Ativação e Mensuração de NLRP3 inflammasome Atividade Usando IL-1β em células dendríticas humanas Monocyte derivados

Melissa V. Fernandez; Elizabeth A. Miller; Nina Bhardwaj

doi:10.3791/51284

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Artigo de método

Ativação e Mensuração de NLRP3 inflammasome Atividade Usando IL-1β em células dendríticas humanas Monocyte derivados

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DOI:

10.3791/51284

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22 de maio de 2014

Melissa V. Fernandez¹ , Elizabeth A. Miller² , Nina Bhardwaj³

¹Department of Pathology, New York University School of Medicine, ²Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Mount Sinai Medical Center, ³Division of Hematology and Oncology, Hess Center for Science and Medicine, Mount Sinai Medical Center

Neste artigo

Resumo

As células dendríticas (CDs) segregam IL-1β em resposta ao reconhecimento de purina TLR8 sintético, R848, seguido por activação inflammasome NLRP3 com nigericina, por conseguinte, a IL-1β pode ser utilizado para medir a actividade inflammasome NLRP3. Coloração intracelular de citocinas, immunoblotting e ELISA são usados para medir com precisão NLRP3 inflammasome priming e ativação via expressão de IL-1β.

Resumo

Processos inflamatórios resultantes da secreção de interleucina (IL) -1 citocinas família de células do sistema imunológico levar à inflamação local ou sistêmica, remodelação e reparação tecidual e controle virológico ^{1, 2.} Interleucina-1β é um elemento essencial da resposta imune inata e contribui para eliminar agentes patogénicos invasores, evitando a criação de uma infecção persistente ^1-5.

Inflammasomes são a plataforma de sinalização fundamental para a ativação da enzima conversora de interleucina 1 (ICE ou Caspase-1). O inflammasome NLRP3 requer, pelo menos, dois sinais em DCs para provocar a secreção de ^IL-6 1β. A expressão da proteína pro-IL-1β é limitado em células em repouso; Por conseguinte, um sinal de iniciação é necessária para a transcrição IL-1β e a expressão da proteína. Um segundo sinal detectado pelo Nlrp3 resultados na formação do NLRP3 inflammasome multi-proteína. A capacidade das células dendríticas que respond para os sinais requeridos para a secreção de IL-1β pode ser testado utilizando uma purina sintético, R848, que é detectada por TLR8 em monócitos humanos derivados de células dendríticas (moDCs) de células principais, seguido de activação da inflammasome NLRP3 com a toxina bacteriana e ionóforo de potássio, nigericina.

DCs derivadas de monócitos, são facilmente produzidas em cultura e fornecer um número significativamente maior do que as células purificadas DCs mielóides humanos. O método aqui apresentado difere de outros ensaios inflammasome em que ele usa em humanos in vitro, em vez de ratinho derivada, permitindo assim DCs para o estudo da inflammasome na doença humana e infecção.

Introdução

A ativação do sistema imune inato é necessário para orientar as respostas imunes adaptativas durante a infecção, doença e vacinação ^7. As células dendríticas são o antigénio mais potente que apresenta as células do sistema imune inato; eles são especializados para a absorção de antígenos, a migração para os gânglios linfáticos, e ativação de ingênuo CD4 ⁺ e as células T CD8 ⁺ citolítica ^8-10. Para permitir a detecção de patógenos rápida do sistema imune inato utiliza inúmeros receptores de reconhecimento padrão germinativas codificado (PRR) que reconhecem patógenos conservada motivos derivados ou host derivado marcadores de....