Implantar matrizes organizados de microfios para utilização em gravações eletrofisiológicas unitárias apresenta uma série de desafios técnicos. Métodos para a realização desta técnica e os equipamentos necessários são descritos. Além disso, discute-se o uso benéfico de matrizes microfios organizados para gravar a partir de sub-regiões neurais distintos, com alta seletividade espacial.
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Artigo de método
Um Procedimento para Implantação de Arrays organizado de microfios para gravações a única unidade em Awake, comportando-se Animais
Neste artigo
Resumo
Resumo
Em gravações eletrofisiológicas vivo no acordado, comportando animais fornecem um método poderoso para a compreensão da sinalização neural ao nível de uma única célula. A técnica permite que pesquisadores para examinar temporal e regionalmente padrões de disparo específicas, a fim de correlacionar os potenciais de ação gravadas com o comportamento em curso. Além disso, as gravações unitárias podem ser combinados com uma infinidade de outras técnicas, a fim de produzir explicações abrangentes da função neural. Neste artigo, descrevemos a anestesia e preparação para a implantação microfio. Posteriormente, enumerar os equipamentos necessários e passos cirúrgicos para inserir de forma precisa uma matriz microfio em uma estrutura alvo. Por fim, descrevemos brevemente o equipamento usado para gravar a partir de cada eletrodo individual na matriz. Os conjuntos de microfios fixos descritos são bem adaptados para a implantação crónica e permitir a gravação de dados longitudinais neurais em quase qualquer preparati comportamentaisna. Discutimos traçando trilhas de eletrodos para triangular as posições microfios, bem como maneiras de combinar implantação microfio com técnicas de imuno-histoquímica, a fim de aumentar a especificidade anatómica dos resultados gravados.
Introdução
Registros eletrofisiológicos permitirá aos cientistas estudar as propriedades elétricas das células biológicas. No sistema nervoso central, onde impulsos elétricos servir como um mecanismo de sinalização, essas gravações são de particular importância para a compreensão da função neural 1-2. Durante as gravações unitárias em comportando animais, um microeletrodo que foi inserido no cérebro é capaz de registrar as mudanças na geração de um neurônio de potenciais de ação ao longo do tempo.
Embora muitas técnicas permitem gravar a atividade cerebral, unidade única eletrofisiologia é um dos métodos mais precisos, permitindo resolução no nível neurônio único. Quando um elevado grau de especificidade espacial é desejada, microfios pode ser usado para atingir ou núcleos sub-conjuntos de células dentro do brain3 discretas. Gravações de uma única Unidade também se beneficiam com alta resolução temporal como gravações são precisos ao nível do microssegundo. E, in vivo agravações vigília permitir interações circuito intactas, com o meio natural de aferentes e eferentes projeções, química sistêmica e influências hormonais e parâmetros fisiológicos. Os sinais neurais são derivados de entrada sensorial, comportamentos motores, o processamento cognitivo, neuroquímica / farmacologia, ou alguma combinação. Assim, a segregação de sensoriais, motoras, cognitivas e químicos influências exige experiências bem concebidas com contingências e controles eficazes que podem permitir a avaliação de cada uma das influências acima mencionadas. Ao todo, as gravações em animais se comportando permitir experimentadores para observar a integração de múltiplas fontes de informação dentro de um circuito em funcionamento e para derivar um modelo mais abrangente de função do circuito.
Gravações de uma única Unidade também sofrem de uma série de desvantagens do que qualquer pesquisador deve estar ciente. Em primeiro lugar, as gravações podem ser difíceis de realizar. De facto, as propriedades de the amplificadores headstage e os microfios implantados que permitem a especificidade espacial e temporal nessas gravações também faz gravações suscetíveis à influência de sinais elétricos estranhas (ou seja, "ruído" elétrico). Assim, a capacidade de resolver problemas em um sistema eletrofisiológico exige uma compreensão técnica dos princípios e aparelhos eletrofisiológicos bem desenvolvida. É também importante notar que, em certas circunstâncias, os sinais eléctricos registados em gravações extracelulares podem representar a soma de vários sinais neurais. Além disso, a generalização de actividade de uma única unidade de actividade da população de uma região alvo muitas vezes pode ser limitada pelo grau de heterogeneidade celular dentro da região alvo (mas ver Cardin 4). Por exemplo, os eléctrodos podem ser inclinados para a gravação de neurónios de saída de grande amplitude no lugar de outras células. A interpretação das gravações unitárias é aumentadacombinando gravações com outras técnicas, incluindo, mas não limitado a, eléctrico (ortodrômica ou antidrômica), estimulação química (por exemplo, iontoforese ou receptor designer) ou optogenetic 4, inativações neurais temporários, exames sensório-motores 5, os procedimentos de desconexão, ou imuno-histoquímica 3.
No protocolo que se segue, enumerar os materiais e as medidas necessárias para implantar uma matriz microfio organizado no rato (embora o protocolo pode ser adaptado para o uso em outras espécies). O procedimento e estilo de matrizes fixos utilizados em nosso laboratório têm demonstrado confiança para gravações longitudinais e pode sustentar gravações do mesmo neurônio para ao longo do tempo de um mês 6-8. Isso faz com que este procedimento ideal para examinar as respostas fásicas aos estímulos experimentais, mudanças plásticas nas respostas neurais, ou mecanismos de aprendizagem e motivação.
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Protocolo
O máximo cuidado deve ser tomado para manter as condições de assepsia (conforme descrito no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório 9) durante a preparação para a realização e o procedimento a seguir. O protocolo a seguir é de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foi aprovado pelo Animal Care e Use Comitê Institucional, da Universidade Rutgers. Estima-se que os procedimentos subsequentes irão requerer 3-6 horas para completar.
Implantação da Matriz Microwire:
- Animais lugar sob anestesia, utilizando 50 mg / kg de pentobarbital de sódio (ip) e administrar 10 mg / kg de atropina, nitrato de metilo (IP; glicopirrolato pode ser substituído) e 0,25 mg de penicilina (300.000 U / mL im) para manter a função respiratória e prevenir a infecção , respectivamente.
Nota: Com o comprimento de 3-6 horas da cirurgia de implantação, pentobarbital de sódio é usado porque é eficaz em termos de custos e limita a exposição humana aanestésicos (como pode ocorrer com o uso prolongado de anestésicos de gás) enquanto continua a fornecer anestesia de longa duração. A substituição de outros anestésicos é aceitável. - Verifique se a anestesia começou a produzir efeitos utilizando o teste de cauda pitada antes de prosseguir.
- Conforme necessário, dar injecções de cloridrato de cetamina (60 mg / kg IP) e pentobarbital de sódio (5-10 mg / kg IP) alternando para manter a anestesia durante toda a cirurgia.
- Raspar o couro cabeludo com uma lâmina de bisturi n º 22.
- Desinfetar o couro cabeludo raspado com iodopovidona.
- Dê injeções subcutâneas de bupivacaína (~ 1 mg / kg SC, distribuídos por quatro locais de injecção) para anestesiar localmente no couro cabeludo. Permitir 5-10 min para o anestésico local para fazer efeito.
- Coloque um lubrificante oftalmológico sobre os olhos para manter a umidade durante a anestesia.
- Fixe o animal para as barras de ouvido e nariz braçadeira de um aparelho estereotáxico.
- Use marcos visuais (por exemplo, uma barra horizontal na sterquadro eotaxic) para aproximadamente nível da cabeça do animal. Este passo só é feito para aproximadamente nível do crânio.
- Realizar uma incisão ao longo da linha média do couro cabeludo utilizando uma lâmina de bisturi # 11 montado sobre um suporte de bisturi. A incisão deve se estender a partir de apenas atrás das orelhas para a parte posterior do osso nasal.
- Usando uma espátula de dissecação, limpar o crânio de todo o tecido restante até dois sulcos lateral do crânio e do cume posterior do crânio foram alcançados.
- Puxe a pele ao redor da incisão usando um número de hemostats (6x).
- Limpe o crânio de qualquer sangue e deixe-a secar. Se ocorrer alguma hemorragia restante, encerrar o sangramento residual com uma ferramenta de cauterização pequeno. Assegurar que o crânio permanece limpo e seco permite que o acrílico dental utilizado em passos subsequentes para se ligar ao crânio permanentemente.
- Mark bregma e lambda (Figura 2D), interpolando a intersecção das suturas do crânio. Um mic dissecandoroscope é necessário marcar com precisão estas posições.
- Prenda um pequeno objecto pontiagudo (por exemplo, um pino ou dental broca) para um braço estereotáxico e abaixá-lo para determinar a dorsal / ventral (DV) de coordenadas do bregma e lambda.
- Ajustar a braçadeira até que o nariz coordena o DV para bregma e lambda são de 100 mm (0,1 mm), de um ao outro.
- Uma vez nivelado, gravar o anterior / posterior (AP), medial / lateral (ML) e DV coordenadas bregma, juntamente com a posição do grampo de nariz. Checar as coordenadas de precisão, como o restante da cirurgia depende da precisão dessas coordenadas.
- Use as coordenadas medidas para calcular o ML e coordenadas AP para os quatro cantos do "janela crânio" em relação ao bregma (isto é craniotomia, Figura 1). A janela de crânio é um retângulo precisamente posicionado através do qual a matriz microfio vai passar.
- Use as coordenadas calculadas para marcar ocoordena janela crânio no crânio usando um acessório estereotáxica pontiagudo e caneta de tinta. Para obter marcas precisas, aplicam-se apenas uma pequena quantidade de tinta para a ponta do instrumento de marcação com um aplicador de algodão.
- Broca para fora da janela do crânio através da remoção do osso de uma série de pequenas camadas.
- Comece por perfuração dos cantos marcados da janela onde as marcas foram colocadas.
- Em seguida, conecte os cantos e delinear a janela.
- Por fim, limpar a área dentro do contorno até a profundidade de dura-máter. O furo tem de ser mais largo (isto é, chanfrada) abaixo das camadas superficiais do crânio para garantir que a janela mantém uma largura apropriada de cima para baixo.
- Use micropinças para remover cuidadosamente chips de qualquer osso remanescente, detritos, ou dura-máter dentro da janela do crânio. Este passo é extremamente importante, uma vez que estes bits de material pode comprometer a integridade da matriz durante a descida. Depois de limpo, deve-se manter ªe janela úmido com solução salina bacteriostática para o restante da cirurgia.
- Coloque marcas no crânio por 5 parafusos de crânio e um fio terra (Figura 1). Estas posições irão variar consoante a região do cérebro alvo. O andar de entrada será mais seguro se um parafuso é colocado em cada um dos cinco ossos do crânio. Coloque ambos os parafusos do crânio e fio terra em locais que não interfiram com a colocação disposição microfio.
- Faça furos para os parafusos do crânio e aperte os parafusos no lugar. Os parafusos devem ser reduzidos até que apenas 3-4 tópicos estão mostrando (ou, se estiver usando diferentes dos recomendados parafusos, profundo o suficiente para atravessar a espessura do crânio para promover a estabilidade matriz, mas não muito profunda, de modo a danificar córtex). Limpe as roscas dos parafusos após a colocação.
- Faça um furo para o fio terra. Abaixe o fio lentamente (mais de 1-2 min) para o DV-alvo coordenar e fixar o fio no lugar usando o acrílico dental.
- Adicionar acrílico em torno dos tópicosdos parafusos do crânio. Antes de a seca de acrílico, remova qualquer excesso de cimento que corre para longe do fio terra ou parafusos do crânio. Permita 15 minutos para o acrílico dental para secar / endurecer.
- Anexar a matriz para o braço estereotáxico. Nível da matriz e orientá-lo para que ele irá diretamente passar dos limites da janela do crânio.
- Coloque salina na janela do crânio de modo a que fique ao nível do crânio. Abaixe a matriz até que ele cria uma covinha na solução salina. Este coordenar é usado como nível crânio para a matriz. Utilize este valor para calcular a coordenada DV final do array.
- Abaixe o array lentamente até atingir coordenar a sua DV final. Pare cada 1mm de abaixamento e esperar durante vários minutos a fim de permitir que o tecido cerebral de se recuperar de ondulações e dissolva a porção de fundo do polietileno glicol (PEG) na matriz (PEG é utilizada para manter temporariamente os fios na sua conformação ao mesmo tempo reduzindo , e dissolve-se lentamente na solução salina).
- Quando a matriz é 1 milímetrolonge do alvo, abaixá-lo mais lentamente até que o objectivo final seja alcançado. Baixando a 0,1-0,2 mm de cada vez antes de permitir que o tecido em repouso por um período de 5 min destina-se a manter o tecido no local alvo, bem como as conexões sinápticas proximais. Se o equipamento estiver disponível, reduzindo a precisão da matriz pode ser auxiliada usando um manipulador motorizado.
- Dissolver o restante PEG e usar acrílico dental para cimentar os microfios no lugar. Adicionar várias camadas de cimento para garantir que os fios são seguras e, em seguida, permitir que 15-20 minutos para que o cimento endurece antes de prosseguir. Isso garante que os fios não será empurrado da sua colocação definitiva.
- Construir o restante headstage do animal usando o acrílico dental. Use o acrílico para encerrar os parafusos crânio, fio terra, e conector para os microfios. Permitir que o chapéu acrílico para endurecer suficientemente antes de prosseguir.
- Suturar a incisão no couro cabeludo com suturas absorvíveis e administrar 2 ml of soro fisiológico bacteriostático (sc) para restabelecer a hidratação de uma cirurgia.
- Remover o animal a partir das barras de ouvido e colocar o assunto em uma área limpa. Observar o animal com frequência durante a recuperação pós-operatória até a termorregulação e locomoção se recuperaram. Após a recuperação da anestesia, mover o animal para habitação única para o restante da recuperação pós-cirúrgica.
- Dê animais monitorização pós-operatória diária e cuidados nos dias após o procedimento. A recuperação deste procedimento é o ideal quando sete ou mais dias são permitidos.
- Dê animais injeções de carprofeno (5mg/kg) e enrofloxacina (5-10 mg / kg) ou seus equivalentes durante a recuperação de acordo com o esquema recomendado pelo veterinário responsável.
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Resultados
A lista de equipamentos utilizados por este laboratório para a gravação de sinais eletrofisiológicos podem ser encontrados na Tabela 3. Após a recuperação da cirurgia,-unidades individuais são registrados conectando um headstage de ganho unitário no conector implantado. Este andar de entrada é ligado através de um cabo a um comutador, o qual é capaz de rotação livre, sem quebras na gravação electrofisiológico através da utilização de anéis deslizantes eléctricos. O comutador permite sujeitos a mover-se ...
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Discussão
Gravações extracelulares representam uma técnica experimental poderosa que pode ser incorporado em quase qualquer preparação experimental em neurociência. Os fios que foram implantados em matrizes organizados pode ser rastreada como os seus veios passam através do cérebro e para a sua zona alvo (Figura 5A). Quando uma lesão pequena, pós-experimental é criada na ponta microfio não isolados para criar um pequeno depósito de ferro a partir do fio de aço inoxidável, pode-se marcar com precisão a localização...
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Divulgações
Os autores não têm concorrentes interesses financeiros para divulgar.
Agradecimentos
Este estudo foi financiado pelo Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas concede DA 006.886 (MOW) e DA 032.270 (DJB).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tabela 1. Lista de Materiais Cirúrgicos. | |||
| Gauze | Fisher (MooreBrand) | 19-898-144 | |
| Cotonetes | Fisher (Puritano) | S304659 | |
| Nembutal (Pentobarbital) | Sigma Aldrich | P3761 | |
| Atropina Nitrato de Metila | Sigma Aldrich | A0382 | |
| Baytril (Enrofloxacina) | Butler Shein ( Bayer) | 1040007 | |
| Cloridrato de Cetamina | Butler Shein | SKU# 023061 | |
| Betadine (Povidona-Iodo) | Fisher (Perdue) | 19-066452 | |
| Stereotax | Kopf | Modelo 900 | |
| Ferramenta de Cauterização | Stoelting | 59017 | |
| Microscópio de Dissecação | Nikon | SMZ445 | |
| Broca Dental | Buffalo | 37800 | |
| Solução salina bacteriostática | Bulter Schein | 8973 | |
| Parafusos Jewlers | Stoelting | 51457 | |
| Microwire Array | Microprobes | Custom (Flexible) | |
| Fio terra | Omnetics | Custom Plug | |
| Dental Acrylic | Fisher (BAS) | 50-854-402 | |
| Suturas absorvíveis | Fisher (Ethicon) | NC0258473 | |
| Puralube (pomada/lubrificante oftalâmico) | Fisher (Henry Schein) | 008897 | |
| Tabela 2. Lista de Instrumentos Cirúrgicos. | |||
| 2x Microfórceps | George Tiemann Co. | #160-57 | Multiuso (por exemplo, limpeza de detritos na janela do crânio) |
| 2x Fórceps | George Tiemann Co. | #160-93 | Multiuso (por exemplo, amarrar suturas) |
| 6x Hemostats | George Tiemann Co. | #105-1125 | Braçadeira e incisão aberta |
| 1x Tesoura pequena | George Tiemann Co. | # 105-411 | Corte as suturas após amarrar |
| 1x pinça de tecido | George Tiemann Co. | #105-222 | Segurando o tecido durante a sutura |
| 1x Porta-agulhas | George Tiemann Co. | #105-1259 | Segurando agulha de sutura |
| 1x porta-bisturi (com lâmina #11) | George Tiemann Co. | # 105-80 (com lâmina # 105-71) | Fazendo incisão no crânio |
| 1x # 22 Lâmina de bisturi | George Tiemann Co. | #160-381 | Raspagem do couro cabeludo |
| 1x Espátula Cirúrgica | George Tiemann Co. | # 160-718 | Raspagem do crânio para limpar o tecido no crânio |
| Máquina / Joalheiros Parafusos | Vários | N / A | 0/80 x 1/8 " |
| Tabela 3. Lista de equipamentos para registro de sinais eletrofisiológicos. | |||
| Microwire Array & Conector | Micro Probe, Inc. (Gaithersburg, MD) | N / A (Nº da peça com base nas características da matriz) | Implantado cranialmente na região de gravação do alvo. As matrizes são personalizadas com base no espaçamento desejado do fio, comprimento, etc. |
| Unity-Gain Harness/Headstage | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1200 | Amplificação inicial do sinal neural; permite a propagação de pequenos sinais neurais. |
| Comutador (e Fluido Giratório Opcional) | Plastics One, Inc. (Roanoke, VA) | SL18C | Permite que os animais girem livremente enquanto propagam o sinal elétrico para o pré-amplificador |
| Pré-amplificador | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1198 | Amplifica diferencialmente os sinais neurais contra um eletrodo de referência. |
| Filtro e Amplificador | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1199 | Filtros passa-banda e amplifica ainda mais o sinal amplificado diferencialmente. |
| Acquisition Computer | EnGen (Phoenix, AZ) | N/A (Custom Build) | Executa software e hardware para aquisição de dados comportamentais e neurais. |
| Cartão A/D | Tradução de dados (Marlboro, MA) | DT-3010 | Digitaliza sinais neurais para amostragem por computador. |
| de placa de E/S digital | (Norton, MA) | O PCI CTR-05 | Adquire entradas e saídas comportamentais |
Referências
- Carter, M., Shieh, J. C. Electrophysiology In: Guide to research techniques in neuroscience. , Academic Press. (2009).
- Aston-Jones, G., Siggins, G. R. Electrophysiology. In: Psychopharmacology: The Fourth Generation of Progress. Kupfer, D., Bloom, F. E. , Raven Press. (1995).
- Root, D. H., et al. Differential roles of ventral pallidum subregions during cocaine self-administration behaviors. J. Comp. Neurol. 521 (3), 558-588 (2013).
- Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. (3-4), 106-103 (2012).
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- Ghitza, U. E., et al. Persistent cue-evoked activity of accumbens neurons after prolonged abstinence from self-administered cocaine. J. Neurosci. 23 (19), 7239-7245 (2003).
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Reimpressões e permissões
