão de forma significativa, a 9 em vez de 3 dias. Este pode ser o tempo suficiente para observar os novos eventos, como religação de um axônio ferido com seu alvo pós-sináptica, especialmente se a lesão é induzida perto do final sináptica.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de polietileno de 0,5 mm	Fisher Scientific	14-170-11B	Tubo de polietileno, ID = 0,023 pol. Diâmetro externo = 0,038 pol
Tubo de poliuretano de 1 mm	Fisher Scientific	BB521-63	, diâmetro interno = 0,063 pol. Diâmetro externo = 0,125 pol
Conector de farpa para barb Bio	Rad	732-8300	Conector de barb para barb de 0,8 mm
Válvula de torneira de 3 vias	Bio Rad	732-8104	Válvula de rosca para a seringa
Seringa (20 ml)	Fisher Scientific	14-817-33	Seringa de 20 ml de rosca para gerar vácuo
Dispensando agulhas, 23 G (0,4 mm I.D., 0,6 mm O.D.)	Agulha para conexão de saída	McMaster-Carr	75165A684
Agulhas de dispensação, 21 G, (0,6 mm de diâmetro interno,  0,8 mm de diâmetro externo)	McMaster-Carr	75165A679	Agulha para conexão de saída
Óleo de halocarbono	Sigma	H8898	Óleo de halocarbono 700
Dumostar Número 5 Fórceps	Roboz	RS-498	Para esmagamento de nervo
Kit PDMS (Base e agente de cura)	Ellsworth	184 SIL ELAST KIT 0,5 KG	Dow Corning Sylgard 184 Encapsulante de silicone 0,5 kg Kit de
lamínulas de vidro	Fisher Scientific	12-544-C	24 mm x 40 mm (espessura de acordo com a recomendação para o seu objetivo de microscópio)
Copo de plástico descartável (9 onças)
Vareta
Lâmina
Placas			de ágar suco de uvaVeja http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925 para a receita