Isolamento de mRNAs Associated com mitocôndrias de levedura para estudar mecanismos de regionalização de Tradução

Resumo

Muitos mRNAs que codificam as proteínas mitocondriais são associados com a membrana exterior mitocondrial. Descreve-se um processo de fracionamento subcelular que visa o isolamento de mitocôndrias de levedura com seus mRNAs e ribossomos associados. Este protocolo pode ser aplicado a células cultivadas sob diversas condições, a fim de revelar os mecanismos de localização de mRNA e tradução localizada perto das mitocôndrias.

Resumo

A maioria das proteínas mitocondriais são codificados no núcleo e precisam ser importadas para a organela. Import pode ocorrer enquanto que a proteína é sintetizada próximo da mitocôndria. O suporte para esta possibilidade é derivado de estudos recentes, em que muitos mRNAs que codificam proteínas mitocondriais foram mostrados para ser localizado para a vizinhança mitocôndria. Juntamente com as demonstrações anteriores de associação dos ribossomos com a membrana externa, estes resultados sugerem um processo de tradução localizada. Tal tradução localizada pode melhorar a eficiência de importação, fornecer locais únicos de regulação e minimizar os casos de expressão ectópica. Diversos métodos têm sido utilizados para caracterizar os elementos e elementos que medeiam a tradução localizado. Padrão entre estes é o fraccionamento subcelular por centrifugação diferencial. Este protocolo apresenta a vantagem de isolamento de ARNm, ribossomas e proteínas num único processo. Estes podem, então, ser caracterizada por vários molecular e bimétodos ochemical. Além disso, transcriptómica e proteómica métodos pode ser aplicada ao material resultante, assim, permitir percepções de todo o genoma. A utilização de leveduras como organismo-modelo para tais estudos tem as vantagens de rapidez, simplicidade e custos. Além disso, as ferramentas genéticas avançadas e estirpes de deleção disponíveis facilitar a verificação de factores candidatos.

Introdução

As células eucarióticas são organizados em compartimentos distintos que possuem funções específicas. Para cumprir a sua função, cada compartimento contém um conjunto exclusivo de proteínas que são essenciais para a sua actividade. Um possível mecanismo pelo qual estas proteínas se aproximam de seu compartimento é de ^1,2 localizada tradução. Neste processo, a proteína é sintetizada no destino por ribossomas e mRNAs que são aí localizados. Entre as vantagens prováveis ​​de tradução localizada são o aumento da eficiência do direcionamento de proteínas, diminuição da necessidade de acompanhantes de proteína, e permitindo que os mecanismos de regulação específi....

Protocolo

1. As mitocôndrias Purificação

Pesa-se o sedimento de células. Aproximadamente 0,6 g é obtido a partir de 100 células ml.

1. Crescer 100-150 ml de células de levedura para OD ₆₀₀ = 1-1,5 em 30 ° C em um meio de crescimento não fermentável, tal como o meio de crescimento à base de galactose, de modo a enriquecer a mitocôndria.
2. Células de centrífuga a 3000 xg durante 5 min à temperatura ambiente e desprezar o sobrenadante.
3. Lave o pellet com água bidestilada e centrifugar novamente. Desprezar o sobrenadante.
4. Ressuspender o sedimento em 1 ml de tampão de DTT por 0,5 g de células. É....

Resultados

Este protocolo permite a separação de uma fracção contendo mitocôndrias de componentes citosólicos. A melhor maneira de testar o seu êxito é realizar análise Northern e análise de Western (Figura 1) a partir de amostras dos diferentes passos de isolamento. Três parâmetros para a qualidade de isolamento são derivadas a partir destas análises. Em primeiro lugar, quando o RNA ou proteínas nas amostras estão intactos - estes serão detectados como bandas distintas nas análises. Eventos de degradação vai indu.......

Discussão

Os avanços tecnológicos no processamento de imagens tinha rendido ferramentas de alta resolução para estudar a localização mRNA. Hoje, pode-se medir o movimento de mesmo uma única molécula de mRNA na escala de tempo ms ^23-26. No entanto, as abordagens bioquímicas tradicionais, como os descritos acima, também são informativos e são preferíveis em alguns casos. Isolamento bioquímico permite a purificação de um grande reportório de ARNm e proteínas, e por isso é preferível para estudos genômicos. Numa única isol.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Extrato de
BactoPeptona
Galactose			Não autoclave Galactose
Meio			Para enriquecimento mitocondrial, você deve usar qualquer fonte de carbono não fermentável, como meio de crescimento à base de Galactose esterilizado 1% Extrato de levedura, 2% BactoPeptona, 2% Galactose
0,1 M Tris-HCl, pH 9,4
30 mM Tris-HCl, pH 7,6
Ditiotreitol (DTT)
10 mM Tampão			0,1 M TrisHCl pH 9,4, 10 mM Ditiotreitol (DTT). Fazer fresco sempre
1,2 M Sorbitol
4 mM KH2PO4
16 mM K2HPO4
0,2 μ m filtro
Tampão			1,2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4, 16 mM K2HPO4. Filtre este buffer (0,2 μ m) e manter em temperatura ambiente para uso futuro
Zymolyase 20T			20.000 U/g
Meio			Meio de crescimento à base de galactose suplementado com 1 M Sorbitol
0,1 mg/ml Cicloheximida (CHX)
0,6 M Manitol
5 mM MgAc
100 mM KCl
0,5 mg/ml Heparina
1 mM Fenilmetanossulfonilfluoreto (PMSF)
Tampão			manitol 0,6 M Manitol, 30 mM Tris-HCl pH7,6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Adicione fresco: 0,5 mg/ml de heparina, 0,1 mg/ml CHX e 1mM (PMSF). Filtre este tampão e use-o gelado
8 M Guanidínio-HCl
100% e 70% Etanol (EtOH)
3 M Acetato de sódio, pH 5,2
10 M LiCl solução
250 mM Tris HCl pH 6,8
SDS
Glicerol
β-Mercaptoetanol
			bromofenol
4x LSB			250 mM Tris HCl pH 6,8, 8% SDS, 40% Glicerol, 20% β-mercaptoetanol e 0,02% Azul de bromofenol
Homogeneizador Dounce de 15 ml de capacidade equipado com pilão

levedura de crescimento DTT Zymolyase de recuperação estoqueAzul de de encaixe apertado