Isolamento de Blood-derivado do navio Multipotentes Precursores do músculo-esquelético humano

Resumo

Vasos sanguíneos dentro do porto músculo esquelético várias populações precursoras multi-linhagem humana que são ideais para aplicações de regeneração. Este método de isolamento permite purificação simultânea de três populações de células multipotentes precursor, respectivamente, de três camadas estruturais de vasos sanguíneos: as células endoteliais de miogênica íntima, pericitos de mídia e células adventícias de adventícia.

Resumo

Desde a descoberta do tronco mesenquimais / células do estroma (CTM), a identidade nativa e localização de MSCs foram obscurecidos por seu isolamento retrospectiva na cultura. Recentemente, usando classificação de células activada por fluorescência (FACS), e que outros investigadores prospectivamente identificada e purificada três subpopulações de células precursoras pluripotentes associados à vasculatura do músculo esquelético humano. Estes três populações de células: células endoteliais miogênica (SAMU), pericitos (PCs) e células adventícias (SCA), estão localizadas, respectivamente, para as três camadas estruturais dos vasos sanguíneos: íntima, média e adventícia. Todas estas células-tronco derivadas de sangue-embarcação humana (hBVSC) populações não só expressam marcadores MSC clássicos, mas também possuem potenciais de desenvolvimento mesodérmicas semelhantes a MSCs típicas. Anteriormente, SAMU, PCs e ACs foram isolados através de protocolos distintos e, posteriormente caracterizada em estudos separados. A corrente de prot isolamentoocol, através de modificações no processo de isolamento e ajustes nos marcadores de superfície celular seletivos, nos permite purificar simultaneamente todas as três subpopulações hBVSC por FACS de uma única biópsia muscular humana. Este novo método não só irá agilizar o isolamento de várias subpopulações BVSC, mas também facilitar futuras aplicações clínicas de hBVSCs para fins terapêuticos distintos.

Introdução

Músculo-esquelético humano tem sido considerada uma fonte clinicamente atraente de células tronco / progenitoras. O músculo esquelético contém não só cometeu progenitores miogênicos, mioblastos esqueléticos, mas também células-tronco miogênicas primitivos, incluindo células satélites e células-tronco derivadas de músculos (MDSCs) ^1. O uso de células humanas derivadas de músculos tronco / progenitoras, autólogo ou alogênico, em medicina regenerativa tem sido extensivamente estudada em modelos animais pré-clínicos e clínicos. As aplicações de regeneração de células musculares tronco / progenitoras variam de regenerar o músculo distrófico na distrofia muscula....

Protocolo

1. Muscle Processing Biópsia

1. Preservar biópsia do músculo esquelético humano em gelo em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 5% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de Penicilina-Estreptomicina (P / S) durante o transporte.
2. Após a recepção da biópsia do músculo, remover a amostra do recipiente de transporte e de lavá-lo duas vezes em solução salina tamponada com fosfato (PBS) suplementado com solução de antibiótico-antifúngico 2% (A / D), sob condições estéreis.
3. Remover o tecido adiposo e tecido conectivo anexado com tesouras e pinças estéreis em DMEM suplementado com 2% de A / D.
4. Remover grandes vasos sanguíneos ....

Resultados

Parâmetros de FACS são primeiro corrigido com base nos dados obtidos a partir do controlo não corado, controlos negativos, controlos positivos e com uma única cor. Após a exclusão de células mortas, a suspensão de células marcadas com fluorescência é submetido a uma série de marcadores de superfície celular selecções negativas e positivas. Primeiro, as células CD45 ⁺ são fechadas antes de CD56 ⁺ CD56 ^- as células são separadas da CD45 ^- fracção. O CD56 ⁺ fracção é s.......

Discussão

Identificação e purificação de subpopulações hBVSC representam um grande avanço na compreensão da MSC ontogenia. Há evidências crescentes, indicando a origem perivascular de MSCs ea associação entre células precursoras de tecidos específicos e vasos sanguíneos ^22-25. Além disso, a capacidade para isolar sub-populações homogéneas de hBVSCs auxilia ainda mais a compreensão do MSC heterogeneidade e biologia celular vascular ^26.

Nos últimos anos, MECs, PCs e ACs foram ident.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Colagenase tipo 1	Sigma	C5894	Frasco estéril
Colagenase tipo 2	Sigma	C1764	Frasco estéril
Colagenase tipo 4	Sigma	C1889	Frasco estéril
Anti-humano CD34 APC	BD Pharmingen	555824	Manter estéril
Anti-humano CD45 APC-Cy7	BD Pharmingen	557833	Manter estéril
Anti-humano CD56 PE-Cy7	BD Pharmingen	557747	Mantenha estéril
Anti-humano CD144 PE	Beckman Coulter	A07481	Mantenha estéril
Anti-humano CD146	FITC AbD Serotec	MCA2141F	Mantenha estéril
FACS Aria II Citômetro de fluxo	Becton-Dickinson
EGM-2 meio completo	Lonza	CC-3162	Para cultura de PCs (somente P0)
DMEM glicose alta (1X), líquido, com L-glutamina, sem piruvato de sódio	Invitrogen	11965	Para cultura de PCs
DMEM glicose alta (1X), líquido, com L-glutamina, com piruvato de sódio	Invitrogen	11995	Para cultura de MECs e ACs
Soro fetal bovino	Invitrogen	10437-028
Soro de cavalo inativado pelo calor	Invitrogen	26050-088
Penicilina/estreptomicina	Invitrogen	15140-122
Antibiótico-antimicótico (100X)	Invitrogen	15240-062
Tripsina-EDTA 0,5% (10X)	Invitrogen	15400-054
Dulbecco' s PBS sem cálcio e magnésio	Invitrogen	14190-250
Extrato de embrião de pintinho	Filtro químico preciso	CE650T-10	antes do uso