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Artigo de método

Análise do estresse oxidativo em embriões Zebrafish

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⸱

DOI:

10.3791/51328

⸱

7 de julho de 2014

 ,  , 
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Laboratory of Endothelial Molecular Biology, Vesalius Research Center, VIB

Neste artigo

Resumo

Aqui relatamos um protocolo para medir o estresse oxidativo em embriões vivos de peixe-zebra. Este procedimento permite a detecção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em tecidos embrionários inteiros e populações unicelulares. Este protocolo realizará análises qualitativas e quantitativas.

Resumo

Altos níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) pode causar uma mudança de estado redox celular para condição de estresse oxidativo. Esta situação faz com que a oxidação de moléculas de lípidos (, ADN, proteína), e leva à morte das células. O estresse oxidativo também afeta a progressão de várias condições patológicas como diabetes, retinopatias, neurodegeneração e câncer. Assim, é importante definir ferramentas para investigar condições de stress oxidativo, não só ao nível das células individuais, mas também no contexto de todo o organismo. Aqui, consideramos o embrião zebrafish como um útil no sistema vivo para realizar estudos e apresentar um protocolo para medir in vivo do estresse oxidativo. Aproveitando fluorescentes sondas ROS e linhas fluorescentes transgênicos zebrafish, desenvolvemos dois métodos diferentes para medir o estresse oxidativo in vivo: i) um "método de detecção de ROS todo embrião" para a medida qualitativa do estresse oxidativo e ii) um "unicelular método de detecção de ROS "para medições quantitativas de estresse oxidativo. Aqui, nós demonstramos a eficácia desses procedimentos, aumentando o estresse oxidativo nos tecidos por agentes oxidantes e métodos fisiológicos ou genéticos. Este protocolo é favorável para telas genéticos para a frente e vai ajudar as relações de causa-efeito endereço de ROS em modelos animais de patologias relacionadas ao estresse oxidativo, tais como doenças neurológicas e câncer.

Introdução

O estresse oxidativo é especificamente definida como uma condição que resulta de um estado redox celular desequilibrado. As reações redox complexas que rotineiramente ocorrem no interior das células determinar o estado redox celular. Reacções redox constituído por todas as reacções químicas que consistem na transferência de electrões entre os átomos das moléculas biológicas que produzem redução e oxidação de moléculas (por exemplo, reacções redox). Estas reacções são catalisadas por espécie activada electronicamente (por exemplo, espécies de pró-oxidantes), que são caracterizadas por uma instabilidade estrutural extrema e a activação espontânea de electrões desequilibradas que trocam com biomoléculas vizinhos. Estas reacções irregulares resultar em danos no DNA, carboxilação de proteínas e oxidação lipídica e, eventualmente, levar à morte celular 1. Aumento dos níveis de stress oxidativo têm sido associados com o envelhecimento e a progressão de diversos estados patológicos 2. O estresse oxidativo temfoi relatado para ser responsável por alterações vasculares em diabetes e doenças cardiovasculares 3,4. Também desempenha um papel crítico na degeneração neuronal na doença de Alzheimer e doença de Parkinson 5. Além disso, o estresse oxidativo tem sido demonstrada como um fator crítico para governar a progressão do câncer e eventos metastáticos 6,7. Além disso, as respostas imunes e inflamação pode provocar estresse e mais apoio oxidativo 8.

Em células vivas, espécies pró-oxidantes são derivados de oxigênio (ROS, espécies reativas de oxigênio) ou de nitrogênio (RNS; espécies reativas de nitrogênio). ROS incluem o radical hidroxilo, anião de superóxido (OH.) (O 2 -), e o peróxido de hidrogénio (H 2 O 2). O primário RNS é o óxido nitroso (NO.). Uma série de espécies reactivas secundárias podem ser gerados por interacções espontâneas between ROS e RNS ou metais livres íons 9. Por exemplo, o anião superóxido reage com o óxido nitroso para formar peroxinitrato (ONOO -), enquanto H 2 O 2 a reagir com Fe 2 + gera radicais hidroxilo. ROS e RNS, devido à sua capacidade de reagir com várias biomoléculas, são consideradas uma grave ameaça para a manutenção do estado redox fisiológica 10. Para manter as células do estado redox estão equipadas com uma série de desintoxicar moléculas anti-oxidantes e enzimas. A superóxido dismutase (SOD), catalase, glutationa peroxidase e Peroxirredoxinas constituem o essencial do anti-oxidante enzimático-arsenal que fornece proteção celular de espécies pró-oxidantes, incluindo H 2 O 2, OH e OONO -. 11. Também moléculas anti-oxidantes como a vitamina C e E, polifenóis e CoenzymeQ10 (CoQ10) são de importância crítica para saciar ROS e sua perigosa deusa derivativos 12,13. No entanto, uma produção excessiva de ROS e RNS, ou uma disfunção no sistema anti-oxidante, muda o estado redox celular para o estresse oxidativo 14.

Além de sua conotação negativa, ROS pode desempenhar várias funções fisiológicas em células de origem diferente. As células normalmente produzem ROS como moléculas sinalizadoras para mediar eventos biológicos normais, tais como a defesa do hospedeiro e reparação de feridas 15-17. Espécies reactivos são normalmente produzidas em células por enzimas intracelulares, tais como NOX (NADPH oxidase) e XO (xantina oxidase), em resposta a factores de sinalização, factores de crescimento, e as flutuações de níveis de cálcio intracelulares 18,19. Tem sido relatado que as ROS pode diferencialmente modular a actividade dos factores nucleares importantes, tais como p53 ou componentes celulares, tais como a ATM-quinase, um regulador do mestre de a resposta ao dano no DNA de 20. Analogamente ROS influenciar fortemente a sinalização celular através da mediação the oxidação e inactivação da proteína tirosina fosfatases (DPT), os quais são estabelecidos como reguladores críticos de transdução de sinal 21. Além disso, as metodologias proteômicas baseadas demonstrar que RNS também são responsáveis ​​por modificações e alterações de sinalização molecular de proteínas específicas. RNS reagem com os grupos tiol de cisteína modificados los em S-nitrothiols (SNO) e provocando vias moleculares concomitantes com os estados patológicos tais como doenças inflamatórias e auto-imunes 22,23.

Desde experimentos de cultura de células se reproduzem apenas parcialmente a multiplicidade de factores que actuam in vivo, é de grande interesse para realizar estudos de redox em modelos animais 24,25. Para conseguir isso, o peixe-zebra foi considerada um modelo animal vertebrado adequado para estudar a dinâmica de estresse oxidativo 26. O peixe-zebra é um novo modelo de sistema que concede várias vantagens para estudar eventos celulares e genéticas durante vertebrados devolvimento e doenças. Grandes aglomerados de embriões pode ser gerada e está disponível semanal para as necessidades experimentais. Além disso, a claridade óptica extraordinária de embriões de peixes-zebra, bem como o seu tamanho pequeno, permite que imagens de células única e rastreio dinâmico em organismos inteiro 27. Na última década, um número considerável de mutantes peixe-zebra foram gerados para modelar condições patológicas humanas, como câncer e doenças genéticas 28-31. Mais importante ainda, uma infinidade de linhagens transgênicas foi produzido para permitir grandes oportunidades de manipulações genéticas e biológicas 32. Por exemplo, linhas de peixes-zebra transgénicos específicos de tecido são regularmente utilizados para estudos in vivo. Estas linhas de expressar uma proteína fluorescente, sob o controlo de um promotor seleccionado, oferecendo a possibilidade de identificar uma única célula in vivo, bem como com a estrutura anatómica eles compreendem.

Vários estudos toxicológicos já usou tele peixe-zebra para avaliar o efeito in vivo de produtos químicos na homeostase redox, sugerindo a adequação deste vertebrado como um modelo animal para o campo da descoberta de drogas e de stress oxidativo 33-35. Mesmo que algumas sondas fluorescentes foram testados para monitorar o estresse oxidativo em larvas do peixe 36,37, não há ensaios estabelecidos para detectar e medir os níveis de estresse oxidativo nos tecidos de peixes-zebra e células vivas. Aqui nós descrevemos um procedimento para a quantificação in vivo do estresse oxidativo em células de embriões de peixes-zebra viva. Ferramentas de imagem, separação FACS, sondas fluorescentes e condições pró-oxidantes são combinados para gerar um ensaio simples para a detecção e quantificação de espécies oxidativas em embriões de peixe-zebra e tecidos.

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Protocolo

1. Preparação de instrumentos e soluções de trabalho

  1. Preparar a solução de água de peixe. Faça uma solução estoque, dissolvendo 2 g de "Instant Ocean 'sais do mar em 50 ml de água destilada. Adicionar 1,5 ml de caldo de peixe de água para 1 L de água destilada para preparar pronto para usar água de peixe (sais do mar de 60 mcg / mL concentração final). Autoclave o pronto para usar água de peixe antes do uso. Esta solução é utilizada como meio de embriões de peixe-zebra.
  2. Prepare metilcelulose para montagem embrião. Dissolve-se 1,5 g de metilcelulose em 50 ml de água estéril peixe. Facilitar a dissolução por meio de um ímã em uma placa de agitação. A dissolução completa do pó pode requerer várias horas. Verifique a solução para maior clareza e alíquota em pequenos tubos. Armazenar a -20 ° C durante meses e descongelar alíquotas a utilização. Centrifugar a metilcelulose a 950 xg por 5 min antes de usar. Evite ciclos de congelamento e descongelamento de alíquotas.
  3. Preparar 50 ml de tricaina / acetato de 3-aminobenzoato msal etanossulfonato (solução mãe) por dissolução de 200 mg de tricaina em 100 ml de água e ajustar o pH para 7,0 utilizando Tris-HCl 1 M (pH 9). Guarde este estoque a 4 ° C por não mais do que 30 dias. CUIDADO: tricaina é tóxico. Use de acordo com as diretrizes de manejo adequadas.
  4. Indução de estresse oxidativo em embriões de peixe-zebra
    1. Prepare uma solução oxidante para a indução do estresse oxidativo genérico: Faça 50 ml de solução oxidante adicionando H 2 O 2 solução estoque (peróxido de hidrogénio; 100 mM) de água de peixe. Use H 2 O 2 de uma concentração final entre 2 mM e 100 mM. Preparar esta solução pouco antes do uso. A solução oxidante pode ser aplicada a de detecção de ROS tanto todo monte e unicelulares métodos de detecção de ROS. Não guarde esta solução. CUIDADO: H 2 O 2 é perigoso e nocivo por inalação e ingestão. O contato com material combustível pode provocar incêndio. Manipular sob um exaustor e desgaste pers apropriadasequipamentos de proteção onal.
    2. Prepara-se uma solução oxidante para a indução de stress oxidativo derivado de mitocôndrias: Preparar uma solução de estoque de oxidante (5 mM), por dissolução de 3,9 mg de rotenona em 2 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). Manter esta solução à temperatura ambiente no escuro.
      1. Dissolva solução estoque rotenone a 10 ml de água de peixe para fazer uma solução pronta a usar. Use rotenona a uma concentração entre 5-50 uM. Não utilizar rotenona em concentrações superiores a 100 uM. Com concentrações adequadas, esta solução oxidante pode ser aplicado para a detecção de ROS tanto conjunto de montagem e de uma única célula de métodos de detecção de ROS. ATENÇÃO: A rotenona é tóxico e perigoso. Manuseie de acordo com declarações de precaução apropriadas.
    3. Induzir o estresse oxidativo por gene knock-down: Knock-down expressão do gene em embriões de peixe-zebra nrf2a por morfolino microinjeção como previamente relatado por Timme-Laragy A. et al, 2012 38..
    4. Induzir o óxidoative o estresse após dano tecidual: gerar uma margem ferida na barbatana caudal de embriões de peixes-zebra em 72 hpf como previamente descrito por Niethammer et al, 2009 39..
  5. Prepare 5 ml de solução de detecção de ROS para uma única célula método de detecção de ROS:
    1. Solução para a detecção de ROS geral: Dissolve-se a sonda molecular ROS-sensível genérico em HBSS (Solução Salina Equilibrada de Hanks) a fim de preparar uma solução de trabalho (intervalo de concentração: 2,5-10 uM). Esta solução deve ser preparada logo antes do uso.
    2. Solução para a detecção específica ROS induzida pela mitocôndria: Pouco antes de usar, dissolver uma sonda ROS-sensível mitocondrial com DMSO fazer uma solução estoque 5 mM. Dissolve-se uma solução estoque em HBSS a fim de preparar uma solução de trabalho (intervalo de concentração: 2,5-10 uM).
      NOTA: Evite a luz e oxigênio exposição de soluções de trabalho de detecção de ROS e suas respectivas soluções estoque. Proteger o tubo de luz usandouma folha de alumínio. Não guarde ou reutilização sondas dissolvidos em HBSS. Armazenar as soluções de reserva, a -20 ° C durante um mês.
      CUIDADO: Manuseie sondas moleculares e DMSO sob um exaustor de acordo com as orientações adequadas.
  6. Prepare 5 ml de solução de detecção de ROS para todo o método de detecção de ROS montagem: Dissolve-se a solução estoque sonda ROS-sensível genérico (estabilizado em DMSO) em HBSS a fim de preparar uma solução de trabalho (intervalo de concentração: 2,5-5 uM). Evite luz e exposição ao oxigênio. Proteger o tubo da luz. Preparar esta solução antes da utilização. Não guarde ou re-utilizar esta solução. CUIDADO: Manuseie sondas moleculares sob um exaustor de acordo com as orientações adequadas.
  7. Adicione 25 mL de solução de paragem através da adição de 10 ml de soro fetal de bovino a 15 ml de PBS 1x. Mantenha solução estéril. Conserva-se a solução a 4 ° C. Esta solução é necessária apenas para única célula - método de detecção de ROS.
  8. Defina a incubadora de ar zebrafish a 28 e# 176; C.
  9. Definir a centrífuga a 4 ° C durante a célula único método de detecção de ROS.

2. Acasalamento de peixes adultos e Seleção de embriões Zebrafish

  1. Defina-se peixes-zebra adultos par atravessa de acordo com protocolos padrão 40. Selecione a linha transgênica adequado, de acordo com as necessidades específicas experimental.
  2. Recolher os ovos e coloque-os em um prato de 90 mm, com média de água de peixe / embrião. Mantenha os ovos a 28 ° C até que os embriões irão desenvolver e crescer até o estágio desejado de desenvolvimento (por exemplo, 48 hpf, 72 hpf; hpf: horas após a fecundação).
  3. Tela para o desenvolvimento de embriões. Excluir todos os ovos não fertilizados ou embriões subdesenvolvidos.
  4. Anestesiar embriões, adicionando 1 ml de tricaina (solução estoque) em 50 ml de água de peixe.
  5. Selecione embriões fluorescentes Tg sob microscópio estereoscópico.

3. Tratamento de embriões com agente oxidante

  1. Use pelo menos 30 embriões entre 48 hPF e 72 HPF por condição diferente. Lave embriões duas vezes com água de peixe fresco, a fim de remover tricaina.
  2. Dividir embriões fluorescentes em três pratos. Coloque no máximo 30 embriões / prato.
  3. Remover a solução de lavagem e adicionar 10 ml da solução de oxidante ou 10 ml de água de peixe como solução de controlo.
  4. Incubar os embriões durante 10 min para 1 hora a 28 ° C. O período de incubação depende do nível do stress oxidativo para ser induzida em tecidos específicos. Períodos curtos são a melhor como as células afetadas pelo estresse oxidativo submeter progressivamente a morte celular.
  5. Transferência de embriões em um novo prato contendo HBSS e embriões de lavagem por agitação. HBSS pré-quente a 28 ° C.

4. Whole Método de Detecção Monte ROS

  1. Coletar embriões após o tratamento oxidante e colocar não mais de 10 embriões em um pequeno tubo. Lavar com HBSS, tanto quanto possível. Proteger o tubo de luz usando papel alumínio.
  2. Adicionar 1 ml de solução de detecção de ROScada tubo.
  3. Incubar os embriões no escuro durante 15 min a 28 ° C para evitar a exposição à luz.
  4. Durante o tempo de incubação preparar uma lâmina de vidro para análise embrião todo. Coloque 300 ml de metilcelulose em uma "depressão" lâmina de vidro e espalhe-o sobre a superfície de vidro com uma ponteira. Evite bolhas ao liberar a metilcelulose.
  5. No final do tempo de incubação, retirar imediatamente a solução de detecção de ROS e lavagem por duas vezes com 2 ml de HBSS. Lavar embriões invertendo o tubo várias vezes. Não pipeta ou vortex.
  6. Embriões Aspirar para cima em uma pipeta de Pasteur de vidro. Embriões posição perto da abertura da pipeta e suavemente ejetamos em metilcelulose. Orientar os embriões de forma adequada com uma linha de nylon fina.
  7. Comparar a fluorescência de embriões de controlo, com os embriões tratados. Alternativamente, fixar parâmetros do microscópio estereoscópico fluorescência ou microscópio confocal para que todos os embriões são fotografadas usando o mesmoconfigurações de imagem.

5. Single Cell Método de detecção de ROS

  1. Comece a partir do passo: 3.5. Certifique-se de ter pelo menos 35 embriões para cada condição.
  2. Transferência de embriões em um novo prato. Retire a água de peixe, tanto quanto possível. Adicionar 10 ml de PBS gelado 1x e 400 l de Inibidores da Protease Cocktail. Dechorionate manualmente embriões com uma pinça e retire o saco vitelino com uma agulha fina. Nota: A remoção saco vitelino garante amostras limpas para a seguinte análise FACS. Esta etapa pode ser evitada de acordo com instrumento FACS.
  3. Transferência yolked-de embriões em uma placa de 24 poços com vários poços (15 embriões / poço) e retire toda a água dos peixes.
  4. Adicionar 300 uL de HBSS, 30 ul de colagenase P, 50 ul de Tripsina-EDTA em cada poço.
  5. Homogeneizar embriões cuidado pipetando para cima e para baixo com uma ponteira apertado (1.000 mL).
  6. Incubar a 28 ° C durante 20 min e homogeneizar por pipetagem de amostras a cada 5 min.
  7. Verifique DISR tecidouption, observando-se uma alíquota de homogeneizado no microscópio composto. Facilitar a suspensão única célula por pipetagem. Não incubar os embriões por mais de 30 min.
  8. Parar a reacção adicionando 200 mL de solução de paragem. Misture com cuidado pipetando.
  9. Transferir a suspensão de células para um tubo de pré-refrigerada com fundo apertado. Mantenha o tubo em gelo e evitar a exposição à luz.
  10. Centrifugar durante 5 minutos a 250 xg, a 4 ° C.
  11. Retire a fase superior e re-suspender as células com gelo frio HBSS com cuidado pipetando.
  12. Contagem de células e certifique-se de ter o mesmo número de células em todas as suas amostras. Não use menos de 2 x 10 6 células.
  13. Centrifugar células durante 5 min a 250 xg a 4 ° C.
  14. Remover o sobrenadante e suspender a pelete com 1 ml de gelo gelou HBSS contendo a sonda ROS-sensível.
  15. Incubar o tubo à temperatura ambiente durante 3 min, no escuro. Tempo de incubação variam de acordo com o nível de stress oxidativo e à tele sensibilidade da sonda.
  16. Transferir as células para um tubo de FACS. Manter tubos em gelo e evitar a exposição à luz antes da análise FACS.
  17. Classificar células com um classificador de células ativadas por fluorescência (FACS). Conjunto de comprimentos de onda, de acordo com a fluorescência da Tg do tecido (por exemplo, GFP) e os espectros de excitação / emissão de sonda molecular utilizado para a detecção de ROS (por exemplo, sondas de ROS mitocondrial sensíveis específicos, sondas ROS sensíveis genéricos).
  18. Para cada condição, medir todas as amostras na mesma sessão experimental, aplicando as mesmas configurações de FACS. Calcula-se a percentagem de células fluorescentes como a média das diferentes réplicas biológicas. Analisar, pelo menos, duas réplicas para cada condição.

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Resultados

Ao aplicar o método aqui descrito, podemos facilmente medir e detectar o estresse oxidativo (e níveis de ROS) em tecidos embrionários peixe-zebra. Depois de atravessar adulto zebrafish, os ovos são coletados e autorizados a desenvolver a 28 ° C a 72 horas pós-fecundação (hpf). Para induzir o estresse oxidativo, propomos duas abordagens diferentes: 1) o tratamento de embriões com fortes reagentes pró-oxidantes ou 2) promover a formação de ROS após a lesão de tecidos.

Na primeira abordagem, fo...

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Discussão

Etapas críticas

O procedimento para a detecção de stress oxidativo em embriões de peixe-zebra aqui descritos compreende dois métodos diferentes. O método de detecção de ROS montagem inteira é principalmente um teste qualitativo para a detecção de ROS, enquanto a célula único método de detecção de ROS permite medições quantitativas mais específicas (Figura 1). Ambos os métodos oferecem uma maneira rápida e fácil de avaliar a detecção de ROS-in vivo em embriões de peixe...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

O suporte no laboratório Massimo Santoro vem do HFSP, Marie Curie Action, Telethon e AIRC. Agradecemos a Dafne Gays e Emiliano Panieri pela leitura crítica do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução de peróxido de hidrogênioSIGMA516813NÃO ARMAZENE DILUIÇÕES
Solução de Sal Balanceada Hank's 1xGIBCO14025
MetilceluloseSIGMAM0387
Mistura de Sal Marinho para Aquário InstantâneoOCEANO INSTANTÂNEOSS15-10
TricaínaSIGMAA5040
Sonda Cgenérica sensível a ROS: CellROX Deep Red ReagentINVITROGENC10422
Sonda sensível a ROS específica para mitocôndrias: MitoSOX INVITROGENM36008dissolver um frasco para injetáveis com 13 μ l de DMSO
HidroetidinaINVITROGEND23107
RotenonaSIGMAR8875Prepare a solução estoque de 5 mM em DMSO. 
DimetilsulfóxidoSIGMAD2650
VAS2870; 3-Benzil-7-(2-benzoxazolil)tio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pirimidinaEnzoLifeScienceBML-EI395dissolve o pó em DMSO; diluito em água de peixe
Iodeto de propídio Sondas moleculares
(Life Technologies)		P3566
7-aminoactinomicina D (7-AAD) Sondas moleculares
(Life Technologies)		A1310
Nrf2a MorpholinoGeneTools5'-CATTTCAATCTCCAT
CATGTCTCAG-3'Ref		: Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al.; 2002 (PMID:12167159)
Colagenase PROCHE11213857001Dissolver o pó a 100 mg/ml em HBSS estéril. Armazene alíquotas em -20 ° C
Phosphate-Buffered Saline (PBS)GIBCO10010-056
Soro Fetal Bovino GIBCO10082-147
Comprimidos de Coquetel Inibidores de Protease CompletosROCHEDissolva um comprimido em 1 ml de água
0,5% Tripsina-EDTA (10x), sem fenol vermelhoGIBCO15400-054Prepare 1x solução de trabalho antes do uso
Microscópio composto Microscópio estéreo ZEISS
com iluminação fluorescenteCâmera NikonAZ100
ZEISSAxioCamMRm
para aquisição de imagens de fluorescênciaZEISSZEN 2011
Classificador de células ativadas por fluorescênciaBD FACSCalibur
Centrifuge Eppendorf5417R
Tubos FACS Placa342065
BD Falcon353047
Placas de Petri esterilizadas, não tratadas 90 mmVWR391-1915
Microscópio confocalLeicaLeica SP5
Software Multipoços BD

Referências

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