Isolamento de mRNAs Associated com mitocôndrias de levedura para estudar mecanismos de regionalização de Tradução

Resumo

Muitos mRNAs que codificam as proteínas mitocondriais são associados com a membrana exterior mitocondrial. Descreve-se um processo de fracionamento subcelular que visa o isolamento de mitocôndrias de levedura com seus mRNAs e ribossomos associados. Este protocolo pode ser aplicado a células cultivadas sob diversas condições, a fim de revelar os mecanismos de localização de mRNA e tradução localizada perto das mitocôndrias.

Resumo

A maioria das proteínas mitocondriais são codificados no núcleo e precisam ser importadas para a organela. Import pode ocorrer enquanto que a proteína é sintetizada próximo da mitocôndria. O suporte para esta possibilidade é derivado de estudos recentes, em que muitos mRNAs que codificam proteínas mitocondriais foram mostrados para ser localizado para a vizinhança mitocôndria. Juntamente com as demonstrações anteriores de associação dos ribossomos com a membrana externa, estes resultados sugerem um processo de tradução localizada. Tal tradução localizada pode melhorar a eficiência de importação, fornecer locais únicos de regulação e minimizar os casos de expressão ectópica. Diversos métodos têm sido utilizados para caracterizar os elementos e elementos que medeiam a tradução localizado. Padrão entre estes é o fraccionamento subcelular por centrifugação diferencial. Este protocolo apresenta a vantagem de isolamento de ARNm, ribossomas e proteínas num único processo. Estes podem, então, ser caracterizada por vários molecular e bimétodos ochemical. Além disso, transcriptómica e proteómica métodos pode ser aplicada ao material resultante, assim, permitir percepções de todo o genoma. A utilização de leveduras como organismo-modelo para tais estudos tem as vantagens de rapidez, simplicidade e custos. Além disso, as ferramentas genéticas avançadas e estirpes de deleção disponíveis facilitar a verificação de factores candidatos.

Introdução

As células eucarióticas são organizados em compartimentos distintos que possuem funções específicas. Para cumprir a sua função, cada compartimento contém um conjunto exclusivo de proteínas que são essenciais para a sua actividade. Um possível mecanismo pelo qual estas proteínas se aproximam de seu compartimento é de ^1,2 localizada tradução. Neste processo, a proteína é sintetizada no destino por ribossomas e mRNAs que são aí localizados. Entre as vantagens prováveis ​​de tradução localizada são o aumento da eficiência do direcionamento de proteínas, diminuição da necessidade de acompanhantes de proteína, e permitindo que os mecanismos de regulação específicas do site. Além disso, mRNAs e ribossomas localizados podem ser um reservatório isolado de máquinas de tradução em casos de estresse celular, quando a tradução geral é inibida.

As mitocôndrias se tornou nos últimos anos um modelo central para estudar tradução localizada. A maioria das proteínas de mitocôndrias são codificadas no núcleo, traduzida no citoplasma,e importadas para a organela. Várias linhas de evidência indicam que muitas destas proteínas são produzidas através de um processo de tradução local. Inicialmente, os estudos de microscopia eletrônica e de fracionamento bioquímico detectado ribossomos associados mitocôndrias ^3-5. Estes estudos, onde, em seguida, corroborado in vivo pelo trabalho em mRNAs específicos, que foram encontrados para ser importados em um ^6,7 maneira cotranslational. Estudos genômicos de mRNAs associação com mitocôndrias revelou que uma fracção significativa dos mRNAs são localizadas na vizinhança mitocôndrias ^8-10. Alguns destes mRNAs foram adicionalmente caracterizados in vivo por métodos de fluorescência, tais como peixes ou MTAG ^9,11. A interpretação direta desta associação é que esses mRNAs servir como modelos para tradução localizada.

Os mecanismos pelos quais estas se aproximam dos mRNAs mitocôndrias são desconhecidas. Domínios não-codificante (mais significantly 3 'UTRs) mostraram estar envolvidas na associação de mRNA para a mitocôndria ^12. Estes domínios são susceptíveis de servir como um local de ligação a proteínas de ligação a ARN que medeiam o seu transporte. Estudos em levedura revelou que um membro da família de proteínas de PUM (Puf3) apoia associação ARNm com mitocôndrias ^8,13. Um papel plausível para Puf3, que se baseia em funções de outros membros da família, é para inibir a tradução do mRNA, enquanto está a caminho ^14. Assim, os mRNAs podem ser transportados num estado não traduzida, por proteínas de ligação de ARN que interagem com regiões não codificantes. Alternativamente, um grande corpo de trabalho sugere que ocorre o transporte, enquanto a proteína está a ser sintetizado. Em particular, os inibidores de tradução foram mostrados para afetar mRNAs associação ^8,13. Além disso, os recursos traduzidos como a agosto, a sequência de direcionamento mitocondrial (MTS) ou regiões ORF foram mostrados para ajudar na localização ^8,11,15. Ch proteína Hsp70-famíliaaperone e receptor de proteína de membrana externa as mitocôndrias foram também demonstrado que suporta associação ARNm, implicando que mais características codificado em proteínas são importantes para a localização de mRNA ^16. Isto é consistente com um modelo no qual a proteína-ribossoma emergente serve como elemento de reconhecimento para a segmentação complexo ribossoma-ARNm-proteína para a mitocôndria ^17.

Tradução localizada perto da mitocôndria foi estudado por vários métodos, incluindo a microscopia de electrões (para visualizar ribossomas) ^3, FISH ^9, RNA verde (para detectar os mRNAs específicos) ^11, e fraccionamento bioquímico (para detectar os níveis de RNA e ribossomas) ^10,18. Enquanto os métodos anteriores detectar a localização in vivo e pode permitir a visualização dinâmica de transporte, este último permite a detecção de vários mRNAs diferentes em uma única experiência. Além disso, para codificação de fracionamento bioquímico ou não-codificantes domínios não precisa ser altrado, por conseguinte, as suas funções específicas, podem ser avaliadas. Fraccionamento bioquímico tem sido utilizado com sucesso durante muitos anos, para o isolamento de diversos compartimentos celulares diferentes. Seus princípios e limitações estão bem estabelecidos, e pode-se facilmente modificar os protocolos existentes para finalidade diferente. A instrumentação necessária é padrão em muitos laboratórios, portanto, é geralmente o primeiro método de escolha para estudar a localização intracelular. Descreve-se um protocolo que foi optimizado para o isolamento de ARNm, enquanto ribossomas estão associados com a mitocôndria. Este protocolo é, portanto, ideal para o estudo de fatores envolvidos na tradução localizada perto mitocôndria.

Protocolo

1. As mitocôndrias Purificação

Pesa-se o sedimento de células. Aproximadamente 0,6 g é obtido a partir de 100 células ml.

1. Crescer 100-150 ml de células de levedura para OD ₆₀₀ = 1-1,5 em 30 ° C em um meio de crescimento não fermentável, tal como o meio de crescimento à base de galactose, de modo a enriquecer a mitocôndria.
2. Células de centrífuga a 3000 xg durante 5 min à temperatura ambiente e desprezar o sobrenadante.
3. Lave o pellet com água bidestilada e centrifugar novamente. Desprezar o sobrenadante.
4. Ressuspender o sedimento em 1 ml de tampão de DTT por 0,5 g de células. É importante para o tratamento das células com um agente de redução, a fim de quebrar as ligações dissulfureto dentro da parede da célula, aumentando assim a hidrólise.
5. Incubar as células durante 10 min a 30 ° C com agitação suave. Enquanto isso, a pesar de 6 mg Zymolyase por 1 g de células e suspendê-lo em Zymolyase Buffer.
6. Células de centrífuga a 3000 xg durante 5 minutos, umatemperatura ambiente t e descartar o sobrenadante.
7. Ressuspender o sedimento em 1 ml de Tampão de Zymolyase por 0,15 g de células. Não vórtice.
8. Medida _OD600 de 10 uL alíquotas de células em 990 ul de água.
9. Adicionar Zymolyase (passo 1.5) para as células para hidrolisar os polímeros de glicose aos β-1 ,3-glucano de ligações e gerar esferoplastos. A partir deste passo, esferoplastos deve ser mantida numa solução isotónica, a fim de evitar lise.
10. Incubar as células durante 15 min a 30 ° C (para a actividade óptima de Zymolyase) com agitação suave. Para verificar a hidrólise da parede celular e geração de esferoplastos, misturar 10 mL de células com 990 ul de água. Os esferoplastos são esperados para lisar devido à diferença osmótico, e o OD ₆₀₀ deve ser pelo menos 10 vezes menor do que o valor determinado no passo 1.9. Se não, continue a incubação com Zymolyase por mais 15 min.
11. Células de centrífuga a 3000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Dis Cuidadosamentecartão do sobrenadante, o sedimento como pode ser instável.
12. Lave esferoplastos com Zymolyase buffer e descartar o sobrenadante.
13. Ressuspender esferoplastos com 100 ml meio de recuperação. Transferir esferoplastos para um balão Erlenmeyer e incubar durante 1 hora a 30 ° C com agitação. Este passo de recuperação é necessário uma vez que durante a tradução tratamento Zymolyase é preso e localização do mRNA é interrompido (Figura 1B).
14. Adicionar 0,1 mg / ml CHX e esferoplastos de transferência para uma de 50 ml pré-resfriada tubo cônico. Além CHX é importante para congelar associação dos ribossomos com mRNAs. Assim, a associação mRNA ribossomos dependentes com mitocôndrias é mantida.
15. Esferoplastos Centrifugar a 3.000 xg durante 5 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante.
16. Lavar duas vezes com frio manitol Buffer.
17. Ressuspender esferoplastos com 4 ml frio manitol buffer e transferi-los para um homogeneizador Dounce de 15 ml de capacidade equipado com ajuste apertadopilão. Gentilmente quebrar esferoplastos com 15 tacadas e transferir o lisado para um tubo de 13 ml.
18. Centrifuga-se o lisado a 1,500 xg durante 6 minutos a 4 ° C para sedimentar os núcleos e as células intactas.
19. Transferir cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo. Separe 1 ml (25%) da amostra como uma amostra não fracionada (amostra "Total"). Transferência de 50 mL desta amostra para um novo tubo e adicionar 15 ml de 4X LSB para análise de Western blot. O precipitado de RNA a partir do resto da amostra "total" (Ver Protocolo 3, a precipitação do RNA).
20. Centrifugar o sobrenadante a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar as mitocôndrias.
21. Transferir o sobrenadante (~ 3 mL) para um tubo novo e mantê-lo em gelo. Esta é a fracção "citosólica". Transferência de 50 mL desta amostra para um novo tubo e adicionar 15 ml de 4x LSB para análise de Western blot. O precipitado de RNA a partir do resto da amostra "citosólica" (Ver Protocol 3, RNA de precipitação).
22. Lava-se a pelete com 3 ml de tampão de manitol e centrifugar novamente a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
23. Ressuspender o sedimento em 3 ml de tampão de manitol. Este exemplo contém a mitocôndria, e referido como fração "mitocôndrias". Transferência de 50 mL desta amostra para um novo tubo e adicionar 15 ml de 4x LSB para análise de Western blot.

2. Extração de RNA

1. Adicionar a cada amostra de um volume de 8 M de guanidina-HCl e dois volumes de etanol a 100%. Vortex e incubar durante pelo menos 2 horas a -20 ° C.
2. Centrifugar as amostras a 10.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Elimine o sobrenadante. Tenha cuidado, pois o pellet pode ser instável.
3. Lavar o sedimento com 70% de EtOH.
4. Ressuspender o sedimento em 400 ml de água isenta de RNase e transferir a amostra para um novo tubo de Eppendorf.
5. Precipitar o ARN de novo por adição de 0,1 volume de 3 M de sódio acetate pH 5,2 e dois volumes de EtOH a 100%. Vortex e incubar durante pelo menos 2 horas a -20 ° C.
6. Centrifugar as amostras a 20.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e lava-se com EtOH a 70%.
7. O ar seco do pellet e ressuspender com água RNase-free. As amostras de RNA a -80 loja ° C. As amostras podem ser utilizadas para a análise Northern ou análise de microarray ^{19 18} (ver Protocolo 3).

3. Preparando o RNA para Análise Microarray

1. Ressuspender o mRNA a partir do passo 2,2, com 650 ml de água isenta de RNase.
2. Para remover qualquer ADN residual ou proteínas, adicionar um volume igual (650 mL) de ácido fenol: clorofórmio (5:1, pH 4,7) e vórtex vigorosamente. Centrifugar a velocidade máxima por 2 min.
3. Transferir 500 ml da fase superior (fase aquosa) para um tubo novo. Evite tomar a interfase, pois ele contém DNA. Também deve ter cuidado de tomar fenol, o que pode inibir a reação de transcrição reversa.
4. A amostra de ARN contém uma quantidade significativa de heparina, que é um potente inibidor da transcriptase inversa. Assim, por RT-PCR ou rotulagem microarray que precisa ser removida. Retirar heparina por LiCl precipitação: adicionar LiCl até uma concentração final de 2 M e incuba-se as amostras durante a noite a -20 ° C.
5. Descongelar as amostras a 4 ° C e centrifuga-se a 20000 xg durante 20 min a 4 ° C.
6. Descartar cuidadosamente o sobrenadante e lavar o sedimento com etanol a 80%. Centrifugar novamente como descrito na etapa 3.5.
7. Rejeitar o sobrenadante, o ar seco e ressuspender o sedimento em 150 ml de água isenta de RNase.
8. Para remover qualquer LiCl residual precipitar novamente com 0,1 volume de 3 M acetato de sódio pH 5,3 e 3 volumes de etanol a 100%. Incubar a -20 ° C durante pelo menos 2 horas.
9. Centrifugar a velocidade máxima por 20 min a 4 ° C. Lavar cuidadosamente a pelete transparente com etanol a 80% e ar seco.
10. Ressuspender opellet com 25 ml de água livre de RNase e manter as amostras a -80 ° C.
11. Siga os passos para a rotulagem RNA e hibridização descrito em ^18,20.

Resultados

Este protocolo permite a separação de uma fracção contendo mitocôndrias de componentes citosólicos. A melhor maneira de testar o seu êxito é realizar análise Northern e análise de Western (Figura 1) a partir de amostras dos diferentes passos de isolamento. Três parâmetros para a qualidade de isolamento são derivadas a partir destas análises. Em primeiro lugar, quando o RNA ou proteínas nas amostras estão intactos - estes serão detectados como bandas distintas nas análises. Eventos de degradação vai indu...

Discussão

Os avanços tecnológicos no processamento de imagens tinha rendido ferramentas de alta resolução para estudar a localização mRNA. Hoje, pode-se medir o movimento de mesmo uma única molécula de mRNA na escala de tempo ms ^23-26. No entanto, as abordagens bioquímicas tradicionais, como os descritos acima, também são informativos e são preferíveis em alguns casos. Isolamento bioquímico permite a purificação de um grande reportório de ARNm e proteínas, e por isso é preferível para estudos genômicos. Numa única isol...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Extrato de
BactoPeptona
Galactose			Não autoclave Galactose
Meio			Para enriquecimento mitocondrial, você deve usar qualquer fonte de carbono não fermentável, como meio de crescimento à base de Galactose esterilizado 1% Extrato de levedura, 2% BactoPeptona, 2% Galactose
0,1 M Tris-HCl, pH 9,4
30 mM Tris-HCl, pH 7,6
Ditiotreitol (DTT)
10 mM Tampão			0,1 M TrisHCl pH 9,4, 10 mM Ditiotreitol (DTT). Fazer fresco sempre
1,2 M Sorbitol
4 mM KH2PO4
16 mM K2HPO4
0,2 μ m filtro
Tampão			1,2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4, 16 mM K2HPO4. Filtre este buffer (0,2 μ m) e manter em temperatura ambiente para uso futuro
Zymolyase 20T			20.000 U/g
Meio			Meio de crescimento à base de galactose suplementado com 1 M Sorbitol
0,1 mg/ml Cicloheximida (CHX)
0,6 M Manitol
5 mM MgAc
100 mM KCl
0,5 mg/ml Heparina
1 mM Fenilmetanossulfonilfluoreto (PMSF)
Tampão			manitol 0,6 M Manitol, 30 mM Tris-HCl pH7,6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Adicione fresco: 0,5 mg/ml de heparina, 0,1 mg/ml CHX e 1mM (PMSF). Filtre este tampão e use-o gelado
8 M Guanidínio-HCl
100% e 70% Etanol (EtOH)
3 M Acetato de sódio, pH 5,2
10 M LiCl solução
250 mM Tris HCl pH 6,8
SDS
Glicerol
β-Mercaptoetanol
			bromofenol
4x LSB			250 mM Tris HCl pH 6,8, 8% SDS, 40% Glicerol, 20% β-mercaptoetanol e 0,02% Azul de bromofenol
Homogeneizador Dounce de 15 ml de capacidade equipado com pilão