Avaliando Clearance fagocítica de morte celular em Curso Experimental de Ligatable fluorescentes Sondas

Resumo

Nós apresentamos uma nova técnica de fluorescência para seletiva marcação in situ de células fagocíticas ativos, o que claro off corpos celulares em acidente vascular cerebral. A abordagem é importante para a avaliação da reacção à isquemia cerebral uma vez que só uma pequena proporção de fagócitos presentes no cérebro isquémico participar na depuração de morte celular.

Resumo

Nós descrevemos uma nova abordagem histoquímica para visualização de folga fagocitária em isquemia cerebral focal. A abordagem permite o estudo da eliminação de células mortas no acidente vascular cerebral por fagócitos de qualquer linhagem celular de gestão de resíduos. Apesar de numerosas células de origens diferentes, que são capazes de fagocitose estão presentes no cérebro isquémico, apenas uma parte deles activamente engolir e digerir corpos celulares. A visualização seletiva, quantificação e análise de tais de gestão de resíduos fagocitária ativa são úteis na avaliação da resposta do cérebro à isquemia. Remoção eficiente morte celular é importante para a recuperação do cérebro de uma lesão isquêmica, uma vez que abre o caminho para os processos regenerativos subseqüentes. A falha para limpar os cadáveres que resultaria numa reacção tóxica causada por ADN não degradado e proteínas. O procedimento descrito utiliza sondas fluorescentes ligados seletivamente por uma topoisomerase viral para quebras de DNA característicos produzidos em todos os fagócitos durante imersãoe digestão das células irreversivelmente danificadas por isquemia. O método é uma nova ferramenta para a investigação da reação cerebral à isquemia.

Introdução

Acidente vascular cerebral isquêmico induz mudanças profundas no tecido cerebral afetada. Ela inicia a morte celular em massa, o que leva à rápida activação das células fagocíticas residentes de origem da microglia. É também desencadeia a infiltração de cérebro isquémico por vários tipos de fagócitos profissionais derivadas do sangue, incluindo neutrófilos, macrófagos, células dendríticas e células mastro ^1,2.

Ainda está em discussão se esta resposta à lesão isquêmica desempenha um papel positivo ou negativo. Embora a fagocitose após o AVC pode ser benéfico porque ele limpa as células mortas e suprime a inflamação, ele também g....

Protocolo

O método é adequado para, cortes de tecidos fixados em formol parafina. A técnica é demonstrada aqui na sua aplicação a acidente vascular cerebral experimental em ratos.

1. Componentes preparando para tiramida Signal Amplification (TSA) do Sistema

Embora o aperfeiçoamento baseia-TSA é usado na fase final da rotulagem, preparando-se para esta reacção pode ter mais do que 1 hora. Por isso, é conveniente para fazer os reagentes TSA antes de iniciar a marcação.

1. Faça solução estoque fluorophore tiramida. Utilizar o reagente fluoróforo tiramida fornecido em frascos individuais com o kit de marcação de TSA....

Resultados

O princípio da técnica para rotulá fagócitos de gestão de resíduos ativos é apresentado na Figura 1. O esquema demonstra que a detecção do produto em três etapas. O primeiro passo envolve a activação da sonda (figura 1A); na segunda etapa, a sonda é activado ligado a quebras de ADN específicos em secções de tecido (Figura 1C); a terceira etapa inclui a amplificação do sinal de fluorescência (Figura 1D). Em uma explicação mais detalhada, a detecção é o s.......

Discussão

Neste vídeo podemos demonstrar, no formato de secção de tecido, como rotular fagócitos ativos que a morte de células claras em isquemia cerebral focal. A técnica apresentada é a primeira abordagem que rotula especificamente apenas as células de gestão de resíduos que engoliram e digerem ativamente corpos celulares. Isto faz com que seja vantajosa em relação a outros métodos existentes para a marcação das células fagocíticas, que não têm essa capacidade.

O método utiliza um marcador geral e s.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Xileno	JT Baker	9490-22
Etanol
Proteinase K	Roche	3115879001
PBS Buffer	Invitrogen	AM9624
Vaccinia Topoisomerase I	Vivid Technologies		5 pmol/μ l ADN
IDT		suicídio da saliência 12-Base	do estoque 12 ' - AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3 '; B – Biotina-dT; 100 pmol/μ l estoque em ddH2O
Adaptador Oligonucleotídeo	IDT DNA		5'-TAG AAT CGT ATC-3'; 100 pmol/μ l estoque em ddH2O
1 M Tris-HCl, PH 7.4	Lonza	51237
TSA, Sistema de Fluoresceína	PerkinElmer
1 M NaCl
DMSO	Sigma
Tween-20	Sigma	P9416-50ML
Vectashield com DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Lamínulas			22 x 22 mm ou 22 x 40 mm de vidro ou plástico. As lamínulas de plástico são preferíveis durante a reação, pois são mais fáceis de remover da seção.
		de cérebro de rato	Cérebro de rato tomado 48 horas após a reprodução do acidente vascular cerebral isquêmico, conforme descrito em Didenko et al11. 5-6 μ seções de espessura em M cortadas de blocos de tecido fixados em paraformaldeído e embebidos em parafina. Use lâminas carregadas e pré-limpas.
Microscópio invertido	Olympus
Câmera de vídeo digital e software	Micromax
Software	Metamorph