DNBS / TNBS Colite Modelos: elucidando sua Doença Inflamatória Intestinal e Efeitos de gordura na dieta

Resumo

DNBS / colite induzida por TNBS oferece um método alternativo e de baixo custo para estudar a fisiopatologia das doenças inflamatórias do intestino. O protocolo discutidos neste documento descreve a aplicação bem-sucedida de DNBS para induzir colite em camundongos e ratos e permite estudar minuciosamente respostas intestinais com hospedeiros.

Resumo

Doenças inflamatórias do intestino (DII), incluindo a doença de Crohn e colite ulcerativa, têm sido associados com uma base genética, e, mais recentemente, a resposta imune do hospedeiro agentes microbianos e ambientais. Colite dinitrobenzeno ácido sulfônico (DNBS) induzida pelo permite estudar a patogênese da DII gatilhos ambientais associados, como estresse e dieta, os efeitos de terapias potenciais e os mecanismos subjacentes a inflamação intestinal e da mucosa da lesão. Neste trabalho, investigamos os efeitos dos ácidos n-3 e n-6 ácidos graxos na dieta sobre a resposta inflamatória da mucosa do cólon de colite induzida por DNBS em ratos. Todos os ratos foram alimentados com dietas idênticos com a excepção de diferentes tipos de ácidos gordos [óleo de cártamo (SO), óleo de canola (CO), ou óleo de peixe (FO)] durante três semanas antes da exposição ao intrarectal DNBS. Ratos controle dadas etanol intra-retal continuou a ganhar peso ao longo do estudo de 5 dias, enquanto que, os ratos tratados com DNBS dietas lipídicas alimentados todos lost de peso em ratos e FO CO alimentados demonstrando significativa perda de peso por 48 horas e ratos alimentados SO por 72 horas. O ganho de peso retomada após 72 horas pós DNBS, e por 5 dias após DNBS, o grupo FO teve um peso corporal superior ao SO ou grupos CO. Seções do Colo coletadas 5 dias após DNBS-tratamento mostrou ulceração focal, destruição cripta, a depleção de células caliciformes, e mucosa infiltração de ambas as células inflamatórias agudas e crônicas que diferiam em termos de gravidade entre os grupos de dieta. O grupo SO alimentada mostrou o dano mais grave, seguido pela CO, e FO alimentado grupos que apresentaram o mais suave grau de lesão tecidual. Da mesma forma, a mieloperoxidase colónica (MPO) A actividade, um marcador da actividade de neutrófilos foi significativamente mais elevada nas SO seguidos de ratos alimentados com CO, com FO ratos alimentados com actividade significativamente menor MPO. Estes resultados demonstram o uso de colite induzida por DNBS, conforme descrito neste protocolo, para determinar o impacto da dieta na patogênese da DII.

Introdução

Doença inflamatória do intestino (IBD) é caracterizada por uma inflamação crónica recidivante no tracto gastro-intestinal (GI), resultando em sintomas de diarreia, perda de peso e dor abdominal. A colite ulcerosa (UC) e doença de Crohn (CD) são as duas formas principais de DII, e podem ser distinguidas pela localização da inflamação dentro do tracto GI. Em pacientes UC, a inflamação geralmente envolve o reto e estende-se de forma contígua no cólon por um grau variável afetando apenas a mucosa superficial. Em contraste, o CD pode afectar qualquer parte do tracto GI, embora afecta predominantemente o íleo e ceco. CD freqüentemente se manifesta como uma inflamação transmural muitas vezes associada a granulomas e levando a stricturing (fibrostenotic) e / ou penetrante (fistulizing) doença. Embora a etiologia da DII permanece indefinida, é bem aceito que IBD é multifatorial, envolvendo interações entre as hostes do sistema imunológico, a susceptibilidade genética e responses a fatores ambientais e microbianos.

Até à data, modelos diferentes de DII foram propostos que exibem várias respostas clínicas, histológicas e imunológicas característicos de UC e CD. Os modelos mais utilizados incluem ratinhos geneticamente modificados (IL-2, IL-10, SAMP / yit), infecção modelos induzidas (Citrobacter rodentium, Salmonella typhimurium), os modelos de transferência adoptivos (CD45 + RB alto, de transferência de células CD62L + em ratinhos SCID) e modelos de colite induzida quimicamente (sulfato de sódio de dextrano (DSS), ácido sulfônico Trinitrobenzeno (TNBS), e ácido sulfónico dinitrobenzeno (DNBS)). Devido ao seu baixo custo e um rápido início da doença, os modelos químicos são considerados de grande valor para o estudo de diferentes aspectos da DII. Cada um dos modelos de colite químicos listados tem vantagens, bem como as limitações em alguns aspectos de sua relevância clínica, imunológica e histopatológica de IBD. DSS é um dos métodos químicos mais comuns utilizados para induzir colitis em roedores ^1. Administração de 3-10% DSS (PM: 42 kDa) durante 7-10 dias na água de beber dos ratos pode induzir sintomas e sinais de colite, incluindo perda de peso, diarreia com sangue, a gordura do cólon, ulceração da mucosa e a infiltração de neutrófilos. Este modelo é particularmente útil para estudos de pesquisa de drogas, bem como para explorar os mecanismos de regeneração epitelial, o impacto da imunidade inata na homeostase da mucosa, e o papel da inflamação na promoção displasia intestinal e desenvolvimento de adenocarcinoma. No entanto, existem algumas desvantagens no modelo DSS, incluindo a variação na concentração de DSS necessária para induzir a colite, em diferentes instalações de animais, assim como a absorção de água pela inconsistente ratinhos e, assim, a exposição incoerente DSS, resultando em variações no grau, extensão e distribuição de lesão da mucosa e ulceração no cólon. Todas essas características levam a heterogeneidade dos resultados e limitar a capacidade de comparar os resultados entre os estudos frdiferentes grupos de pesquisa Om.

Uma alternativa ao modelo DSS é o DNBS induzida por hapteno ou modelos TNBS de colite. Este modelo utiliza a instilação rectal da mucosa agentes sensibilizantes DNBS ou TNBS, diluídas em várias concentrações de etanol. A administração do etanol é um pré-requisito para quebrar a barreira mucosa do cólon para permitir a penetração de DNBS ou TNBS na lâmina própria. DNBS / TNBS então haptenize as proteínas do cólon e intestino microbianas localizadas para se tornar imunogênica, desencadeando o anfitrião inata e resposta imune adaptativa. Em geral, este modelo está associado com diarreia severa e por vezes sanguinolenta, perda de peso e espessamento da parede intestinal, no entanto os sintomas variam dependendo do tipo de roedor utilizadas, bem como o tempo, a dose e o grau de exposição ao DNBS ou TNBS utilizado na estudo. Distinções importantes entre ratos e ratinhos deve-se notar, com os benefícios de menor custo de compra e de bordo, bem como Lower de massa corporal para diminuir os custos por animal de tratamento in vivo. Isso deve ser definido contra o curso mais rápida e grave da colite em ratos, onde os animais mais frágeis e sensíveis podem rapidamente chegar a um desfecho humano.

A inflamação intestinal resulta inicialmente a partir de etanol danos induzidos às células epiteliais do intestino delgado, o que leva a um aumento da permeabilidade epitelial, penetração microbiana na mucosa, haptenization de proteínas do hospedeiro, tudo isto resultando na infiltração de neutrófilos, macrófagos e linfócitos T Th1 para a mucosa danificada. Em comparação com DNBS, TNBS é considerado como uma substância química perigosa, devido às suas propriedades altamente oxidativas que podem representar um risco de explosão em contacto com bases, tais como sais de sódio e hidróxido de potássio. Portanto DNBS é considerado atualmente como uma escolha preferida de química sobre TNBS para induzir colite. Em roedores, a colite DNBS é considerado como um dos métodos mais convenientes para estudar o seguinasa IBD modificadores da doença associada:

1. A depressão e a reactivação da colite: Demonstrou-se que o stress, a ansiedade e depressão em pacientes IBD são frequentemente associadas com a recidiva da doença. Colite DNBS é um modelo adequado para estudar o papel da depressão e as suas consequências sobre a reactivação de colite em ratos. O método geralmente envolve a indução inicial de colite por DNBS, seguido pela resolução da colite, deixando os ratos durante 6-8 semanas. Os ratinhos são então administradas com agentes causando depressão, tais como a reserpina ou por bulbectomy olfatório para induzir depressão seguida testando-os para a reactivação de colite por desafio com uma dose de DNBS subcolitic ^2.
2. Stress e reativação de colite: O estresse é outro fator ambiental comum que tem sido associada ao IBD patogênese. Há um crescente corpo de evidências que sugerem uma forte associação entre o estresse crônico eo aparecimento de sintomas de UC e CD em roedors, bem como em seres humanos e primatas não-humanos ^3. Colite DNBS é um bom modelo para estudar a reativação associada ao estresse da colite em ratos e ratos. O método é normalmente empregue de forma semelhante como mencionado acima para a depressão, excepto em lugar da depressão, os animais são expostos a factores de stress tais como o stress sonoro e de retenção ^4.
3. Inflamação neurogénica: Uma série de estudos descreve tanto alterações transitórias ou permanentes no sistema nervoso entérico (ENS), estrutura e função, como pode ser visto em amostras de tecido a partir de modelos animais e a partir de pacientes com IBD. DNBS é um bom modelo para explorar os efeitos da inflamação na ENS ⁵ e estudar tanto noradrenérgica e vias neurais colinérgicos ^6.
4. Mecanismos de lesão de reparação: Durante IBD patogênese, mediadores de lesão derivados do hospedeiro, como as espécies reativas de oxigênio (ROS), o óxido nítrico (NO), molécula de adesão intercelular (ICAM-3 3) e P-selectina têm sido mostrados para pcolocar um papel na ruptura epitelial intestinal. DNBS é um excelente modelo para estudar as lesões causadas pelo aumento da regulação desses mediadores, bem como os mecanismos de reparo que são regulados pelo uso de drogas ou inibidores seletivos ^7,8.
5. Inflamação transmural: Para além das aplicações de DNBS acima mencionados, o modelo pode também ser aplicada ao estudo de inflamação transmural do intestino, uma característica clássica encontrada em pacientes com CD. Ambos DNBS e colite induzida por TNBS estão associadas com a infiltração de linfócitos significativa, na mucosa do cólon tornando estes modelos particularmente úteis para o estudo de células T mecanismos imunitários dependentes.

Em comparação com o modelo de DSS, as vantagens de DNBS e colite induzida por TNBS incluem baixo custo, o rápido desenvolvimento de colite (geralmente requer 1-3 dias para mostrar ulceração reprodutível e inflamação) e dano localizado consistente no cólon distai. No entanto, as desvantagens são um requisito para amaior nível de conhecimento técnico, a otimização da dose DNBS / TNBS, ea necessidade de anestesia para administração rectal.

Neste papel metodológico estudámos os efeitos de diferentes concentrações de n-6 e n-3 ácidos gordos poliinsaturados em alterar a resposta da mucosa do cólon com colite induzida pelo DNBS em ratos usando o óleo de cártamo óleos vegetais (SO) e de óleo de canola (CO) e óleo de peixe (FO). Demonstrou-se que os ácidos n-6 e n-3 ácidos gordos são importantes mediadores de doenças inflamatórias intestinais através do seu papel como radicais acilo de phosopholipids membrana celular ^9. Em contraste com a pró-inflamatória potencial de n-6 Os ácidos gordos n-3 ácidos gordos no suficientemente elevado consumo são agentes potencialmente anti-inflamatórios potentes. As ações anti-inflamatórias de n-3 os ácidos gordos são mediados diretamente através de substituição de ácido araquidônico como substrato de eicosanóides, inibindo o metabolismo do ácido araquidônico e, indiretamente, através de alteração de proinflexpressão gênica ammatory e sinalização celular. Os n-3 ácidos gordos também dar origem a resolvins, uma família de mediadores anti-inflamatórios. O consumo elevado de n-3 ácidos gordos está associada com uma diminuição na produção de eicosanoides pró-inflamatórios, citocinas, quimiocinas, espécies reactivas de oxigénio e expressão de moléculas de adesão. Neste estudo, os ratos foram alimentados ad libitum dietas idênticos em todos os nutrientes excepto ácidos gordos, com uma energia como por cento de gordura, 20% de SO, 20% de CO, ou 18% de óleo de peixe, mais 2% de óleo de cártamo (FO) ^10-11 . Como percentual da energia diária, a dieta SO fornecido 15% de ácido linoléico (LA), com <0,06% de ácido linolênico-α (ALA) e não o ácido eicosapentaenóico (EPA) ou ácido docosahexaenóico (DHA), a dieta de CO teve 4,2 LA% e 1,9% ALA sem EPA ou DHA, ea dieta FO, desde 1,4% EPA, DHA 4,9%, 0,32% LA, e de 0,12% ALA. Três semanas após o início das dietas de lípidos, os ratinhos foram administrados DNBS intra-rectal ou etanol a 50% e sacrificados 5 dias mais tarde. A inflammatory resposta foi avaliada por avaliação da perda de peso, escores de danos histológicos e atividade da mieloperoxidase tecido.

Protocolo

Procedimentos envolvendo assuntos animais seguir as orientações de cuidados de animais delineadas pelo Animal Care e Use Comitê Institucional (IACUC) da Universidade de British Columbia.

Procedimentos descritos no presente protocolo irá ser descrito, tanto para os ratos e murganhos, enquanto que os resultados representativos, será apresentado a partir de ratos Sprague-Dawley.

1. Preparação de DNBS e administração intra-rectal

1. Para a instilação rectal de DNBS em ratos, recém preparar 15-30 mg de DNBS/250 ul de etanol a 50%. Para ratos, preparar 2-6 mg de DNBS/100 mL de etanol 50%. Nota: Otimizar a concentração DNBS exato a ser administrado em cada instalação. Ratos machos Sprague-Dawley e murganhos C57BL / 6 são os preferidos para a indução da colite DNBS, no entanto outras estirpes de ratinho e de rato pode ser utilizado. Os ratinhos e ratos tratados apenas com etanol a 50% podem ser usados ​​como grupos de controlo no entanto, devido aos efeitos do etanol são ligeiros ou ausentes, pode omit a inclusão deste grupo em um estudo ^{de 12.}
2. Anexar uma seringa de 1 ml de uma agulha 19 G que tem um cateter de polietileno (PE-90 - ratos e PE-50 - ratos) preso ao seu fim.
3. Levemente anestesiar o rato ou de descanso do mouse sobre uma almofada de aquecimento (por exemplo, através da administração de isoflurano a 1,5% via nariz cone, os animais ainda deve ter piscar e os reflexos de deglutição e respiração exibir regular). Aplique gel lágrima aos seus olhos para evitar os olhos sequem.
4. Suavemente aplicar pressão com os dedos para a extremidade posterior do animal para remover quaisquer fezes que podem estar presentes no cólon distai.
5. Insira cuidadosamente o cateter por via retal, com o cateter atingindo aproximadamente 8 cm proximal ao ânus para os ratos, ou 3-4 cm para ratos. Injectar uma pequena quantidade da solução durante a inserção do cateter para lubrificar, permitindo uma inserção mais fácil. Nota: Se qualquer resistência é sentida durante a inserção do cateter, não continuem a inserir, pois isso pode levar à perfuração doa parede intestinal. Remover o cateter e tentar reinserir suavemente, novamente lubrificação do cólon como prosseguir.
6. Lentamente injectar 250 (ratos) ou 100 (ratinhos) ul de DNBS, ou um volume igual ou etanol a 50% para os controlos. Depois de injetar a DNBS, posicionar o animal de cabeça para baixo por 90 segundos para evitar a perda do DNBS.
7. Após administração DNBS, alimentar os animais de 8% de sacarose em água de 0,2% de solução salina para evitar a desidratação, durante a primeira semana.
8. Observar atentamente os animais, com acompanhamento diário para perda de peso e sinais de desidratação ou sofrimento para a duração do experimento. Nota: A perda de peso pode se aproximar rapidamente as recomendações do CCAC de perda de peso máximo autorizado. Uma vez que esta parte derivada desidratação, perda de peso, deve ser utilizado como um indicador para a administração de solução de Ringer com lactato para limitar a desidratação. Por favor, não deixe de consultar o veterinário facilidade em questões de saúde, conforme o caso.

2. Collecting Tecidos e avaliação do dano histológico em DNBS Desafiado Ratos

1. No ponto de tempo desejado após o desafio com DNBS, sacrificar animais por overdose com isoflurano em uma câmara de anestesia complementada com oxigênio suficiente. Observar o animal até que não ascendente ou descendente do peito é visto e não há batimento cardíaco palpável. Confirme o animal foi corretamente sacrificados por falta de resposta a pitada dedo do pé ou tocar da córnea, seguido por deslocamento cervical.
2. Abra a cavidade abdominal e remover todo o intestino grosso. Abra o intestino longitudinalmente, úlceras macroscópicas deve ser observada cerca de 5-6 cm proximal da extremidade distai do cólon de ratos (2-3 cm em ratinhos). Nota: Após a remoção do intestino grosso, avaliar contagens danos macroscópicos se desejado. Colete segmentos de cólon a partir correspondente localização anatômica de animais controle. Nota: Os indivíduos marcando o tecido para escores de danos macroscópicos deveriaser cegos para a identidade dos grupos de tratamento. Pontuação cortes de tecido usando os seguintes critérios: ou similar gravidade e extensão da ulceração (0-10), somados com a pontuação de ausência ou presença de diarréia (0 ou 1), aderências (0, 1 ou 2) e máxima espessura da parede do cólon em ¹¹ milímetros.
3. Recolher 0,5 seções cm proximal ao local do dano macroscópico máxima. Encaixar congelar uma seção 0,5 centímetros em nitrogênio líquido para avaliar mais tarde mieloperoxidase (MPO) atividade (uma medida da infiltração de neutrófilos), e coloque a outra parte em 10% formalina tamponada neutra para análise histológica. Nota: Encaixe tecidos congelados para ensaio de mieloperoxidase pode ser armazenada a -80 ° C durante 1 mês.
4. Permita que os tecidos coletados para análise histológica no passo 2.3 para corrigir em formol durante a noite e, em seguida, lavar com etanol 70%. Incorporar tecidos em parafina e cortadas a espessura desejada (3-5 mm), mancha com hemotoxilina e eosina (HE) para marcar histológica.
5. Ter dois observadores marcar pelo menos três cortes de tecido de cada animal sob um microscópio de luz para determinar os escores histológicos de dano para cada grupo. Nota: Os indivíduos a marcar o tecido para as pontuações de danos histológicos deve ser cegos para a identidade dos grupos de tratamento. Pontuação secções de tecido utilizando os seguintes critérios: ou semelhantes extensão da infiltração de células inflamatórias (0 = ausente, 3 = transmural), perda da arquitectura da mucosa (0 = ausente, 3 = grave), a presença ou ausência de abcessos das criptas (0-1) e depleção de células caliciformes (0-3). Determine pontuação dano histológico como a soma destes escores ^11.

3. Realizando mieloperoxidase (MPO) Ensaio sobre DNBS Desafiado tecido intestinal

1. Ensaio de actividade de MPO nos 0,5 centímetros segmentos do cólon obtidos no passo 2.3. Homogeneizar os tecidos em tampão de homogeneização a MPO (0,5% de brometo de hexadeciltrimetil-amónio em tampão de fosfato de potássio 50 mM (pH 6,0)) para dar um segme cólon 50 mgnt / ml de suspensão de tampão de homogeneização.
2. Alíquota da solução homogeneizada em porções de 1 ml e centrifugar a 4 ° C durante 2 min a 10.000 x g.
3. Misturar 100 ml de cada solução com 2,9 ml de 50 mM de tampão de fosfato (pH 6,0) contendo 0,167 mg / ml de o-dianisidinedihydrochloride e 0,0005% de peróxido de hidrogénio numa cuvete.
4. Medir a velocidade de absorção usando um espectrofotómetro a 460 nm. Nota: A actividade de MPO é definida como a quantidade de enzima que degrada 1 umol / min de H ₂ O ₂ H ₂ O, à temperatura ambiente, e é expressa em unidades por mg de tecido.

Resultados

Desafio de ratos (Sprague-Dawley) ou ratinhos (C57BL / 6) com DNBS normalmente resulta na perda de peso transiente e diarreia, por vezes, com a presença de sangue nas fezes. No entanto, fatores como a genética, dieta e microbiota intestinal pode modificar a susceptibilidade a colite induzida DNBS. Portanto, os animais incluídos nos experimentos deve ser da mesma instituição, seja derivada localmente ou ordenadas a partir de um fornecedor animal. Todos os animais devem ser cuidadosamente monitorizados para o grau de perd...

Discussão

O modelo descrito neste DNBS protocolo é um modelo válido, barato e reprodutível que a colite pode ser utilizado para o estudo de vários aspectos da DII. Quando administrado por via retal de ratos ou camundongos, DNBS induz um grau substancial de inflamação e lesão tecidual no cólon, assemelhando-se a doença de Crohn humana em termos de suas várias características histológicas, incluindo infiltração transmural de polimorfonucleares e predominante NF-kB-dependente ativação Th1.

Este modelo te...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringa de 1 ml	BD Biosciences	309659
Agulha de 19 G	BD Biosciences	305187
Tubo de polietileno PE-50	BD Biosciences	427517	para administração intrarretal em camundongos
Tubo de polietileno PE-90	BD Biosciences	427519	para administração intrarretal em ratos
DNBS	MP Bio	150959
Gel lacrimal	Novartis	63601662596
10% Formalina	Fisher	5F93-4
Almofada de aquecimento	Kent Scientific	TPZ-0510
Etanol	Fisher	A-962.4
Brometo de hexadeciltrimetil-amônio	Sigma-Aldrich	H5882
Solução tampão de fosfato de potássio	Sigma-Aldrich	79628-
dicloridrato de o-dianisidina	Sigma-Aldrich	D3252
30% H2O2	Sigma-Aldrich	31642	peróxido de hidrogênio
Espectrofotômetro	BioRad	Benchmarker Plus
Microscópio de Luz	Zeiss	Axio Image.Z1
Programa de software de análise de dados	Software	GraphPad Software GraphPad Prism Versão 4.00	www.graphpad.com