Um ensaio fenotípico microscópico para quantificação de micobactérias intracelulares adaptadas para triagem de alto rendimento/alto conteúdo

Entre os patógenos infecciosos emergentes e ressurgindo relatados nos últimos anos, o Mycobacterium tuberculosis (Mtb)ocupa um lugar de destaque sendo responsável por 1,4 milhão de mortes e 8,7 milhões de novas infecções em 2011 (Relatório Global de Tuberculose 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). Apesar da disponibilidade de terapias multidroga, o número de pessoas infectadas ainda está em ascensão e a resistência multidroga (MDR), bem como mtb extensivamente resistente a medicamentos (XDR) estão se espalhando rapidamente por todo o mundo¹. Além disso, ao levar em consideração a presença de antígenos de Mtb, é evidente que um terço da população global é considerada latentemente infectada pelo Mtb. Estatisticamente, em um caso em cada dez, há evolução para a forma ativa da doença com sintomas clínicos subsequentes². Portanto, novos meios para combater o Mtb são urgentemente necessários. Nesse contexto, desenvolvemos um ensaio fenotípico visual in vitro que conta com o monitoramento da invasão e multiplicação de Mtb em células hospedeiras por microscopia automatizada de fluorescência confocal³. A adaptação do ensaio em placas de microtização de 384 poços em combinação com aquisição e análise automatizada de imagens permitiu a triagem de alto conteúdo/high-throughput (HC/HTS) de bibliotecas de média escala de compostos, siRNAs e mutantes bacterianos. A triagem de uma biblioteca RNAi de genoma em larga neste ensaio fenotípico permitiu assim a identificação dos principais fatores hospedeiros envolvidos no tráfico de Mtb e na replicação intracelular, mas também a elucidação de vias hospedeiras exploradas pelo bacilo tubérculo. Outra adaptação deste ensaio fenotípico em particular foi para a identificação de fatores bacterianos essenciais à persistência intra-fagossômica de Mtb. Por exemplo, a prisão do amadurecimento fágora é considerada como um dos principais mecanismos que facilita a sobrevivência e a replicação do Mtb no macrófago. O monitoramento da localização subcelular de mutantes eliminados de Mtb em compartimentos fluorescentes rotulados-ácidos permitiu a identificação de genes bacterianos envolvidos no processo de sobrevivência⁴. Finalmente, a imagem de alto teor de Mtb também oferece um excelente método para quantificar a eficiência das drogas para inibir vários fenômenos como o crescimento bacteriano intracelular³. Ao todo, esse tipo de ensaio fenotípico de alto rendimento permite acelerar a descoberta de drogas contra a TB e os dados coletados por essas diferentes abordagens contribuem para uma melhor compreensão da manipulação do hospedeiro exercida pelo Mtb.

1. Triagem de siRNA de genoma de alto rendimento

Triagem realizada em uma linha celular tipo-II humana modelo A549 após infecção com Mtb H37Rv expressando proteína fluorescente verde (GFP). Este procedimento está descrito na Figura 1A.

1. Resuspend a biblioteca de siRNA seca que é armazenada em placas maternas (placas de 96 poços) com 1x tampão siRNA para atingir uma concentração de 4 μM, em seguida, transferir 10 μl da mistura para uma placa filha de 384 poços (placa filha 1).
2. Adicione 10 μl de tampão de siRNA de 1x na placa da filha 1 para diluir o siRNA em 2 vezes. Após a ressuspensão do siRNA, as placas são seladas com vedação de alumínio descascado e podem ser armazenadas a -20 °C pelo menos 6 meses e até 2-3 anos, mas o tempo de armazenamento pode variar dependendo das recomendações do fabricante da biblioteca siRNA.
3. Diluir siRNAs na placa da filha 1 no prato da filha 2 para atingir uma concentração de 500 nM. Após a ressuspensão do siRNA, as placas são seladas com vedação de alumínio descascado e podem ser armazenadas a -20 °C pelo menos 6 meses e até 2-3 anos, mas o tempo de armazenamento pode variar dependendo das recomendações do fabricante da biblioteca siRNA.
4. Antes de usar, descongele o prato da filha 2 em temperatura ambiente.
5. Pegue 2,5 μl de siRNA da placa da filha 2 e coloque em uma placa de ensaio de 384 poços.
6. Na mesma placa de ensaio de 384 poços na etapa 1.5, adicione 2,5 μl de controle negativo e positivo siRNA aos seus respectivos poços.
7. Diluir o reagente de transfecção em 1x D-PBS para produzir solução suficiente para fornecer reagente de transfecção de 0,1 μl em cada poço e preinubar a solução de transfecção diluída à temperatura ambiente por 5 minutos.
8. Adicione 7,5 μl da mistura de solução de reagente/PBS de transfecção a cada poço na placa de ensaio e incubar por 30 minutos à temperatura ambiente.
9. Adicione 40 μl de células A549 (1.500 células/poço) suspensas em RPMI 1640 médio suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS). Manter as células por um período de incubação de 3 dias a 37 °C em uma atmosfera contendo 5% de CO₂. Essas células se dividem a cada 24 horas, portanto cerca de 12.000 células estão nos poços três dias após a transfecção.
10. Lave uma cultura MTB H37Rv de duas semanas de idade expressando com D-PBS (livre de MgCl₂ e CaCl₂) por centrifugação a 4.000 x g por 5 min e descarte as lavagens. Repita esta etapa 3x. (Para condições de culturaGFP-Mtb H37Rv ver Protocolo 3).
11. Suspenda a pelota bacteriana em 10 ml de RPMI 1640 médio suplementado com 10% de FBS e decante por 1 hora à temperatura ambiente para permitir agregados bacterianos aos sedimentos.
12. Recolher o supernascer bacteriano e medir OD₆₀₀ (OD₆₀₀ deve estar entre 0,6-0,8) e GFP-fluorescência (valor RFU) usando um leitor de microplaca para determinar a concentração bacteriana. Calcule o título da suspensão utilizando uma linha de regressão de referência exibindo valor RFU = f (valor da UFC) que havia sido gerado antes do experimento em outra cultura que havia sido preparada nas mesmas condições. Prepare a suspensão bacteriana contendo 2,4 x 10⁶ bactérias/ml, o que corresponde a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5.
13. Retire o meio na placa de ensaio de 384 poços e adicione 25 μl de suspensão bacteriana recém-preparada.
14. Incubar a placa de ensaio de 384 poços a 37 °C por 5 horas em uma atmosfera contendo 5% de CO₂.
15. Remova o meio e lave suavemente as células com meio RPMI suplementado com 10% de FBS 3x.
16. Para matar as bactérias extracelulares restantes, trate as células com 50 μl de meio RPMI-FBS fresco contendo 50 μg/ml de amikacina a 37 °C por 1 hora em uma atmosfera contendo 5% de CO₂.
17. Remova a amikacina de média contenção e adicione 50 μl de meio RPMI fresco complementado com 10% de FBS. Incubar a placa de ensaio de 384 poços a 37 °C durante 5 dias em uma atmosfera contendo 5% de CO₂.
18. Antes da aquisição de imagem, adicione 10 μl de 30 μg/ml recém-preparados de DAPI em PBS (concentração final 5 μg/ml) e incubar por 10 min a 37 °C.
19. Carregue a placa em microscópio confocal automatizado.
    
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20. Defina os parâmetros de exposição. Fluorescência de REGISTRO DAPI usando laser de excitação 405 nm com filtro de emissão 450 nm e fluorescência GFP usando laser de excitação 488 nm com filtro de emissão 520 nm.
    
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21. Selecione os poços e os campos em cada poço a ser adquirido, que é então chamado de layout e parâmetros de subcamada.
    
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22. Gere o arquivo de experimento usando os parâmetros das etapas 1.20 e 1.21, e execute a aquisição automática.
    
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23. Transfira imagens para o servidor remoto.
    
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24. Avalie imagens usando software de análise de imagens. Detecte núcleos celulares do canal DAPI usando algoritmo de detecção de núcleos e a área bacteriana do canal GFP usando o algoritmo de propriedades de intensidade de pixel(Figura 4A).

Nota: Este protocolo é otimizado para estudar o efeito do silenciamento genético no crescimento de Mtb intracelular. Mtb é uma bactéria de crescimento lento que divide a cada 20 horas em condições ideais. Após 5 dias após a infecção, a quantidade de Mtb extracelular ainda é baixa na ausência de lise celular e não afetou a qualidade da análise. Este protocolo deve ser otimizado em termos de tempo de tratamento com antibióticos e tempo de incubação para ser adaptado para telas de siRNA usando bactérias de crescimento rápido como Mycobacteria smegmatis e Escherichia coli que são amplamente liberadas e podem infectar novas células.

2. Triagem composta de alto rendimento

Triagem realizada em células hospedeiras infectadas por Mtb H37Rv. Este procedimento está descrito na Figura 1B.

1. Descongele as placas-mãe de 384 poços contendo a biblioteca composta solubilizada em DMSO 100%. Transfira 0,5 μl dos compostos em placas filhas de 384 poços contendo 10 μl de RPMI 1640 médio suplementado com 10% de FBS.
2. Lave uma cultura MTB H37Rv de duas semanas de idade expressando com D-PBS (livre de MgCl₂ e CaCl₂) por centrifugação a 4.000 x g por 5 min e descarte as lavagens. Repita esta etapa 3x (Para condições de culturaGFP-Mtb H37Rv ver Protocolo 3).
3. Suspenda a pelota bacteriana em 10 ml de RPMI 1640 médio suplementado com 10% de FBS e decante por 1 hora à temperatura ambiente para permitir agregados bacterianos aos sedimentos.
4. Recolher o supernascer bacteriano e medir OD₆₀₀ (OD₆₀₀ deve estar entre 0,6-0,8) e GFP-fluorescência (valor RFU) usando um leitor de microplaca. Calcule o título da suspensão usando uma linha de regressão de referência exibindo valor RFU = f (valor da UFC) que havia sido gerado antes do experimento. A concentração típica é de 1 x 10⁸ bactérias/ml.
5. Colher macrófagos humanos primários de 6 dias de idade a 4 x 10⁵ células/ml em RPMI 1640 médio suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 50 ng/ml recombinando humano M-CSF (Para purificação de células de monócito de sangue periférico humano e diferenciação de macrófagos ver Protocolo 4).
6. Incubar as células primárias diluídas com bacilos em diferentes MOI, variando de 1 a 5, em suspensão com leve agitação a 90 rpm por 2 horas a 37 °C.
7. Lave as células infectadas por centrifugação a 350 x g para remover as bactérias extracelulares. Após cada etapa de centrifugação, resuspense a pelota em RPMI 1640 médio suplementado com 10% de FBS. Repita esta etapa 2x.
8. Suspenda as células infectadas em RPMI 1640 médio suplementado com 10% de FBS e amikacina a 50 μg/ml e incubar a suspensão com leve agitação por 1 hora a 37 °C.
9. Remova o meio de cultura celular contendo amikacina por centrifugação a 350 x g e lave as células infectadas com meio RPMI completo 1640 suplementado com 10% de FBS e 50 ng/ml humano recombinante M-CSF. Repita uma vez.
10. Adicione 40 μl da suspensão dos macrófagos infectados na mesma placa de ensaio na etapa 2.1, que já contém 10 μl das diluições compostas. A concentração final de DMSO em cada poço chegou agora a 1%.
11. Incubar as placas de ensaio por 5 dias a 37 °C em uma atmosfera contendo 5% de CO₂.
12. Manche as células vivas com corante fluorescente vermelho-permeante de células.
13. Carregue a placa em microscópio confocal automatizado.
    
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14. Defina os parâmetros de exposição. Registre fluorescência distante-vermelha usando laser de excitação de 640 nm com filtro de emissão 690 nm e fluorescência GFP usando laser de excitação 488 nm com filtro de emissão de 520 nm.
    
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15. Selecione os poços e os campos em cada poço a ser adquirido, que é então chamado de layout e parâmetros de subcamada.
    
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16. Gere o arquivo de experimento usando os parâmetros das etapas 2.14 e 2.15 e execute a aquisição automática.
    
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17. Transfira imagens para o servidor remoto.
    
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18. Avalie imagens usando software de análise de imagens. Detecte a área celular do canal vermelho usando o algoritmo de propriedades de intensidade de pixel e área bacteriana do canal GFP usando o algoritmo de propriedades de intensidade de pixel(Figura 4B).

Nota: Este protocolo pode ser adaptado para a triagem da biblioteca mutante Mtb substituindo compostos por mutantes que expressam uma proteína fluorescente (Um mutante bem/Um) (Figura 1C, veja também Brodin et al. ⁴). Mutantes fluorescentes são primeiro semeados em poços (20 μl de suspensão bacteriana por poço). As bactérias são então recuperadas por 30 μl de suspensão celular. Após centrifugação a 350 x g por 1 min, a placa é incubada a 37 °C em uma atmosfera contendo 5% de CO₂. O tempo de incubação e o MOI dependem do ensaio. Como exemplo, para visualização de eventos celulares precoces, como acidificação de fagosome, as células podem ser infectadas por 2 horas com MOI variando de 1 a 20. Os lysosomos são manchados usando corante lysotracker a 2 μM por 1,5 h a 37 °C em uma atmosfera contendo 5% de CO 2 e_depois fixado com 10% de formalina ou 4% de paraformaldeído (PFA). As imagens confocal são adquiridas e finalmente analisadas usando scripts de análise de imagem com algoritmos apropriados para detecção de lysososomes e localização subcelular⁴.

3. Proteína Fluorescente Verde Expressando Mycobacterium tuberculosis H37Rv (GFP-H37Rv) Condições de Cultura

Para armazenamento a longo prazo, o GFP-H37Rv foi congelado em D-PBS (cerca de 1 x 10^{8 micobactérias} por frasco).

1. Resuspend um frasco de caldo congelado de GFP-H37Rv em um frasco Erlenmeyer contendo 50 ml de caldo 7H9 médio suplementado com enriquecimento Middlebrook OADC 10%, Glicerol 0,5%, Tween-80 0,05% e Hygromycin B (50 μg/ml).
2. Incubar 8 dias a 37 °C.
3. Medir OD₆₀₀ da cultura GFP-H37Rv.
4. Diluir a cultura GFP-H37Rv para obter OD₆₀₀ = 0,1 em caldo fresco 7H9 complementado com enriquecimento Middlebrook OADC 10%, Glicerol 0,5%, Tween-80 0,05% e Hygromycin B (50 μg/ml).
5. Incubar o GFP-H37Rv a 37 °C por mais 8 dias antes de usar para o ensaio.

4. Purificação de células de monócitos de sangue periférico humano a partir de preparação de sangue inteiro ou casaco de buffy

1. Diluir a bolsa de sangue 2x em 1x D-PBS (livre de MgCl₂ e CaCl₂) contendo 1% de FBS.
2. Isole os monócitos por Centrifugação gradiente de densidade ficoll a 400 x g por 20 min.
3. Recolher os monócitos isolados.
4. Lave os monócitos 3x com 1x D-PBS (livre de MgCl₂ e CaCl₂) contendo 1% de FBS por centrifugação a 400 x g por 10 minutos à temperatura ambiente.
5. Concentre as células até 1 x 10⁷ células/ml.
6. Purificar monócitos usando contas magnéticas CD14 de acordo com o protocolo do fabricante (ver Materiais).
7. Após a purificação de cd14-monócitos, semeou as células em 1,5 x 10⁶ células/ml em RPMI 1640 complementada com 10% FBS e 40 ng/ml de Fator Estimulante da Colônia de Macrófagos Humanos (hM-CSF) e incubada por 4 dias a 37 °C em uma atmosfera contendo 5% CO₂.
8. Após 4 dias substitua o meio por RPMI fresco 1640 complementado com 10% de FBS e 40 ng/ml de hM-CSF e incubado por 2 dias a 37 °C em uma atmosfera contendo 5% de CO₂.
9. Após 6 dias, as células podem ser usadas para o ensaio.

Triagem de siRNA de genoma de alto rendimento

Mtb é capaz de colonizar células imunes in vitro, bem como várias outras células epiteliais pulmonares. Por exemplo, o Mtbé capaz de infectar e danificar células epiteliais A549 que são comumente usadas como modelo para pneumócitos tipo II humano5-7. O Dectin-1 foi relatado como um receptor de células hospedeiras envolvido na absorção de Mtb, resposta proinflamatória e efeito antibacteriano no crescimento micobacteriano intracelular nas células A5498. a condição de siRNA descrita no Protocolo 1 levou a 85% da eficiência de silenciamento (dados não mostrados). Silenciar a expressão Dectin-1 com siRNA levou a uma diminuição da quantidade de micobactérias intracelulares em células A549. De fato, após 3 dias de silenciamento e 5 dias de infecção, a porcentagem de células infectadas é reduzida duas vezes em células A549 silenciadas em Dectin-1 em comparação com células transfeinadas com siRNA não-alvo(Figuras 2A e 2B). Aplicamos a normalização baseada em amostra de siRNA direcionado Dectin-1 em comparação com a luta para definir a pontuação Z. Como mostrado na Figura 2C,obtivemos uma média de pontuação Z em torno de -15 para siRNA alvo Dectin-1. O Dectin-1 pode ser usado como controle positivo para a tela siRNA para descobrir outro novo fator hospedeiro envolvido na colonização de Mtb em pneumócitos que poderiam ter o mesmo fenótipo que aquele com o siRNA de Dectin. O uso de um siRNA impactando no fenótipo como controle em cada microplacão durante a tela permite a normalização de cada placa, o que é útil quando se quer realizar toda a análise da tela do genoma. O parâmetro estatístico Z' foi de 0,1 utilizando normalização baseada em controle em dectin1 de scramble e siRNA, que é um valor aceitável para a validação dos dados de triagem do siRNA.

Triagem composta de alto conteúdo

A eficiência composta no crescimento bacteriano intracelular é avaliada pelo estabelecimento de uma curva de resposta a doses (RDC) e normalizada para os controles compostos positivos de referência e solventes compostos negativos. DRC representativo de dois compostos de referência, isoniazida (INH) e rifampicina (RIF), ativo contra o crescimento de Mtb são mostrados na Figura 3. Essas curvas são obtidas em macrófagos primários humanos infectados por uma cepa Mtb H37Rv expressante gfp, com leitura após 5 dias pós-infecção. DMSO e INH em uma concentração final de respectivamente 1% e 0,1 μg/ml são comumente utilizados como controles negativos e positivos, fornecendo níveis basais de eficiência (0 e 100%) (Figura 3A). Seguindo o processo de análise de imagem detalhado na Figura 4B,os dados multiparmétricos são extraídos de imagens de fluorescência confocal de macrófagos infectados-humanos tomados por microscópio confocal automatizado. Compostos ativos impactando na replicação intracelular de Mtb em células hospedeiras levaram a uma diminuição da carga micobacteriana, que corresponde à área do sinal GFP em células em imagens(Figura 3B). A razão entre a área bacteriana intracelular e a área celular total, calculada por meio de software de análise baseado em imagem, é traçada em função da concentração composta, que gera a RDC (Figura 3B). Essas curvas permitem a determinação tanto da concentração necessária para diminuir a carga bacteriana em 50% (IC50) quanto da concentração mínima necessária para inibir 99% da replicação bacteriana (MIC99) (Figura 3C). Z' baseado no controle DMSO 1% e no controle INH 0,1 μg/ml foi de 0,49. Este Z', muito perto de 0,5, é aceitável para validar este ensaio.

Figura 1. Abordagens visuais de triagem de alto conteúdo. Representação esquemática do sistema modelo de infecção de Mtb utilizado para as telas siRNA(A),compostos químicos(B) e Mtb mutantes(C). (A) tela da biblioteca siRNA: as células foram transfecidas com siRNA por 3 dias em placas de 384 poços usando método de transfecção reversa. as células transfetaturadas de siRNA foram infectadas comGFP-Mtb e incubadas por 5 dias a 37 °C em uma atmosfera contendo 5% de CO2. As células foram então manchadas e as imagens foram coletadas usando um microscópio confocal automatizado. (B) Tela da biblioteca dos compostos: os compostos foram distribuídos em placas de 384 poços. Suspensão celular eGFP-Mtb foram incubados juntos por 2 horas a 37 °C. As células infectadas foram semeadas nas placas e incubadas por 5 dias a 37 °C em uma atmosfera contendo 5% de CO2. As células foram então manchadas e as imagens foram coletadas usando um microscópio confocal automatizado. (C) Biblioteca mutante fluorescente-Mtb: os mutantes fluorescentes de Mtb foram semeados em placas de 384 poços e a suspensão da célula hospedeira foi distribuída. O tempo de incubação variou dependendo do ensaio. As células ou vesículas celulares foram manchadas antes da aquisição automatizada de imagens. Clique aqui para ver imagem maior.

Figura 2. Dectin-1 silenciando impactos na colonização de Mtb em células A549. (A) Imagens confocal representativas (lente de ar 10X) de células A549 transfeinadas com siRNA não-alvo (scramble) ou com siRNA específica para Dectin-1 e infectadas com GFP-Mtb H37Rv (MOI5) por 5 dias. A barra de escala representa 200 μm (A)GFP-Mtb H37Rv foram visualizados em verde e as células em vermelho. O número de células (A. Detecção de células) e a carga intracelular GFP-MTB H37Rv (área bacterianaA.) foram determinados por meio de software de análise baseado em imagem. (B) Representação gráfica da porcentagem de células A549 infectadas em 5 réplicas (w1 a w5) de Scramble siRNA (círculos azuis) e siRNA Dectin-1 (círculos vermelhos). (C) Representação gráfica da média de pontuação Z do SiRNA Scramble e do siRNA Dectin-1. (*** p-valor < 0,0001). Clique aqui para ver imagem maior.

Figura 3. Curva de resposta de dose de compostos de referência ativa contra Mtb em macrófagos humanos. (A e B) Imagens confocal representativas (lente de água 20X) de macrófagos humanos (vermelho, célula rotulada com corante fluorescente vermelho) infectadas com GFP-Mtb H37Rv (verde) com um MOI1 por 5 dias. A barra de escala representa 50 μm. (A) Imagens de células infectadas incubadas com DMSO 1% utilizadas como controle negativo no ensaio. (B) Imagens de células infectadas incubadas com concentração crescente de dois compostos de referência isonazid (INH) e rifampicina (RIF). (C) Curvas de dose-resposta (RDC) de INH e RIF. A análise baseada em imagem permitiu a determinação da RDC para cada composto testado. A RDC representa a razão entre a área intracelular de GFP-bacteriana e a área celular total (eixo Y), em função da concentração composta (escala de tronco, x-eixo). Em cada gráfico, a RDC do composto foi normalizada à do controle negativo DMSO 1% (inibição de 0%) e do controle positivo INH a uma concentração de 0,1 μg/ml (inibição de 100%). Para cada composto, a concentração necessária para inibir 50% da colonização bacteriana (IC50) e a concentração inibitória mínima (MIC99) foram calculadas a partir da RDC. Clique aqui para ver imagem maior.

Figura 4. Análise padrão baseada em imagem para determinar micobactérias intracelulares fluorescentes. Imagens de placas de 384 poços foram adquiridas usando um microscópio confocal automatizado. Neste caso, foram registradas 4 imagens diferentes do mesmo poço (campos). Cada campo foi então analisado usando o software de análise baseado em imagem Acapella 2.6 (Perkin Elmer). (A) Cada campo continha dois canais (duas cores), um para as bactérias (verde) e outro para os núcleos celulares (canal azul), que foram segmentados usando o seguinte algoritmo: i) detecção de núcleos usando um procedimento de Acapella embutido, ii) detecção de citoplasma, com base na população de núcleos, utilizando um procedimento embutido de Acapella, iii) detecção de bactérias mantendo apenas pixels que a intensidade é superior a um limiar definido manualmente, iv) mesclando posição celular com posição de bactéria para identificar células infectadas. Os resultados finais, expressos em média dos quatro campos, são a área bacteriana total, o número total de células, o percentual de células infectadas e a área bacteriana por célula (média de todas as células infectadas). (B) Cada campo continha dois canais, um para as bactérias (canal verde) e outro para os núcleos celulares e citoplasma (canal vermelho distante), que foram segmentados usando o seguinte algoritmo: i) filtrando o canal original usando um filtro anti-mediano, ii) manter apenas pixels que a intensidade é superior a um limiar definido manualmente (cada canal tem seu próprio limiar), iii) contando o número restante de pixels para cada canal, iv) mesclando canais e contando o número de pixels compartilhados por bactérias e núcleos para quantificar bactérias intracelulares. Os resultados finais, expressos em média dos quatro campos, são a área bacteriana total, a área celular total, a área total de bactérias intracelulares e a razão entre a área bacteriana intracelular e a área total das células. Clique aqui para ver imagem maior.

Nenhum conflito de interesses declarado.