Análise do estresse oxidativo em embriões Zebrafish

Resumo

Aqui relatamos um protocolo para medir o estresse oxidativo em embriões vivos de peixe-zebra. Este procedimento permite a detecção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em tecidos embrionários inteiros e populações unicelulares. Este protocolo realizará análises qualitativas e quantitativas.

Resumo

Altos níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) pode causar uma mudança de estado redox celular para condição de estresse oxidativo. Esta situação faz com que a oxidação de moléculas de lípidos (, ADN, proteína), e leva à morte das células. O estresse oxidativo também afeta a progressão de várias condições patológicas como diabetes, retinopatias, neurodegeneração e câncer. Assim, é importante definir ferramentas para investigar condições de stress oxidativo, não só ao nível das células individuais, mas também no contexto de todo o organismo. Aqui, consideramos o embrião zebrafish como um útil no sistema vivo para realizar estudos e apresentar um protocolo para medir in vivo do estresse oxidativo. Aproveitando fluorescentes sondas ROS e linhas fluorescentes transgênicos zebrafish, desenvolvemos dois métodos diferentes para medir o estresse oxidativo in vivo: i) um "método de detecção de ROS todo embrião" para a medida qualitativa do estresse oxidativo e ii) um "unicelular método de detecção de ROS "para medições quantitativas de estresse oxidativo. Aqui, nós demonstramos a eficácia desses procedimentos, aumentando o estresse oxidativo nos tecidos por agentes oxidantes e métodos fisiológicos ou genéticos. Este protocolo é favorável para telas genéticos para a frente e vai ajudar as relações de causa-efeito endereço de ROS em modelos animais de patologias relacionadas ao estresse oxidativo, tais como doenças neurológicas e câncer.

Introdução

O estresse oxidativo é especificamente definida como uma condição que resulta de um estado redox celular desequilibrado. As reações redox complexas que rotineiramente ocorrem no interior das células determinar o estado redox celular. Reacções redox constituído por todas as reacções químicas que consistem na transferência de electrões entre os átomos das moléculas biológicas que produzem redução e oxidação de moléculas (por exemplo, reacções redox). Estas reacções são catalisadas por espécie activada electronicamente (por exemplo, espécies de pró-oxidantes), que são caracterizadas por uma instabilidade estrutural extrema e a activação espontânea de e....

Protocolo

1. Preparação de instrumentos e soluções de trabalho

1. Preparar a solução de água de peixe. Faça uma solução estoque, dissolvendo 2 g de "Instant Ocean 'sais do mar em 50 ml de água destilada. Adicionar 1,5 ml de caldo de peixe de água para 1 L de água destilada para preparar pronto para usar água de peixe (sais do mar de 60 mcg / mL concentração final). Autoclave o pronto para usar água de peixe antes do uso. Esta solução é utilizada como meio de embriões de peixe-zebra.
2. Prepare metilcelulose para montagem embrião. Dissolve-se 1,5 g de metilcelulose em 50 ml de água estéril peixe. Facilitar a dissolução por meio de um ímã em uma placa de agita....

Resultados

Ao aplicar o método aqui descrito, podemos facilmente medir e detectar o estresse oxidativo (e níveis de ROS) em tecidos embrionários peixe-zebra. Depois de atravessar adulto zebrafish, os ovos são coletados e autorizados a desenvolver a 28 ° C a 72 horas pós-fecundação (hpf). Para induzir o estresse oxidativo, propomos duas abordagens diferentes: 1) o tratamento de embriões com fortes reagentes pró-oxidantes ou 2) promover a formação de ROS após a lesão de tecidos.

Na primeira abordagem, fo.......

Discussão

Etapas críticas

O procedimento para a detecção de stress oxidativo em embriões de peixe-zebra aqui descritos compreende dois métodos diferentes. O método de detecção de ROS montagem inteira é principalmente um teste qualitativo para a detecção de ROS, enquanto a célula único método de detecção de ROS permite medições quantitativas mais específicas (Figura 1). Ambos os métodos oferecem uma maneira rápida e fácil de avaliar a detecção de ROS-in vivo em embriões de peixe.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução de peróxido de hidrogênio	SIGMA	516813	NÃO ARMAZENE DILUIÇÕES
Solução de Sal Balanceada Hank's 1x	GIBCO	14025
Metilcelulose	SIGMA	M0387
Mistura de Sal Marinho para Aquário Instantâneo	OCEANO INSTANTÂNEO	SS15-10
Tricaína	SIGMA	A5040
Sonda Cgenérica sensível a ROS: CellROX Deep Red Reagent	INVITROGEN	C10422
Sonda sensível a ROS específica para mitocôndrias: MitoSOX	INVITROGEN	M36008	dissolver um frasco para injetáveis com 13 μ l de DMSO
Hidroetidina	INVITROGEN	D23107
Rotenona	SIGMA	R8875	Prepare a solução estoque de 5 mM em DMSO.
Dimetilsulfóxido	SIGMA	D2650
VAS2870; 3-Benzil-7-(2-benzoxazolil)tio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pirimidina	EnzoLifeScience	BML-EI395	dissolve o pó em DMSO; diluito em água de peixe
Iodeto de propídio	Sondas moleculares (Life Technologies)	P3566
7-aminoactinomicina D (7-AAD)	Sondas moleculares (Life Technologies)	A1310
Nrf2a Morpholino	GeneTools	5'-CATTTCAATCTCCAT CATGTCTCAG-3'Ref	: Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al.; 2002 (PMID:12167159)
Colagenase P	ROCHE	11213857001	Dissolver o pó a 100 mg/ml em HBSS estéril. Armazene alíquotas em -20 ° C
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	GIBCO	10010-056
Soro Fetal Bovino	GIBCO	10082-147
Comprimidos de Coquetel Inibidores de Protease Completos	ROCHE		Dissolva um comprimido em 1 ml de água
0,5% Tripsina-EDTA (10x), sem fenol vermelho	GIBCO	15400-054	Prepare 1x solução de trabalho antes do uso
Microscópio composto	Microscópio estéreo ZEISS
com iluminação fluorescente	Câmera Nikon	AZ100
	ZEISS	AxioCamMRm
para aquisição de imagens de fluorescência	ZEISS	ZEN 2011
Classificador de células ativadas por fluorescência	BD FACSCalibur
Centrifuge	Eppendorf	5417R
Tubos FACS	Placa	342065
	BD Falcon	353047
Placas de Petri esterilizadas, não tratadas 90 mm	VWR	391-1915
Microscópio confocal	Leica	Leica SP5

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