Summary
Complexos de proteínas multi-componentes desempenham um papel crucial durante a função celular e desenvolvimento. Aqui, descrevemos um método usado para isolar complexos proteína nativa a partir de embriões de Drosophila após reticulação in vivo seguido de purificação dos complexos de ligações cruzadas para a subsequente análise da estrutura-função.
Abstract
Muitos processos celulares são controlados por complexos de proteína de múltiplas subunidades. Freqüentemente, esses complexos formam transitoriamente e exigem ambiente nativo de montar. Portanto, para identificar estes complexos proteicos funcionais, é importante para estabilizar in vivo antes da lise das células e purificação subsequente. Aqui nós descrevemos um método utilizado para isolar grandes complexos de proteínas de boa-fé a partir de embriões de Drosophila. Este método baseia-se na permeabilização embrião e estabilização dos complexos no interior dos embriões por reticulação in vivo, utilizando uma baixa concentração de formaldeído, o que pode facilmente atravessar a membrana celular. Subsequentemente, o complexo de proteína de interesse é imunopurificada seguido de purificação em gel e analisados por espectrometria de massa. Ilustraremos este método utilizando a purificação de uma proteína complexa Tudor, que é essencial para o desenvolvimento da linha germinativa. Tudor é uma grande proteína, que contém vários domínios Tudor - pequenomódulos que interagem com argininas metiladas ou lisinas de proteínas alvo. Este método pode ser adaptado para o isolamento de complexos de proteína nativa a partir de diferentes organismos e tecidos.
Introduction
Isolamento de conjuntos de proteínas de subunidades múltiplas e complexos de ADN ou ARN-proteína é realizada para identificar complexos proteicos, locus genómico reconhecidos pelas proteínas reguladoras de ligação de ADN ou de ARN alvos de proteínas de ligação a ARN. Diferentes métodos permitem a identificação do genoma de sites de DNA reconhecidos por fatores de transcrição ou proteínas da cromatina (Chip-seq) 1 e metas de RNA associadas a uma determinada proteína de ligação de RNA (CLIP-seq) 2. As bibliotecas do ADNc derivado de ARN-ou alvos de DNA são então profundamente sequenciado. Estes métodos utilizam química ou reticulação para estabilizar os complexos seguido por imunoprecipitação (IP), com um anticorpo contra um componente proteico do complexo estudado induzida por UV.
Durante o desenvolvimento de um organismo, muitos complexos de proteínas formam transitoriamente. Portanto, é essencial analisar a composição e função dos complexos in vivo para compreender os mecanismos moleculares que controlam devolvimento. Tal análise in vivo seria superior à abordagem in vitro, uma vez que é virtualmente impossível reproduzir concentrações nativas dos componentes que interagem e ambiente bioquímico celular in vitro. Aqui demonstramos uma abordagem in vivo que utilizam com sucesso para isolar grandes complexos de proteínas a partir de embriões de Drosophila. Neste método, os complexos de proteína em embriões vivos são reticulados com um baixo teor de formaldeído e, subsequentemente, os complexos de proteína de interesse é isolado por IP com um anticorpo contra um componente conhecido dos complexos, seguida de purificação em gel dos complexos e análise de espectrometria de massa para identificar componentes complexos desconhecidos. Uma vez que o formaldeído é capaz de permear a membrana celular e possui um intervalo de reticulação de 2,3-2,7 Å 3, complexos de proteína, pode ser reticulado in vivo, e os componentes do complexo são susceptíveis de estar perto um do outro. Neste artigo,descrever este método usando o isolamento de Tudor (Tud) complexo de proteína como um exemplo. Tud é uma proteína da linha germinativa, que é essencial para o desenvolvimento da linha germinativa 4-7. Esta proteína contém 11 domínios TuD conhecidas por interagirem com argininas metiladas ou lisinas de outros polipeptídeos 8-10.
Anteriormente, têm gerado uma linha de Drosophila transgênica que expressa HA-marcado funcional Tud 5 e, portanto, o anticorpo anti-HA específico é utilizado para puxar para baixo complexo Tud após reticulação.
Em adição a ligações cruzadas de proteína-proteína, o formaldeído pode gerar ácido nucleico ligações cruzadas em proteína e é usado em experiências de ChIP-seq. Além disso, em Drosophila, in vivo, de ligação cruzada com formaldeído, permitiu a identificação de um alvo de ARN da proteína helicase vasa ARN 11.
Enquanto neste artigo descrevemos um método para a reticulação vivo e purificação de complexos de proteínas a partir de embriões de Drosophila, este método pode ser adaptado para outros organismos e os tecidos.
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Protocol
1. Preparando grandes da Apple Juice Placas-ágar
- Para fazer quatro placas, adicionar 375 ml de H 2 O, 11,25 g de agar mosca e uma barra de agitação para um balão de 1000 ml. Este é Mix A. Autoclave Mix Um frasco com a tampa solta tampado em um ciclo de 30 min-esterilização para produtos líquidos.
- Adicione 125 ml de suco de maçã, 12,5 g de açúcar de mesa e uma barra de agitação para um copo de 500 ml. Esta mistura é B. Calor mistura B numa plataforma aquecida enquanto se agita e mantém a temperatura a cerca de 70 ° C até que a autoclave de mistura A é terminado.
- Após a conclusão da Mix A autoclavagem, transferir Mix B para A. Misture Continue mexendo a mistura combinada com cuidado e deixe esfriar por 15 min. Evitar a sobre-arrefecimento e a solidificação de agar resultou antes da adição de conservante.
- Adicione 10% (peso / volume) de solução de metil 4-hidroxibenzoato de metilo em etanol. Isto irá actuar como um conservante. Adicionar 3,75 mL da solução para a mistura de sumo de maçã-agar acima. Continue mexendo por another 5 min.
- Despeje 125 ml mistura de suco de maçã-agar com conservante em cada 300 cm 2 de plástico ou placa de isopor. Deixe esfriar para RT e solidificar. Evite a formação de bolhas de ar ao derramar.
Nota: As placas-ágar suco de maçã está pronto para usar imediatamente. Cobrir as placas não utilizadas com envoltórios claras e armazenar a 4 ° C durante até uma semana.
2. Colheita de embriões Drosophila e Tratamento de pré-reticulação
- Coloque uma gaiola população com cerca de 40.000 a 50.000 moscas a partir do qual os embriões serão coletados.
- Faça duas placas, cada uma contendo 125 ml de farinha de milho-padrão médio melaço 12 e polvilhe aproximadamente 4 g de fermento de padeiro seco em cada placa. Coloque estas placas na gaiola população em uma incubadora a 25 ° C por 48 horas para engordar as moscas.
- Aqueça 2 maçã placas suco-ágar a 25 ° C. Polvilhar aproximadamente 1 g de levedura de padeiro seca em cadaprato. Coloque as duas placas na gaiola população para começar a coletar 0-1 embriões hr de idade.
- Retire das placas no final da recolha de 1 hora. Substitua com 2 placas novas, se for necessário mais uma rodada de coleta.
- Adicionar água suficiente para cobrir as placas e ressuspender os embriões suavemente com um pincel fino. Despeje os embriões ressuspensão através de uma peneira de duas camadas feitas de malha de arame de aço inoxidável.
Nota: A camada superior é feita de tamanho de poros médio (850 mm) de malha que reúne grande parte da mosca, deixando através de embriões. A camada inferior é feita de malha fina (75 mm) que recolhe embriões, deixando através de levedura e água. - Use o pincel fino tinta para transferir os embriões coletados em uma cesta coleção feita com um tubo de 50 ml e de malha fina de nylon. Lavar os embriões brevemente com água, em seguida, seque a malha em papel toalha para secar.
- Mergulhe os embriões em 50% água sanitária com agitação suave por 3 min. Enxágüe completaly com água para remover qualquer remanescente de branqueamento. Blot a malha em papel toalha para secar.
- Mergulhe os embriões dechorionated em isopropanol com agitação suave durante 15 segundos ou até que a quebra de aglomerados multi-embrião (isso não deve demorar mais do que 30 segundos). Blot a malha em papel toalha para secar completamente.
- Mergulhe os embriões em heptano por 5 minutos enquanto estiver usando uma pipeta para transmitir heptano sobre os embriões para mantê-los ressuspenso. Blot a malha em papel toalha para secar.
- Lavar os embriões com fluxos de fosfato salino tamponado, pH 7,4 (PBS) contendo 0,1% de Triton X-100 (PBST) durante 3 min.
- Desmontar o cesto de recolha e transferência de embriões, juntamente com a malha para um tubo de 15 ml contendo 10 ml de PBST. Inverter o tubo suavemente para lavar os embriões fora da malha.
- Retirar a malha do tubo. Colocar o tubo na posição vertical, e deixar os embriões afundar para o fundo do tubo por gravidade.
Nota: Cerca de 100-300mL de embriões é esperado para uma coleção de 1 hora a partir de uma gaiola. - Remover o PBST e continuar a realizar a reticulação imediatamente.
3. In vivo A reticulação dos embriões colhidos
- Prepare a 0,2% de formaldeído em PBST imediatamente antes da utilização. Adicionar 10 ml de formaldeído para o fixador os embriões e incubar a 25 ° C com agitação suave num agitador rotativo durante 10 min. Descarte fixador não utilizados até o final do dia.
- Extingue-se a reacção de reticulação
- No final da reticulação, deixar os embriões afundar para o fundo do tubo.
- Remover a solução de formaldeído. Imediatamente adicionar 10 ml de 0,25 M de glicina em PBST para extinguir a reacção de reticulação. Incubar a 25 ° C com agitação suave num agitador rotativo, durante 5 min.
- Deixe os embriões afundar para o fundo do tubo. Remover a solução de resfriamento. Lavar os embriões com 10 mL de PBST três vezes.
- Remover completamente o PSolução de lavagem BST com uma pipeta. Armazenar embriões a -80 ° C até à sua utilização.
4. Proteína Preparação de Amostras e Immunoprecipitation
- Homogeneizar 500 ul embriões reticulados utilizando um homogeneizador Dounce, em 2 ml de tampão de lise (0,5 M de ureia, 0,01% de SDS, 2% de Triton-X 100, fluoreto de fenilmetanossulfonilo 2 mM [FPMS], e cocktail inibidor de protease em PBS).
Nota: Execute este e os seguintes passos na RT, a menos que especificado em contrário. - Transferir o lisado para tubos de 1,5 ml de centrífuga e agitar suavemente sobre uma plataforma rotativa durante 15 minutos para assegurar a lise completa. Centrifuga-se o lisado a 16.000 x g durante 5 min para sedimentar os detritos celulares. Salve o sobrenadante em um tubo de 15 ml limpo.
- Adicionar 40 ul de contas de agarose anti-HA lama para o sobrenadante e incubar numa plataforma rotativa durante 2,5 horas.
- Sedimentar as pérolas por centrifugação a 2500 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante, mas deixar adeximately 250 mL no tubo. Ressuspender as esferas no sobrenadante remanescente e transferidos para uma coluna de centrifugação de 1,5 ml com 10 mM de filtro poroso.
- Centrifugar a coluna girar a 12.000 xg por 10 segundos e descartar o fluxo através.
- Lave os grânulos por adição de 200 ul de tampão de lavagem (0,1 M de glicina, 1 M de NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0,1% de Tween-20, em PBS). Centrifugar a coluna a 12.000 xg por 10 segundos e descartar a lavagem. Repita a lavagem mais duas vezes.
- Adicionar 40 ul de tampão de eluição (2 mg / ml de HA-péptido em PBS) às pérolas e incubar a 37 ° C durante 15 min com agitação suave a cada 5 min. Centrifugar a 12000 xg durante 10 seg e recolher o eluato.
- Confirmar eluição do complexo por análise de Western-blot, utilizando um anticorpo anti-HA 13.
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Representative Results
A eficácia da reticulação e a purificação com sucesso do complexo proteico reticulado Tud foram analisadas por SDS-PAGE em um 3% - gel de 7% etapa (ilustrada na Figura 1), seguido por transferência de Western (Figura 2).
O objectivo de utilizar a 3% - 7% de gel passo é baseado na separação eficaz de complexo de proteína reticulada Tud da proteína Tud reticulada remanescente e a concentração do complexo. Sob as nossas condições in vivo de reticulação mencionados acima, uma grande proporção de proteína Tud ainda pode permanecer não reticulado. Esta proteína Tud livre seria copurify com o complexo reticulado durante IP até que a separação por SDS-PAGE. Embora grande em tamanho, não reticulada proteína Tud (285 kDa) migra através da 3% - limite de 7%, sem retenção óbvio. Considerando complexo de proteínas Tud reticulado com peso molecular maior teria dificuldade de migrar através da fronteira gel, resultando em the complexo que está sendo "preso" e concentrou-se na fronteira ou "rejeito", perto da fronteira e, portanto, a separação da proteína Tud livre.
A inclusão de um controlo adequado é crítico para validar a especificidade deste protocolo de reticulação. Portanto, utilizou-se os embriões que expressam HA-tag proteína GFP 14 para monitorizar a extensão da reticulação. Efetuamos experiências-piloto de diferentes concentrações de formaldeído (0,1% - 2%) em embriões expressando GFP HA-marcados e parte dos resultados (0,1% - 0,5%) são mostrados aqui (Figura 3). É claro que a maioria absoluta de proteína da GFP nos embriões tratados (até 0,5% de formaldeído) permaneceram não reticulado, que validado que o protocolo de reticulação não a proteína alvo de reticulação para as moléculas vizinhas aleatórios. Em particular, o tratamento com formaldeído 0,2% (Figura 3, pista 5 e 6), não mostraram quaisquer produtos reticulados quando comparado com uncrcontrole osslinked (Figura 3, pista 1 e 2), apesar de o tempo de exposição prolongada do filme, o que justifica ainda mais a nossa escolha de 0,2% de formaldeído neste protocolo. No entanto, os embriões de controlo de GFP deve sempre ser reticulados em paralelo com o complexo de ligação cruzada Tud sob as mesmas condições e amostras de proteína GFP controlo deve ser executado na 3% - gel de 7% etapa, juntamente com amostras complexas TuD seguinte IP. Além disso, tanto complexo Tud eo correspondente controle GFP 3% - áreas de gel 7% devem ser retirados e enviados para análise de espectrometria de massa para determinar os candidatos falsos positivos que estarão presentes tanto em banda complexo Tud eo controle GFP.
A eficácia da reticulação in vivo na foi determinada por comparação da proteína Tud livre e complexo Tud de controlo não reticulado e embriões amostras reticuladas, respectivamente (Figura 2A). Proteína grátis Tud a partir de embriões de controle reticuladas quase exclusively migraram através de 3% - limite de 7% com quantidade mínima manteve perto da zona de fronteira (Figura 2A, pista 1). Contrariamente a isso, os embriões reticulados mostrou a presença de grande peso molecular complexo reticulado Tud na 3% - margem de gel de 7% (Figura 2A, pista 2). Isto mostrou claramente que o nosso procedimento de reticulação reticuladas com sucesso cerca de 50% da proteína total Tud com os seus parceiros de interacção in vivo (comparar com a figura 2A pista 1 e 2).
A eluição competitiva com o péptido de HA-, confirmou a purificação bem sucedida e reforçada a especificidade do complexo de proteína purificada Tud (Figura 2B). A fracção de eluição por HA-péptido continha o complexo concentrado em torno de 3% - 7% área de fronteira e também proteína Tud livre (Figura 2B, faixa 1). O tampão de amostra SDS seguinte eluída na maior parte livre Tud remanescente nas contas e quantidade mínima de complexo Tud (
. Figura 1: Diagrama de 3% -. Gel passo 7% utilizado para SDS-PAGE A 3% - gel de passo 7% é moldado manualmente, de tal forma que ele contém três camadas. Do topo até ao fundo, as camadas são de 3% de gel de empilhamento, 3% de gel de separação e 7% de gel de separação. Para trabalhar com o sistema Mini-PROTEAN (Bio-Rad) utilizado neste manuscrito, a altura do gel de separação de 3% foi feito para ser cerca de 1 cm, conforme ilustrado no diagrama.
Nota: O gel de empilhamento de 3% e os que separam camadas de gel 3% são extremamente frágeis por isso tome cuidado extra quando manusear o gel para evitar a distorção dessas camadas.
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. Figura 2 resultados de Western blot de embriões reticulados e embriões de controle lisados e purificação de proteína complexa Tudor por IP Painel A, faixa 1, lisado de proteína bruta de embriões controle reticuladas.; pista 2, ligado de proteína em bruto a partir de embriões de formaldeído reticulados. O painel B, pista 1, eluição por HA-péptido depois IP a partir de lisado de embrião reticulado; pista 2, eluição por 2 x tampão de amostra de SDS após a eluição inicial de HA-péptido. SDS-PAGE foi realizada a 200 V durante 3,5 horas. Anticorpo anti-HA (1:1000) foi usado em western blot.
Figura 3. Resultados Western blot de embriões de ligações transversais e os embriões de controlo que expressam a GFP marcada com HA. Pista 1, proteína de lisado of embriões controle reticuladas; pista 2, mesmo que a pista 1 mas o dobro da quantidade; faixa 3, lisado de proteína bruta de embriões reticuladas utilizando 0,1% de formaldeído; pista 4, mesmo que a pista 3 mas o dobro da quantidade; pista 5, lisado de proteína bruta de embriões reticuladas utilizando 0,2% de formaldeído; pista 6, mesmo que a pista 5, mas o dobro da quantidade; pista 7, lisado de proteína bruta de embriões reticuladas utilizando 0,3% de formaldeído; pista 8, mesmo que a pista 7, mas o dobro da quantidade. Pista 9, ligado bruto de embriões reticulados utilizando formaldeído a 0,5%. SDS-PAGE foi realizada a 200 V durante 45 minutos em 4% - gel de gradiente de 15%. Anticorpo anti-HA (1:1000) foi usado em western blot.
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Discussion
O formaldeído foi utilizada como um reagente de ligação cruzada para a identificação da proteína-proteína e interacções proteína-ácido nucleico. A sua boa solubilidade e permeabilidade da membrana da célula, juntamente com a compatibilidade com os procedimentos de espectrometria de massa a jusante, fazer formaldeído um agente candidato ideal para aplicações de reticulação intracelulares 3,15-17. Em particular, foi utilizado com sucesso para identificar mRNAs associados com vasa, uma helicase de ARN de células germinativas crítico em Drosophila 11. Além disso, o formaldeído tem um dos mais curtos braços espaçadores (2,3-2,7 Å) entre os agentes de ligação cruzada comercialmente disponíveis, o que implica que apenas as moléculas que existem na proximidade iria ser reticulada, sob condições adequadas, o reforço da especificidade dos parceiros de interacção da proteína alvo . Pelas razões expostas acima, o formaldeído foi escolhido como o agente de ligação cruzada em nosso protocolo. No entanto, isso não deve excluir a usefulness de outros agentes de reticulação em in vivo pedido de embriões de Drosophila. No entanto, nós tentamos usar Ditiobis (propionato succinimidyl) (DSP), um N-hidroxi-(NHS) crosslinker família éster freqüentemente usado em combinação com formaldeído em ensaios ChIP 17,18, para substituir o formaldeído em nosso estudo, mas não Tud aparente complexo foi obtida com este crosslinker Por outro lado, DSP pode ser eficaz para outros complexos de proteínas que precisam ser determinada com base caso-a-caso. Além de abordagem in vivo de reticulação, agentes de ligação cruzada in vitro, a partir de bismaleimido-hexano (BMH) família têm demonstrado ser eficazes na captura de interacções proteína-proteína em embriões de Drosophila 14,19, no entanto, nestas experiências, a ligação cruzada ocorreu após extractos embriões foram feitas.
O tempo de reticulação, a temperatura ea concentração de formaldeído são os três principais fatoresres que influenciam a eficiência de ligação transversal. O protocolo foi testado utilizando experiências piloto para cada um seu factor individual, por conseguinte, que foi optimizada para a reticulação da proteína e os seus parceiros Tud interagem em embriões de Drosophila in vivo, mantendo ao mesmo tempo o equilíbrio entre a especificidade do complexo de ligação cruzada e o risco de reticulação moléculas inespecíficas. Reticulação não específica conduz à presença de falsos positivos no complexo e deve ser cuidadosamente controlada com um controlo de proteína não relacionada, por exemplo, GFP, o qual foi utilizado nas nossas experiências. Além disso, as condições de reticulação óptimas podem variar com diferentes moléculas alvo. Portanto, utilizando o nosso protocolo como um ponto de partida, o tempo óptimo de reticulação, temperatura e a concentração de formaldeído terá que ser determinada para um dado complexo de proteínas de interesse.
Uma vez estabelecidas as condições ótimas de reticulação é fundamental para foGUARDE-las com precisão cada vez que os embriões são reticulados para minimizar a ligação cruzada não específica. Passo crucial adicional é lavagem das pérolas após IP com alta concentração de NaCl (1 M) e dois detergentes (IGEPAL CA-630 e Tween-20) para reduzir a ligação não específica de proteínas não relacionadas a partir de extractos embrionárias para os grânulos.
Nosso protocolo depende da alta afinidade entre a proteína alvo e o anticorpo utilizado para puxar para baixo o complexo de proteína durante IP. Portanto, o epitopo do anticorpo a proteína alvo não devem ser destruídas pela reticulação e tem de estar acessível para o anticorpo durante IP. Além disso, a interacção de proteínas do anticorpo-alvo deve suportar as lavagens rigorosas que visam a redução de proteínas de fundo não específica. Estes requisitos de IP bem sucedida pode impedir que se empregando uma combinação específica de anticorpos com epitopo, contudo, deverá ser possível encontrar um par anticorpo-epitopo apropriado para uma proteína de interesse. Em particular, o epitopo de HA-tag e o correspondente anticorpo têm sido utilizados com sucesso neste protocolo.
O protocolo descrito pode ser utilizado para o isolamento de complexos de proteínas nativas durante as diferentes fases de desenvolvimento e em tecidos diferentes. Embora nós demonstrar este método para Drosophila, o nosso protocolo pode ser adaptado para outros organismos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler e Jimiao Zheng por sua ajuda técnica com este estudo. Este trabalho foi financiado pela NSF CARREIRA conceder MCB-1054962 para ALA
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10X to 1X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
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