Nós estabelecemos um modelo de glioblastoma ortotópico cortical em camundongos para microscopia de dois fótons intravital que recapitula as restrições biofísicas normalmente no jogo durante o crescimento do tumor. Uma janela de vidro crônica substituir o crânio acima do tumor permite o acompanhamento da progressão do tumor ao longo do tempo por meio de microscopia de dois fótons.
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Artigo de método
Um Glioblastoma Rato modelo ortotópico Manter restrições Cérebro parênquima físicas e Adequado para intravital dois fótons Microscopia
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Resumo
Resumo
Glioblastoma multiforme (GBM) é a forma mais agressiva de tumores cerebrais sem tratamentos curativos disponíveis até o momento.
Modelos murinos desta patologia contar com a injecção de uma suspensão de células de glioma no parênquima cerebral após a incisão da dura-máter. Considerando que as células têm de ser injetada superficialmente para ser acessível a microscopia de dois fótons intravital, as injeções superficiais deixam de recapitular as condições fisiopatológicas. Na verdade, escapando através do trato injeção maioria das células tumorais alcançar o espaço extra-dural onde expandir anormalmente rápido na ausência de restrições mecânicas do parênquima.
Nossos melhorias não consistem apenas em focalmente a implantação de um esferóide de glioma em vez de injecção de uma suspensão de células de glioma nas camadas superficiais do córtex cerebral, mas também no entupimento do local de injecção por um gel de dextrano hemi-cordão de ligação cruzada que é colada à surrounding parênquima e selou a dura-máter com cianoacrilato. Todas estas medidas aplicar a expansão fisiológica e infiltração de células tumorais no interior do parênquima cerebral. Craniotomia foi finalmente fechada com uma janela de vidro cimentados ao crânio para permitir imagens crônica ao longo de semanas, na ausência de desenvolvimento do tecido da cicatriz.
Aproveitando-se de animais transgênicos fluorescentes enxertados com células tumorais fluorescentes Nós mostramos que a dinâmica das interações que ocorrem entre as células de glioma, neurônios (ex-PCP Thy1 ratos) e vascularização (destacado por uma injeção intravenosa de um corante fluorescente) pode ser visualizado por intravital microscopia de dois fotões durante a progressão da doença.
A possibilidade de uma imagem de tumor com resolução microscópica em um ambiente cerebral minimamente comprometido representa uma melhoria de modelos animais atuais GBM que deve beneficiar o campo da neuro-oncologia e testes de drogas.
Introdução
Glioblastoma multiforme aparece como a forma mais agressiva de tumor cerebral em adultos com uma sobrevida média de 12 meses e uma taxa de sobrevida em 5 anos de 5%. O tratamento clínico depende de cirurgia, radioterapia e quimioterapia, muitas vezes utilizados em combinação. No entanto, os efeitos destes tratamentos paliativos permanecem 1-3.
Até agora, a maioria dos estudos de neuro-oncologia contar com técnicas que só são capazes de fornecer uma visão estática e realizados em grandes grupos de animais portadores de tumor sacrificados em diferentes pontos temporais (ver, por exemplo, 4,5). O recente desenvolvimento de métodos de acompanhamento com base em imagens intravital permite estudar o crescimento de glioma e as interações entre as células tumorais e seu microambiente fisiopatológico no mesmo animal ao longo do tempo. Isso abre o caminho para a peça exclusiva de informação que foi até agora inatingível 6. Animais transgênicos expressando marcas fluorescentes em células de interesse pode ser usadod para estudar as interações específicas entre as células tumorais e ex neurônios neste papel.
Ao longo da última década, a microscopia de dois fótons intravital 7 tornou-se um padrão-ouro em estudos neuro-oncologia fundamentais e ensaios pré-clínicos 8,9 por sua capacidade de realizar observação intravital profundo de cérebro do rato (> 500 mm abaixo da dura-máter) com uma resolução espacial micrométrica 10. Utilizando microscopia de dois fotões intravital com modelos animais orthotopical implantados com uma janela craniana crónica 11, é possível seguir a progressão do tumor ao longo do tempo no mesmo 9,12 rato.
Uma das principais desvantagens destes modelos animais anteriormente publicadas, no entanto, que eles não imitam as limitações físicas que governam o crescimento do tumor como a dura-máter não é selado após a injecção da suspensão celular 9,13,14. Células de glioma podem vazar noespaço extradural transformar um modelo de glioma ortotópico em um heterotópico.
O modelo animal aqui apresentados consiste na injecção de um esferóide de células de glioma fluorescentes no córtex cerebral, a uma profundidade de 200 um, seguido pelo fecho da dura-máter com um gel de dextrano hemi-grânulo reticulado e cola de histo-compatibilidade . O crescimento do tumor é então restrito ao parênquima cerebral que mantém as restrições físicas fisiopatológicos. Uma janela de vidro crônica implantado acima do tumor permite um acesso óptico fácil para microscopia de dois fótons intravital. Usando animais transgênicos expressando marcas fluorescentes em células de interesse, é possível realizar um acompanhamento do crescimento glioma ao longo do tempo e estudar sua interação com seu microambiente (aqui com os neurônios e vasos destacados com dextrans fluorescentes).
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Protocolo
Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com a legislação francesa e em conformidade com a directiva do Conselho da Comunidade Europeia de 24 de novembro de 1986 (86/609/CEE) para o cuidado e uso de animais de laboratório. A pesquisa em animais foi autorizada pela Direção Départementale des Serviços vétérinaires des Bouches-du-Rhône (licença D-13-055-21) e aprovado pelo comitê de ética da Provence Côte d'Azur n ° 14 (Projeto 87-04122012) .
1. Esferóides Preparação
- Preparação das placas de Petri revestidas com agarose
- Mistura-se 1 g de agarose com 100 ml de meio de cultura de células não suplementadas com soro fetal bovino. Usar um forno de microondas (850 Watts durante 40 seg, depois 3 x 15 seg; agita-se a solução entre cada sessão de microondas) para ferver a solução e para dissolver completamente a agarose. Autoclave esta solução de agarose a 1% durante 20 minutos a 120 ° C para garantir Steri. dade Nota: Tome cuidado para dissolver completamente o agarose antes do protocolo autoclave. Falta de homogeneidade pode comprometer a formação de esferóides.
- Uma vez recuperada a partir do autoclave, verter 10 ml da solução de agarose a 1% em 100 x 20 mm pratos Petri. Deixar a placas de Petri de 20 min à temperatura ambiente para permitir que a solução de agarose a 1% para solidificar.
- Adicionar 10 ml de PBS acima da agarose para manter a humidade. Selar a tampa das placas de Petri revestidas com agarose enrolando-os com parafilme para evitar a evaporação. As placas de Petri podem ser armazenados durante 2 meses a 4 ° C, se adequadamente humidificado pela camada de PBS.
- Cultura esferóide
- Em de 75 cm 2 frascos, a cultura das células de glioma em seu meio recomendado como uma monocamada.
- Substituir o PBS a partir de um dos 1% de agarose revestidas com uma placa de Petri com 1,5 ml de "meio de pré-condicionado" recolhidos a partir do recipiente que contém a monocamada de células de glioma de 2Ds.
- Remover o meio do frasco contendo a monocamada de 2D de células de glioma.
- Lave a monocamada com 10 ml de PBS.
- Adicionar 2 ml de 0,05% de uma solução de tripsina / EDTA e incubar o balão de 4 min a 37 ° C. Nota: O tempo de incubação pode variar de acordo com a linha celular utilizada.
- Adicione 8 ml de meio de cultura para impedir a ação da tripsina, lave delicadamente a suspensão de células Nota:. Tome cuidado para não lavar ar na suspensão de células à medida que aumenta a morte celular.
- Coloque 6 ml da suspensão de células num frasco estéril.
- Centrifuga-se o frasco de 4 minutos a 800 rpm.
- Remover o sobrenadante e suspender suavemente o sedimento de células em 3 ml de meio de cultura.
- Semente da suspensão de células no preparado revestida de agarose placa de Petri.
- Colocar a placa de Petri, a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5% durante 2 a 3 dias, até os esferóides de diâmetro desejado são formados.
2. Esferóide e Janela Implantação
- Preparação do sistema de injecção
- Capilares de vidro limpo (1 mm de diâmetro) por sonicação em etanol a 70% durante 10 min. Lavar duas vezes com água antes colocação dentro de uma incubadora até secar.
- Puxe vários capilares de vidro limpo com um puxador de pipeta, a fim de preparar um pequeno estoque.
- Quebrar a ponta do capilar puxado por raspagem sobre a extremidade de um pedaço de papel de seda para se obter um extremidade chanfrada do tamanho desejado: normalmente um diâmetro externo de 300-350 ^ m e um diâmetro interno de 250-300 mM. Durante este processo de conformação, controlar o diâmetro do capilar utilizando um macroscópio cuja ocular está equipado com uma mira graduada.
- Ligue a extremidade não chanfrada do capilar para um colector de 3 vias utilizando um pedaço de tubo de plástico, cujo diâmetro interior se ajusta o diâmetro externo do tubo capilar.
- Usando tubin plásticog, ligar as duas outras formas de colector para uma 25 ul microlitro seringa e uma seringa de 1 ml carregado com óleo mineral histo-compatibilidade.
- Ajuste o seletor múltiplo para estabelecer um caminho entre a seringa microlitro ea seringa de 1ml. Remover o pistão da seringa microlitro e injetar óleo mineral para trás para dentro da seringa microlitro até que vaza, empurrando o êmbolo da seringa de 1ml. Substitua o pistão da seringa microlitro, enquanto tomando cuidado para não deixar bolhas de ar no tubo.
- Ajuste o seletor múltiplo para estabelecer um caminho entre o capilar ea seringa de 1 ml. Encha o capilar com óleo mineral até que vaza da ponta, tendo o cuidado para não deixar bolhas de ar no tubo.
- Ajustar o selector de colector para estabelecer uma ligação entre a seringa de microlitro e o capilar. Expelir a cerca de 10 ul de óleo mineral.
- Mergulhe a ponta capilar em solução PBSe usando o calibre da seringa microlitro, aspirar 5 ul de PBS no capilar. Note-se que o menisco entre o óleo e PBS é claramente visível.
- Fixar o capilar num micromanipulador 3 eixo encaixe sob o macroscópio cirurgia. Este sistema irá ser utilizado para orientar o capilar para o local da injecção sob controle visual.
- Implantação esferóide
- Levemente sedar o mouse por inalação de isoflurano em uma câmara de indução (1,5% em ar durante 1 a 1,5 min).
- Anestesiar os animais com uma injecção intra-peritoneal de uma mistura de cetamina / xilazina (120 mg / kg, 12 mg / kg). Note-se que a anestesia frequentemente reduz a temperatura do corpo do animal. Recomenda-se a prosseguir com a cirurgia em uma sala a 26 ° C e manter o animal aquecido com uma almofada de aquecimento thermocontrolled subjacente.
- Aplicar pomada para evitar a dessecação dos olhos.
- Raspar o couro cabeludo do animal.
- Lugaro animal em uma estrutura estereotáxica usando barras de ouvido e um bocal.
- Limpar a pele com iodo povidona (3% de sabão, em seguida, solução a 10%).
- Adicione a 1 cm de comprimento incisão longitudinal no meio do couro cabeludo com um bisturi. Com uma tesoura cortar e remover a pele acima dos ossos parietais.
- Com uma lâmina de bisturi remover suavemente o periósteo acima do crânio. Generosamente aplicar cianoacrilato no topo do osso para gerar uma superfície áspera para mais tarde a aderência de cimento.
- Perfurar o osso parietal sob uma macroscópio cirúrgico para gerar uma craniotomia, de 4 mm de diâmetro. Generosamente adicionar PBS gelado contendo penicilina (1000 U / ml) e estreptomicina (1 mg / ml) durante todo o processo para evitar um aquecimento. Retire os pequenos fragmentos de osso com uma pinça e uma gaze estéril molhado. Tome cuidado para perfurar pelo menos um milímetro de distância de suturas do crânio parietais para evitar hemorragias.
- Fina osso na fronteira da craniotomia em que a janela de vidro será selado. Objetivo é eNsure posicionamento posterior plana da janela de vidro com superfície de contacto máxima entre o cérebro e o vidro. Lentamente, retire o osso usando uma pinça e limpar a dura-máter exposta com a solução de PBS.
- Tome a 5 mm de diâmetro rodada lamela de vidro, limpe-o com álcool e seque-a com papel de seda. Tentar usar a lamela como uma tampa para a craniotomia e confirmar que uma grande superfície plana do cérebro fica em contacto com o vidro. Se for necessário retirar a lamela mais a densidade dos ossos laterais. Prossiga até que o cérebro pode ficar espremido plana se aplicar suavemente a pressão sobre a lamela uma vez no lugar.
- Limpe novamente a lamela com o álcool, seque-a com papel de seda, e guardá-lo à parte.
- Com uma agulha de calibre 26 fazer um buraco na dura-máter no centro da craniotomia ainda evitar vasos sanguíneos principais. Certifique-se de não danificar o parênquima cerebral como o objetivo desta etapa é apenas para abrir a dura-máter.
- Limpe suavemente o wi dura-máterª solução PBS para remover sangue hemorrágico. Cubra com um pedaço de papel de seda enquanto prepara a injeção esferóide.
- Com o sistema de injecção de esferóide, preparado no passo 2.1, chupar um esferóide rodada montagem do diâmetro interno capilar (aproximadamente 200-250 mm) a partir da placa de Petri, preparado no passo 1.2. Esferóide deve vir junto com cerca de 5 mL de meio de cultura. Ele deve cair para a ponta da capilaridade sob o seu peso.
- Remover o papel de seda molhado utilizadas para cobrir a craniotomia e posicionar o animal sob o sistema de injecção.
- Abaixe a pipeta de injeção até tocar no buraco feito na dura-máter. Em seguida, coloque-o novamente por 250 um. Espere 30 segundos.
- Lentamente injectar o esferóide utilizando o êmbolo da seringa de microlitros (2-3 ul), enquanto bombeia para fora o excesso de líquido com um pequeno pedaço de papel de seda. Espere 30 segundos e, em seguida, levante cuidadosamente a pipeta de injeção de 50 mm em direção à superfície. Espere 30 segundos e novamente REPEAt o processo de elevação por passos de 50 mM até a superfície. Tempo de espera evita a extração do esferóide que iria ficar para a pipeta.
- Confirmar a presença do esferóide no cérebro utilizando uma macroscópio fluorescência.
- Misturar 100-300 diâmetro mM reticulados contas de gel dextrano com solução de PBS numa placa de Petri. Espere 1 minuto e pescar algumas contas hidratados. Colocá-los no osso adjacente ao craniotomia.
- Sob o controlo macroscópica, escolher um cordão com um diâmetro semelhante ao tamanho da abertura da dura-máter. Cortar o talão de gel de dextrano reticulado em duas metades, utilizando fórceps.
- Com cuidado, coloque um dextrano gel hemi-talão reticulado no orifício de injeção com a face convexa em direção ao esferóide. Tome cuidado para não remover o esferóide e pressione suavemente para baixo até a fronteira do côncavo entrar em contato com a dura-máter circundante.
- Coloque uma gota de cola de cianoacrilato sobre uma lâmina de vidro; molhe a ponta de um palito no drop para levar uma pequena quantidade de cola. Rapidamente selar as bordas do gel de dextrano hemi-grânulo reticulado para a dura-máter adjacente por estampagem em torno de cola. Ter o cuidado de executar movimentos rápidos e precisos, a fim de evitar a colagem do dextrano reticulado em gel de hemi-grânulo para o palito. Evite o excesso de cola que pode se espalhar e impedir se não impedir imagem depois de secas. Espere 2 minutos para a cola secar e, em seguida, limpar a craniotomia e osso circundante com solução PBS.
- Implantação Janela
- Coloque a 5 mm de diâmetro rodada lamela acima da craniotomia (ver 2.2.12). As arestas da lamela deve ser diluído no crânio no exterior da craniotomia. A lamela deve estar em contato com a dura-máter eo osso diluído nas bordas. É muito importante ter um contato direto entre a dura-máter ea lamela de vidro de outra forma o tecido da cicatriz pode desenvolver e impedir a claridade óptica.
- Com um lenço de papel, absorver o PBS no tharestas e de lamelas, de modo que solução não cobre totalmente a craniotomia, quando da aplicação de uma pequena pressão no centro da lamela. Isto irá garantir que o osso, de vidro e cérebro são coladas no lado da região de interesse.
- Manter uma pequena pressão no centro da lamela com um fórceps enquanto aplicando suavemente cianoacrilato na fronteira entre o osso e a lamela. A cola vai espalhar-se espontaneamente até a interface com a solução de PBS. Solução vai agir como uma barreira dada a hidrofobicidade da cola. Vedação deve ser eficaz em menos de um minuto, mas tomar um extremo cuidado para não mover a lamela até que seja corrigido. Isso de outro modo resultar em fuga de cianoacrilato sobre a dura-máter, portanto, conduzir a uma falha da cirurgia.
- Em caso de cola teriam se espalhado em cima do vidro, removê-lo usando uma lâmina de micro-bisturi, fazendo movimentos em espiral, uma vez que, de outra forma reduzir a claridade óptica. Cuidado para não quebrar a lamela de vidro during o processo, devido a pressão excessiva.
- Consolidar a fixação de vidro, aplicando cimento dental nas bordas da lamínula em direção ao crânio adjacente. Certifique-se de cobrir todo o crânio exposto até o couro cabeludo. Usando cimento extra, construir paredes laterais ao redor da lamela para criar o pool necessário para a imersão do objetivo. O cimento dental vai curar em menos de 10 min.
3. Cuidados pós-operatórios e Preparação for Imaging
- Cuidados pós-operatórios
- Retire o mouse do quadro estereotáxico, injetar Dexamethazon (0,2 mg / kg) e Rimadyl (5 mg / kg) sc sobre as regiões pélvica e deitá-la em uma jaula com um caloroso tecido-ninho.
- Monitorar o animal até os efeitos da anestesia ter desaparecido. Em geral 2 a 3 horas após a cirurgia, os ratos são totalmente móvel. Certifique-se que o animal tem um fácil acesso a comida e água. Fornecer o animal com agarose contendo glicose (agarose3%, glicose a 3%).
- Monitorizar o peso dos animais diariamente e injectar Dexamethazon (0,2 mg / kg) e Rimadyl (5 mg / kg) sc para o primeiro 10d após a cirurgia. Por considerações éticas, eutanásia os ratos quando a perda for superior a 15% do seu peso original. A pressão intracraniana aumenta com o tamanho do tumor levando a deficiências motoras para o animal. Esta é a linha de células tumorais dependente e ocorre em vários atrasos pós-cirurgia. Cuidados especiais devem ser tomados para caracterizar o ponto final do experimento com a linhagem celular utilizada.
- Preparação para a imagem latente
- Levemente sedar o ratinho por inalação de isoflurano numa câmara de indução (1,5% em ar durante 1 a 1,5 minutos).
- Anestesiar os animais com uma injecção intra-peritoneal de uma mistura de cetamina / xilazina (100 mg / kg, 10 mg / kg). Tal permite que a anestesia tipicamente 45 minutos de observação. Para realizar as sessões de imagem mais longos, o mouse é colocado sob a inalação contínua de isoflurano emar (0,25-0,75%).
- Aplicar pomada para evitar a dessecação dos olhos.
- Coloque o animal em um quadro estereotáxico e bloquear o crânio com os earbars.
- Para visualizar os vasos sanguíneos, um corante fluorescente pode ser injectado por via intravenosa.
- Se a janela estiver suja, pode ser limpa, removendo delicadamente os escombros com uma lâmina fina e no canto de um tecido. Não use álcool para limpar a janela, uma vez que nem sempre é compatível com cimento dental e pode resfriar o cérebro abaixo da janela.
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Resultados
Uma vez que o protocolo cirúrgico é realizado (Figura 1), os animais podem ser observados por meio de microscopia de fluorescência ao longo de semanas até ao sacrifício. Uma reação inflamatória pode ser observada após a cirurgia, que desaparece dentro de uma ou duas semanas. O crescimento do tumor pode ser observada através de várias técnicas de microscopia, incluindo a microscopia de fluorescência e análise macroscópica de dois fotões (Figura 2). Imagens de exemplo descritos aqui foram...
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Discussão
Esta abordagem permite a utilização de métodos de imagiologia óptica para monitorizar ao longo de dias e semanas, o crescimento de glioma ortotopicamente implantado. O mesmo animal pode ser subsequentemente submetido a virtualmente qualquer modalidade de imagem do cérebro durante o decorrer da patologia; no entanto, a preparação específica microscopia de dois fótons oferece a oportunidade única de alcançar resolução subcelular dentro do cérebro do animal vivo. Nosso protocolo apresenta a vantagem de fazer cumprir o cres...
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores agradecem calorosamente Dr. KK Fenrich, Dr. MC. Amoureux, P. e A. Weber Jaouen para discussões úteis; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, o pessoal do biotério em IBDML eo pessoal da plataforma de imagem PicSIL em IBDML para suporte técnico. Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional do Câncer du (INCA-DGOS-INSERM6038) a GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), pour la Recherche Fédération sur le Cerveau (FRC) para FD, por bolsas de estudo da Federação Recherche Médicale de la e Cancéropôle PACA ao CR.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Broca | Dremel (Alemanha) | 398 | qualquer broca de osso cirúrgico de alta qualidade seria suficiente |
| Broca (#1/4 Carbide Round Burr) | World Precision Instruments (EUA) | 501860 (#1/4) | também vendido pela Harvard Apparatus |
| Tesoura de tecido | World Precision Instruments (EUA) | 14395 | |
| Pinça Dumont M5S | World Precision Instruments (EUA) | 501764 | |
| Cimento dentário | GACD (EUA) | 12-565 & 12-568 | |
| Cianoacrilato | Eleco-EFD (França) | Cyanolit 201 | |
| Capilares de vidro sem filamento | Clark Electromedical Instruments (UK) | GC100-15 | |
| Seringa de microlitro (25 µ l) | Hamilton (EUA) | 702 | |
| Micromanipulador | World Precision Instruments (EUA) | Derivação Kite-R | |
| T (torneira de 3 vias - Luer lock) | World Precision Instruments (EUA) | 14035-10 | |
| Quadro estereotáxico (adaptador de mouse) | World Precision Instruments (EUA) | 502063 | |
| Lamínulas de vidro | Warner Instruments (EUA) | CS-5R (64-0700) | |
| Gel de dextrano reticulado (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µ m grânulos | Disponível de vários fornecedores, incluindo Sigma (Alemanha) | ||
| Pomada para os olhos | TVM (França) | Ovélio-gel | |
| Macroscópio de fluorescência | Leica MZFLIII (Alemanha) | também vendido por outras empresas | |
| Microscópio de dois fótons | Zeiss LSM 7MP (Alemanha) | também vendido por outras empresas (Nikon, …) | |
| Laser de femtossegundo sintonizável infravermelho (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | também vendido por outras empresas |
Referências
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Reimpressões e permissões
