Summary
Multikomponenttekstilprodukter proteinkomplekser spiller afgørende roller i løbet af cellulære funktion og udvikling. Her beskriver vi en fremgangsmåde til at isolere native protein-komplekser fra Drosophila embryoner efter in vivo-tværbinding efterfulgt af oprensning af de tværbundne komplekser til efterfølgende struktur-funktions-analyse.
Abstract
Mange cellulære processer styres af multisubunit protein-komplekser. Ofte disse komplekser dannes forbigående og kræver oprindelige miljø at samle. Derfor, for at identificere disse funktionelle protein-komplekser, er det vigtigt at stabilisere dem in vivo før cellelyse og efterfølgende oprensning. Her beskriver vi en metode, der anvendes til at isolere store bona fide protein-komplekser fra Drosophila embryoner. Denne metode er baseret på embryo permeabilisering og stabilisering af komplekserne inde i embryoner ved in vivo-tværbinding under anvendelse af en lav koncentration af formaldehyd, der let kan krydse cellemembranen. Efterfølgende proteinkomplekset interesse immunooprenset efterfulgt af geloprensning og analyseret ved massespektrometri. Vi illustrerer denne fremgangsmåde ved hjælp af oprensning af en Tudor-protein-kompleks, som er afgørende for kimcellelinje udvikling. Tudor er et stort protein, som indeholder flere Tudor domæner - smallmoduler, der interagerer med denatureret argininer eller lysiner af target-proteiner. Denne fremgangsmåde kan tilpasses til isolering af native protein-komplekser fra forskellige organismer og væv.
Introduction
Isolering af multisubunit protein forsamlinger og DNA-eller RNA-protein-komplekser er udført for at identificere protein komplekser, genomisk loci anerkendt af DNA-bindende regulatoriske proteiner eller RNA mål for RNA-bindende proteiner. Forskellige metoder tillader genom-dækkende identifikation af DNA-sites anerkendt af transkriptionsfaktorer eller kromatin proteiner (chip-seq) 1 og RNA-mål, der er forbundet med en given RNA-bindende protein (CLIP-seq) 2.. Bibliotekerne af RNA-afledte cDNA'er eller DNA-mål så dybt sekventeret. Disse fremgangsmåder anvender kemiske eller UV-induceret krydsbinding at stabilisere komplekser efterfulgt af immunpræcipitering (IP) med et antistof mod et protein komponent af det undersøgte kompleks.
Under udviklingen af en organisme, mange protein komplekser dannes forbigående. Derfor er det afgørende at analysere sammensætningen og funktionen af disse komplekser in vivo for at forstå de molekylære mekanismer, der styrer development. Sådan en in vivo analyse ville være bedre in vitro fremgangsmåde, da det er næsten umuligt at gengive indfødte koncentrationer af interagerende komponenter og cellulære biokemiske miljø in vitro. Her demonstrerer vi en in vivo tilgang, som vi kunne bruge til at isolere store protein-komplekser fra Drosophila embryoner. I denne metode, er protein-komplekser i levende embryoner tværbundet med en lav koncentration af formaldehyd og efterfølgende protein-komplekser af interesse isoleres ved IP med et antistof mod et kendt element af komplekserne efterfulgt af gel-oprensning af komplekser og massespektrometrianalyse til identificere ukendte komplekse komponenter. Da formaldehyd er i stand til at gennemtrænge cellemembranen og har et tværbindende området 2,3-2,7 Å 3 kan proteinkomplekser tværbindes in vivo, og de komplekse komponenter er tilbøjelige til at være tæt på hinanden. I denne artikel vil vibeskriver denne fremgangsmåde ved hjælp af isolering af Tudor (Tud) protein-kompleks som et eksempel. Tud er en germline protein, som er afgørende for kønscelleoverførsel udvikling 4-7. Dette protein indeholder 11 TuD domæner vides at interagere med denatureret argininer eller lysiner andre polypeptider 8-10.
Tidligere har vi skabt en transgen Drosophila linje, der udtrykker HA-mærket funktionel Tud 5, og derfor er specifikke anti-HA antistof, der anvendes til at trække ned Tud kompleks efter krydsbinding.
Foruden protein-protein-tværbindinger, kan formaldehyd generere nukleinsyre-protein-tværbindinger og anvendes i chip-seq eksperimenter. Endvidere i Drosophila, in vivo krydsbinding med formaldehyd har muliggjort identifikation af en RNA-mål af Vasa RNA helicase protein 11.
Mens der i denne artikel vil vi beskrive en metode til in vivo tværbinding og purverifikation af protein-komplekser fra Drosophila embryoner, kan denne metode tilpasses til andre organismer og væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Forberedelse Store Apple Juice-agarplader
- For at gøre 4 plader, tilsættes 375 ml H 2 O, 11,25 g flyve agar og en omrørerstav til en 1.000 ml kolbe. Dette er Mix A. Autoklave Mix A med kolben låg løst loft på én 30 min-steriliseringscyklus til flydende varer.
- Tilføj 125 ml æblejuice, 12,5 g tabellen sukker og en omrørerstav i et 500 ml bægerglas. Dette er Mix B. Heat Mix B på en opvarmet platform under omrøring, og temperaturen holdes på ca 70 ° C, indtil autoklavering af blanding A er færdig.
- Efter færdiggørelsen af Mix A autoklavering overføre Mix B til Mix A. Hold omrøring den kombinerede blandingen forsigtigt og lad det køle af i 15 min. Undgå over-køling og den resulterende agar størkning før tilsætning af konserveringsmiddel.
- Gør 10% (vægt / volumen) methyl-4-hydroxybenzoat opløsning i ethanol. Dette vil virke som et konserveringsmiddel. Tilføj 3,75 ml af opløsningen til ovennævnte æblesaft-agar blanding. Hold omrøring i another 5 min.
- Hæld 125 ml æblejuice-agar blanding med konserveringsmiddel i hver 300 cm2 plast eller styrofoam plade. Lad det køle af til stuetemperatur, og størkne. Undgå dannelse af luftbobler, mens hælde.
Bemærk: æblesaft-agarplader er klar til brug med det samme. Dæk ubrugte plader med klare wraps og opbevares ved 4 ° C i op til en uge.
2.. Drosophila Embryo Indsamling og Pre-tværbindingsbehandling
- Load en befolkning bur med cirka 40.000 til 50.000 fluer fra hvilke embryoner vil blive indsamlet.
- Lav to plader, der hver indeholder 125 ml af standard cornmeal-melasse medium 12 og drys ca 4 g tørret bagegær på hver plade. Placer disse plader i befolkningen bur i en 25 ° C inkubator i 48 timer for at opfede fluerne.
- Varm 2 æble juice-agarplader til 25 ° C. Drys cirka 1 g tørret bagegær på hverplade. Placer de 2 plader i befolkningen buret for at begynde at indsamle 0-1 hr gamle embryoner.
- Tag pladerne ved enden af 1 time samling. Udskift med 2 nye plader, hvis en anden runde af indsamlingen er nødvendig.
- Føj nok vand til at dække pladerne og resuspender embryoner forsigtigt med en fin pensel. Hæld resuspenderede embryoner gennem en to lags si lavet af rustfrit stål trådnet.
Bemærk: Det øverste lag er fremstillet af medium porestørrelse (850 um) net, som opsamler store flyve dele samtidig lade gennem embryoner. Det nederste lag er lavet af finmasket (75 um), der opsamler embryoner samtidig lade gennem gær og vand. - Brug den fine pensel til at overføre de indsamlede embryoner i en samling kurv lavet med en 50 ml rør og fine nylon mesh. Skyl embryoner kortvarigt med vand og derefter skamplet masken på papirservietter til at tørre.
- Fordyb embryoner i 50% blegemiddel med blide skvulpen i 3 min. Skyl grundigly med vand for at fjerne eventuelt resterende blegemiddel. Dup masken på papirservietter til at tørre.
- Fordyb de dechorionated embryoner i isopropanol med forsigtig omrøring i 15 sek eller indtil fordelingen af multi-embryo klumper (dette bør ikke tage længere end 30 sek.) Dup masken på papirservietter til at tørre grundigt.
- Fordyb embryoner i heptan i 5 min, mens du bruger en pipette til at streame heptan over embryoner at holde dem resuspenderet. Dup masken på papirservietter til at tørre.
- Skyl embryoner med vandløb phosphatbufret saltvand, pH 7,4 (PBS) indeholdende 0,1% Triton X-100 (PBST) i 3 min.
- Skil indsamling kurven og overføre embryoner sammen med masken til et 15 ml rør indeholdende 10 ml PBST. Vend røret forsigtigt at vaske embryoner fra masken.
- Fjern masken fra røret. Sæt røret i en lodret stilling og lad embryoner synke til bunden af røret ved hjælp af tyngdekraften.
Bemærk: Cirka 100-300pi af embryoner forventes for en 1 hr samling fra et bur. - Fjern PBST og fortsætte med at udføre tværbinding straks.
3.. In vivo Crosslinking af Samlede embryoer
- Forbered 0,2% formaldehyd i PBST umiddelbart før brug. Tilsæt 10 ml af formaldehyd fiksativ til embryoner og inkuberes ved 25 ° C under forsigtig omrøring på et roterende rysteapparat i 10 min. Kassér ubrugt fiksativ ved udgangen af dagen.
- Quench tværbindingsreaktionen
- Ved afslutningen af tværbindingen, lad embryoner synke til bunden af røret.
- Fjern formaldehydopløsning. Straks tilsættes 10 ml 0,25 M glycin i PBST at slukke tværbindingsreaktionen. Inkuber ved 25 ° C med forsigtig omrøring på et roterende rysteapparat i 5 min.
- Lad embryoner synke til bunden af røret. Fjern quench løsning. Vask embryoner med 10 ml PBST tre gange.
- Helt fjerne PBST vask løsning med en pipette. Opbevar embryoner ved -80 ° C indtil brug.
4.. Protein Prøveforberedelse og Immunopræcipitation
- Homogeniseres 500 pi tværbundne embryoner under anvendelse af en Dounce homogenisator i 2 ml lysepuffer (0,5 M urinstof, 0,01% SDS, 2% Triton-X 100, 2 mM phenylmethansulfonylfluorid [PMSF] og protease inhibitor cocktail i PBS).
Bemærk: Udfør denne og de følgende trin ved RT medmindre andet er angivet. - Overfør lysatet til 1,5 ml centrifugerør og blidt på en roterende platform for 15 minutter for at sikre grundig lysis. Centrifuger lysatet ved 16.000 x g i 5 minutter for at pelletere celledebris. Gem supernatanten i et rent 15 ml rør.
- Tilsæt 40 ul anti-HA agaroseperler opslæmningen til supernatanten, og der inkuberes på en roterende platform for 2,5 timer.
- Pelletere kuglerne ved centrifugering ved 2.500 x g i 5 min. Fjern supernatanten men lade passendeximately 250 pi i slangen. Resuspendere perlerne i den resterende supernatant og overføres til et 1,5 ml spin-søjle med 10 um porefilter.
- Centrifugér spinkolonne ved 12.000 x g i 10 sek og kassér gennemstrømningen.
- Vask perlerne ved tilsætning af 200 pi vaskepuffer (0,1 M glycin, 1 M NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0,1% Tween-20 i PBS). Centrifugeres søjlen ved 12.000 x g i 10 sek og kassér vask. Gentag vask to gange mere.
- Tilsæt 40 gl elueringspuffer (2 mg / ml HA-peptid i PBS) til perlerne og inkuberes ved 37 ° C i 15 min med forsigtig omrøring hver 5 min. Centrifuger kolonnen ved 12.000 xg i 10 sek, og eluatet opsamles.
- Bekræft eluering af komplekset ved western-blot-analyse under anvendelse af anti-HA-antistof 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effektiviteten af tværbinding og vellykket oprensning af det tværbundne Tud protein-kompleks blev analyseret ved SDS-PAGE på en 3% - 7% trin gel (illustreret i figur 1), efterfulgt af western blot (figur 2).
Formålet med anvendelse af 3% - 7% trin gel baseret på den effektive adskillelse af tværbundet Tud protein kompleks fra de resterende ikke-krydsbundet Tud protein og koncentration af komplekset. Under vores in vivo tværbindingsbetingelser nævnt ovenfor, kunne en stor del af Tud protein stadig ikke-tværbundet. Denne gratis Tud protein ville copurify med krydsbundet kompleks i undersøgelsesperioden indtil separation ved SDS-PAGE. Selvom store i størrelsen, tværbundet Tud protein (285 kDa) migrerer på tværs af 3% - 7% grænsen uden indlysende fastholdelse. Betragtninger tværbundet Tud protein kompleks med større molekylvægt ville have svært ved at migrere over gelen grænse, hvilket resulterer i the kompleks bliver "fanget" og koncentreret ved grænsen eller "hale" nær grænsen, og derfor adskille fra det frie Tud protein.
Inddragelsen af en ordentlig kontrol er afgørende for at validere specificitet denne krydsbinding protokol. Derfor brugte vi embryoer udtrykker HA-mærkede GFP-protein 14 til at overvåge omfanget af tværbinding. Vi har udført pilotforsøg med forskellige formaldehyd koncentrationer (0,1% - 2%) på fostre, der udtrykker HA-tagget GFP og en del af resultaterne (0,1% - 0,5%) er vist her (figur 3). Det er klart, at det absolutte flertal af GFP-protein i de behandlede embryoer (op til 0,5% formaldehyd) forblev ikke-tværbundet, hvilket valideret, at vores tværbinding protokol ikke tværbinde målprotein til tilfældige omgivende molekyler. Især gjorde 0,2% formaldehyd behandling (figur 3, bane 5 og 6) ikke viser nogen krydsbundne produkter i forhold til uncrosslinked kontrol (figur 3, bane 1 og 2) på trods af den forlængede eksponeringstid af filmen, hvilket yderligere begrundede vores valg af 0,2% formaldehyd i denne protokol. Imidlertid bør GFP kontrol embryoner altid være tværbundet parallelt med Tud komplekse tværbinding under de samme betingelser og kontrol GFP protein prøver skal køres på 3% - 7% trin gel sammen med TUD komplekse prøver følgende IP. Desuden er både Tud kompleks og det tilsvarende GFP kontrol 3% - bør 7% gel områder udskæres og forelagt til massespektrometri analyse for at bestemme falske positive kandidater, der vil være til stede i både Tud komplekst bånd og GFP-kontrol.
Effektiviteten af in vivo tværbinding blev bestemt ved sammenligning fri Tud protein og Tud kompleks fra tværbundet kontrol og tværbundne embryoner prøver (figur 2A). Gratis Tud protein fra uncrosslinked kontrol embryoner næsten eksklusivty vandrede over 3% - 7% grænse med minimalt beløb tilbageholdt nær grænseområdet (figur 2A, bane 1). I modsætning til, at de tværbundne embryoner viste tilstedeværelsen af store molekylvægt Tud tværbundet kompleks på 3% - 7% gel kant (figur 2A, bane 2). Dette viste tydeligt, at vores tværbinding procedure held tværbundet cirka 50% af den samlede Tud protein med dets in vivo interagerende partnere (sammenlign figur 2A bane 1 og 2).
Den konkurrencemæssige eluering med HA-peptid bekræftede den vellykkede rensning og styrket specificitet det oprensede Tud protein kompleks (figur 2B). Elueringsfraktionen af HA-peptid indeholdt komplekset koncentreret omkring 3% - grænseområde 7% og også fri Tud protein (figur 2B, bane 1). Følgende SDS prøve buffer elueres meste fri Tud tilbage på perler og minimal mængde Tud kompleks (
. Figur 1 Diagram over 3% -. 7% trin gel anvendes til SDS-PAGE på 3% - 7% trin gel manuelt støbt på en sådan måde, at det indeholder tre lag. Fra top til bund, disse lag er 3% stacking gel, 3% separationsgel og 7% separationsgel. At arbejde med Mini-PROTEAN systemet (Bio-Rad), der anvendes i dette skrift, blev højden af 3% separationsgel lavet til at være omkring 1 cm, som er afbildet i diagrammet.
Bemærk: 3% stacking gel og de 3% separationsgel lag er meget skrøbelige, så vær ekstra forsigtig, når du håndterer gelen for at forhindre forvridning af disse lag.
upload/51387/51387fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51387/51387fig2.jpg "/>
. Figur 2. Western blot resultatet af tværbundet embryoner og kontrol embryoer lysater og rensning af Tudor protein kompleks af IP Panel A, bane 1, råprotein lysat af uncrosslinked kontrol embryoner.; bane 2, råprotein lysat fra formaldehyd krydsbundet embryoner. Panel B, bane 1, eluering af HA-peptid efter IP fra tværbundet foster lysat; bane 2, eluering med 2 x SDS-prøvebuffer efter den første HA-peptid-eluering. SDS-PAGE blev kørt ved 200 V i 3,5 timer. Anti-HA-antistof (1:1000) blev anvendt i western blot.
Figur 3.. Western blot resultater af tværbundet embryoner og kontrol embryoer udtrykker HA-tagget GFP. Bane 1, råprotein lysat of uncrosslinked kontrol embryoner; bane 2, samme som bane 1, men den dobbelte mængde; bane 3, råprotein lysat af krydsbundne embryoner ved hjælp af 0,1% formaldehyd; bane 4, samme som bane 3, men den dobbelte mængde; bane 5, råprotein lysat af krydsbundne embryoner ved hjælp af 0,2% formaldehyd; bane 6, samme som bane 5, men den dobbelte mængde; bane 7, råprotein lysat af krydsbundne embryoner ved hjælp af 0,3% formaldehyd; bane 8, samme som bane 7, men den dobbelte mængde. Bane 9, råt lysat af tværbundne embryoner ved 0,5% formaldehyd. SDS-PAGE blev kørt ved 200 V i 45 minutter i 4% - 15% gradient gel. Anti-HA-antistof (1:1000) blev anvendt i western blot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formaldehyd har været almindeligt anvendt som et tværbindingsreagens for at identificere protein-protein-og protein-nukleinsyre-interaktioner. Sin gode opløselighed og cellemembranpermeabilitet sammen med kompatibilitet med downstream massespektrometri procedurer, gør formaldehyd en ideel kandidat agent for intracellulære tværbindingsbetingelser applikationer 3,15-17. Især blev det med succes brugt til at identificere mRNAer forbundet med Vasa, et kritisk kønsceller RNA helicase i Drosophila 11. Desuden formaldehyd har en af de korteste spacerarme (2,3-2,7 Å) blandt kommercielt tilgængelige tværbindingsmidler, hvilket indebærer, at kun molekyler, der findes i umiddelbar nærhed ville være tværbundet under ordentlige forhold, styrkelse af specificiteten af de interagerende partnere i målproteinets . Af de ovenfor anførte grunde blev formaldehyd valgt som tværbindingsmidlet i vores protokol. Dette bør dog ikke udelukke usefulness andre krydsbindingsmidler i in vivo ansøgning om Drosophila embryoner. Imidlertid har vi prøvet at anvende dithiobis (succinimidylpropionat) (DSP), et N-hydroxysuccinimid (NHS)-ester familie tværbinder anvendes ofte i kombination med formaldehyd i chip assays 17,18 i stedet for formaldehyd i vores undersøgelse, men ingen tilsyneladende Tud Komplekset blev opnået med denne tværbinder På den anden side kan DSP være effektive for andre protein komplekser, som vil skulle afgøres fra sag til sag. Ud over in vivo tværbinding tilgang, har in vitro-tværbindere fra bismaleimidohexan (BMH)-familien vist sig at være effektiv i at fange protein-protein interaktioner i Drosophila embryoner 14,19, men i disse eksperimenter tværbindingen forekom efter embryo ekstrakter blev foretaget.
Tværbindingen tid, temperatur og formaldehyd-koncentrationen er de tre store FACtorer, der påvirker tværbinding effektivitet. Vores protokol er blevet testet ved hjælp af pilotforsøg for hver enkelt faktor, derfor er det blevet optimeret til tværbindingen af Tud protein og dets interagerende partnere i Drosophila embryoner in vivo, samtidig med at balancen mellem specificitet krydsbundet kompleks og risikoen for tværbinding uspecifikke molekyler. Uspecifik tværbinding fører til tilstedeværelsen af falske positiver i komplekset og skal kontrolleres omhyggeligt med et ubeslægtet protein kontrol, for eksempel GFP, som blev anvendt i vore forsøg. Desuden kan de optimale tværbindingsbetingelser varierer med forskellige målmolekyler. Derfor vil bruge vores protokol som udgangspunkt, den optimale tværbindende tid, temperatur og formaldehydkoncentrationen skal bestemmes for et givet protein kompleks af interesse.
Når de optimale tværbindingsbetingelser er etableret er det vigtigt at follow dem præcist hver gang embryonerne krydsbundet at minimere uspecifik krydsbinding. Yderligere afgørende skridt vasker perlerne efter IP med høj koncentration af NaCI (1 M) og to detergenter (IGEPAL CA-630 og Tween-20) for at reducere uspecifik binding af ubeslægtede proteiner, embryonale ekstrakter til perlerne.
Vores protokol afhænger af den høje affinitet mellem målproteinet og det antistof, der anvendes til at trække ned proteinkomplekset i undersøgelsesperioden. Derfor bør antistoffets epitop i målproteinet ikke ødelægges af krydsbinding og skal være tilgængelig for antistoffet i undersøgelsesperioden. Desuden bør antistoffet target protein-interaktion modstå de strenge vasker med henblik på reduktion af ikke-specifikke baggrund proteiner. Disse krav til en vellykket IP kan forhindre en fra at ansætte en bestemt antistof-epitop kombination, men det bør være muligt at finde en egnet antistof-epitop par for et protein af interesse. Især har HA-tag-epitop og det tilsvarende antistof blevet brugt med succes i denne protokol.
Den beskrevne protokol kan anvendes til isolering af native protein-komplekser i forskellige udviklingsstadier og i forskellige væv. Selvom vi vise denne metode til Drosophila kan vores protokol kan tilpasses til andre organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler og Jimiao Zheng for deres teknisk hjælp til denne undersøgelse. Dette arbejde blev støttet af NSF KARRIERE indrømme MCB-1054962 til ALA
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10X to 1X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome research. 22, 1813-1831 (2012).
- Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq. Methods. , (2013).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).
- Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).
- Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture. Development. 133, 4053-4062 (2006).
- Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster. Cell. 43, 97-104 (1985).
- Thomson, T., Lasko, P. Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning. Genesis. 40, 164-170 (2004).
- Arkov, A. L., Ramos, A. Building RNA-protein granules: insight from the germline. Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).
- Gao, M., Arkov, A. L. Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline. Molecular reproduction and development. , (2012).
- Liu, H., et al. Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor. Genes & development. 24, 1876-1881 (2010).
- Liu, N., Han, H., Lasko, P. Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3. UTR. Genes & development. 23, 2742-2752 (2009).
- Matthews, K. A. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. 44, Academic Press. 13-32 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
- Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins. Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).
- Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry. Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).
- Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).
- Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39, 715-725 (2005).
- Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41, 694- (2006).
- Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation. Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).
