Avaliando Clearance fagocítica de morte celular em Curso Experimental de Ligatable fluorescentes Sondas

Resumo

Nós apresentamos uma nova técnica de fluorescência para seletiva marcação in situ de células fagocíticas ativos, o que claro off corpos celulares em acidente vascular cerebral. A abordagem é importante para a avaliação da reacção à isquemia cerebral uma vez que só uma pequena proporção de fagócitos presentes no cérebro isquémico participar na depuração de morte celular.

Resumo

Nós descrevemos uma nova abordagem histoquímica para visualização de folga fagocitária em isquemia cerebral focal. A abordagem permite o estudo da eliminação de células mortas no acidente vascular cerebral por fagócitos de qualquer linhagem celular de gestão de resíduos. Apesar de numerosas células de origens diferentes, que são capazes de fagocitose estão presentes no cérebro isquémico, apenas uma parte deles activamente engolir e digerir corpos celulares. A visualização seletiva, quantificação e análise de tais de gestão de resíduos fagocitária ativa são úteis na avaliação da resposta do cérebro à isquemia. Remoção eficiente morte celular é importante para a recuperação do cérebro de uma lesão isquêmica, uma vez que abre o caminho para os processos regenerativos subseqüentes. A falha para limpar os cadáveres que resultaria numa reacção tóxica causada por ADN não degradado e proteínas. O procedimento descrito utiliza sondas fluorescentes ligados seletivamente por uma topoisomerase viral para quebras de DNA característicos produzidos em todos os fagócitos durante imersãoe digestão das células irreversivelmente danificadas por isquemia. O método é uma nova ferramenta para a investigação da reação cerebral à isquemia.

Introdução

Acidente vascular cerebral isquêmico induz mudanças profundas no tecido cerebral afetada. Ela inicia a morte celular em massa, o que leva à rápida activação das células fagocíticas residentes de origem da microglia. É também desencadeia a infiltração de cérebro isquémico por vários tipos de fagócitos profissionais derivadas do sangue, incluindo neutrófilos, macrófagos, células dendríticas e células mastro ^1,2.

Ainda está em discussão se esta resposta à lesão isquêmica desempenha um papel positivo ou negativo. Embora a fagocitose após o AVC pode ser benéfico porque ele limpa as células mortas e suprime a inflamação, ele também gera espécies reativas de oxigênio tóxicos que afetam a sobrevivência neuronal e exacerbando o dano tecidual ^1-5.

Embora vários tipos de células fagocíticas infiltrar cerebral isquêmico, nem todos eles participar na gestão de resíduos por engolindo corpos celulares e abrindo caminho para processos regenerativos ^1-3. Esta creates um requisito para identificação seletiva de células de gestão de resíduos que realizam folga fagocitária de morte celular em acidente vascular cerebral. Quando imaginando essas células de gestão de resíduos em atividade, também é importante para responder à questão de como eficientemente eles degradam os corpos celulares engoliram. A degradação efetiva e completa do DNA da célula morrer na fagocitose é essencial, pois evita a auto-imunização e a liberação de material nuclear patológica ^6.

Aqui apresentamos novas sondas que usam quebras específicas de DNA como marcadores de células fagocíticas ativas. Estas pausas assinatura são produzidos exclusivamente durante quebra de núcleos tragado dentro das células de gestão de resíduos funcionais. Por conseguinte, as sondas de etiquetar selectivamente apenas os fagócitos que engolir e digerir activamente corpos celulares. Eles também permitem observar a intensidade e a conclusão de repartição de ADN após a imersão. As sondas são úteis na avaliação de intensidade e efficirência de folga fagocitária.
As novas sondas de contar com um marcador não baseadas em proteína e, portanto, pode ser particularmente vantajoso em estudos de acidente vascular cerebral, em que grande dano isquémico pode perturbar a morfologia celular ou empobrecem marcadores à base de proteínas, especialmente no interior da zona do núcleo isquémico.

O princípio da técnica é apresentada na Figura 1. A figura mostra as sondas oligonucleotídicas em forma de grampo ligados pela topoisomerase vaccinia enzima (VACC TOPO) de ADN 5'OH termina gerado por lisossomal DNase II durante a digestão do ADN ^7.

Protocolo

O método é adequado para, cortes de tecidos fixados em formol parafina. A técnica é demonstrada aqui na sua aplicação a acidente vascular cerebral experimental em ratos.

1. Componentes preparando para tiramida Signal Amplification (TSA) do Sistema

Embora o aperfeiçoamento baseia-TSA é usado na fase final da rotulagem, preparando-se para esta reacção pode ter mais do que 1 hora. Por isso, é conveniente para fazer os reagentes TSA antes de iniciar a marcação.

1. Faça solução estoque fluorophore tiramida. Utilizar o reagente fluoróforo tiramida fornecido em frascos individuais com o kit de marcação de TSA. Adicionar 300 mL de DMSO para o frasco de reagente tiramida. Solução estoque tiramida fluoróforo é estável durante pelo menos 3 meses quando armazenadas a 4 ° C.
2. Adicione o tampão de lavagem de TNT contendo: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5; NaCl 0,15 M; 0,05% de Tween-20. Se necessário 0,3% de Triton X-100 pode ser substituído por 0,05% de Tween-20. Alternattivamente PBS pode ser utilizado como tampão de lavagem.
3. Adicione TNB tampão contendo bloqueio: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5; NaCl 0,15 M; 0,5% de reagente de bloqueio (fornecido com o kit). Para dissolver completamente o reagente bloqueador, lentamente adicionar em pequenos incrementos para o buffer enquanto se agitava. Aquecer esta solução gradualmente a 55 ° C com agitação contínua. Isso pode levar de 30-60 min. A solução vai aparecer leitoso. Traga à temperatura ambiente antes de usar. Alíquotas e armazenar a -20 ° C para uso a longo prazo.

2. Preparação de Seções

Use os slides com 5 seções montadas m de espessura de corte de tecidos fixados em formalina.

1. Trate seções com xilol por 15 min.
2. Rehidratar seções da seguinte forma: molho em 96% EtOH 2x por 5 minutos cada; molho em 80% EtOH por 5 min; lavar 2x com água durante 5 min cada.
3. Adicione a solução de trabalho de proteinase K por diluição de solução stock de Proteinase K a 50 mg / ml em PBS.
4. Adicionar ProteinaseK solução de trabalho para seções. Incubar 15 min a 23 ° C. O volume da solução e o tempo de digestão pode ter de ser ajustada dependendo do tamanho dos cortes e tipos de tecidos. Para uma secção pequena (inferior a 5 mm de diâmetro) de 50 ul de solução de proteinase seria suficiente. Secção de um tamanho médio (~ 10 mm de diâmetro), adicionar 100 ml de solução de Proteinase K. Para grandes seções do volume da solução podem ser ampliados. Em todos os casos ter o cuidado de evitar overdigestion de seções que leva à completa perda de sinal e destrói morfologia do tecido. Isso muitas vezes acontece se o tempo de incubação superior a 25 min.
5. Lave os cortes em água destilada 2x água por 5 minutos cada. Preparar a mistura de rotulagem contendo sonda ativa enquanto seções estão na água.

3. De coloração à base de TOPO VACC

1. Prepare a solução de sonda ativa, combinando o seguinte:
   Água - 11,75 mL
   1 M de Tris-HCl, pH 7,4-1,25 μl
   100 pmol de 12-base de balanço suicídio oligonucleotídeo - 1 ml
   100 pmoles do adaptador oligonucleótido - 1 ul
   50 pmol VACC TOPO - 10 ul
2. Misture delicadamente por pipetagem. Incubar à temperatura ambiente (23 ° C) durante 15 min para permitir a activação da sonda.
3. Tome seções do frasco de lavagem e aspirar a água restante. Em seguida, aplique a solução de sonda ativo preparada no passo 3.1 (25 ul por ~ seção 10 x 10 mm).
4. Lamela as secções e incubar durante 15 min a 23 ° C. Dip desliza na água para remover suavemente lamelas. Lavar em água 3x por 5 min cada.

4. TSA Signal Enhancement

1. Cobrir as secções de tecido com TNB tampão de bloqueio preparado anteriormente e incubar numa câmara húmida durante 30 minutos à temperatura ambiente (23 ° C).
2. Prepara-se uma diluição de conjugados de estreptavidina-peroxidase de rábano (SA-HRP) em TNB tampão de bloqueio 1:100. Aspirar TNBTampão de bloqueio e aplicar a solução de SA-HRP. Incubar as lâminas com SA-HRP durante 30 minutos à temperatura ambiente. Use volume de reagente suficiente para cobrir a secção de tecido, geralmente de 100 mL por seção.
3. Lave as lâminas 3x durante 5 minutos cada em tampão de lavagem de TNT (ou PBS), à temperatura ambiente.
4. Prepara-se uma diluição de 1:50 de estoque tiramida fluoróforo em 1x Amplificação diluente do kit. Pipetar a solução de trabalho fluorophore tiramida em cada slide. Use solução de trabalho suficiente para cobrir totalmente a secção de tecido, geralmente de 100 mL por seção. Faça solução de trabalho fluorophore tiramida imediatamente antes de cada marcação. A solução não pode ser reutilizado, então descartar qualquer porção não utilizada do que após marcação.
5. Incubar as lâminas à temperatura ambiente durante 3 a 10 min. Monitorar aumento de fluorescência com um microscópio até os primeiros sinais de estruturas pode ser visto. Avançar rapidamente para lavar passo.
6. Lave as lâminas 3x por 5 min cada em tampão de lavagem TNT (ou PBS) no quarto temperatura com agitação.
7. Adicione a solução antifading com DAPI e lamela. Observar sob o microscópio de fluorescência. Para visualizar DAPI e FITC usar um conjunto de filtro passa-banda:
   D490/40 FITC excitação, emissão 520/10; DAPI D360/40 excitação, emissão 460/20, ou semelhante.

Resultados

O princípio da técnica para rotulá fagócitos de gestão de resíduos ativos é apresentado na Figura 1. O esquema demonstra que a detecção do produto em três etapas. O primeiro passo envolve a activação da sonda (figura 1A); na segunda etapa, a sonda é activado ligado a quebras de ADN específicos em secções de tecido (Figura 1C); a terceira etapa inclui a amplificação do sinal de fluorescência (Figura 1D). Em uma explicação mais detalhada, a detecção é o s...

Discussão

Neste vídeo podemos demonstrar, no formato de secção de tecido, como rotular fagócitos ativos que a morte de células claras em isquemia cerebral focal. A técnica apresentada é a primeira abordagem que rotula especificamente apenas as células de gestão de resíduos que engoliram e digerem ativamente corpos celulares. Isto faz com que seja vantajosa em relação a outros métodos existentes para a marcação das células fagocíticas, que não têm essa capacidade.

O método utiliza um marcador geral e s...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Xileno	JT Baker	9490-22
Etanol
Proteinase K	Roche	3115879001
PBS Buffer	Invitrogen	AM9624
Vaccinia Topoisomerase I	Vivid Technologies		5 pmol/μ l ADN
IDT		suicídio da saliência 12-Base	do estoque 12 ' - AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3 '; B – Biotina-dT; 100 pmol/μ l estoque em ddH2O
Adaptador Oligonucleotídeo	IDT DNA		5'-TAG AAT CGT ATC-3'; 100 pmol/μ l estoque em ddH2O
1 M Tris-HCl, PH 7.4	Lonza	51237
TSA, Sistema de Fluoresceína	PerkinElmer
1 M NaCl
DMSO	Sigma
Tween-20	Sigma	P9416-50ML
Vectashield com DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Lamínulas			22 x 22 mm ou 22 x 40 mm de vidro ou plástico. As lamínulas de plástico são preferíveis durante a reação, pois são mais fáceis de remover da seção.
		de cérebro de rato	Cérebro de rato tomado 48 horas após a reprodução do acidente vascular cerebral isquêmico, conforme descrito em Didenko et al11. 5-6 μ seções de espessura em M cortadas de blocos de tecido fixados em paraformaldeído e embebidos em parafina. Use lâminas carregadas e pré-limpas.
Microscópio invertido	Olympus
Câmera de vídeo digital e software	Micromax
Software	Metamorph