Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus

Resumo

Aqui, apresentamos o nosso método estabelecido para reprogramar células somáticas humanas em iPSCs humanos sem transgene com o vírus Sendai, que mostra resultado consistente e maior eficiência.

Resumo

Há alguns anos, a criação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs humanos) marcou o início de uma nova era na área da biomedicina. Os usos potenciais de iPSCs humanos incluem modelagem patogênese de doenças genéticas humanas, a terapia celular autóloga após a correção do gene, e triagem de drogas personalizado, fornecendo uma fonte de células relevantes e sintomas específicos para cada paciente. No entanto, existem vários obstáculos a ultrapassar, tais como a eliminação da expressão do transgene factor de reprogramação remanescente após a produção iPSCs humanos. Mais importante ainda, a expressão do transgene residual em iPSCs humanos indiferenciadas poderia dificultar diferenciações adequadas e desencaminhar a interpretação em fenótipos vitro relevante doença. Com isso, iPSCs humanos sem transgene livre de integração e / ou que tenham sido desenvolvidos usando vários métodos, tais como adenovírus, o sistema piggyBac, minicírculo vetor, vetores epissomais, entrega direta e proteína sintetizada mRNA. No entanto, a eficiência de reprogramming usando métodos livre de integração é bastante baixo na maioria dos casos.

Aqui, apresentamos um método para isolar iPSCs humanos usando Sendai-vírus (vírus RNA) sistema de reprogramação base. Este método de reprogramação mostra resultados consistentes e de alta eficiência em termos de rentabilidade.

Introdução

Células estaminais embrionárias humanas (hESCs) têm a capacidade de se auto-renovar pluripotência in vitro e têm, o que poderia ser potencialmente útil para a modelagem de doenças, para a triagem de drogas e para desenvolver terapias baseadas em células para tratar lesões e doenças do tecido. No entanto, hESCs tem uma limitação para a terapia de reposição celular por causa de barreiras imunológicas, oncológicas e éticos, e estudar genes de doenças relacionadas, hESCs específicos da doença poderia ser isolado por meio de diagnóstico genético pré-implantação (PGD) se aproxima, mas ainda é tecnicamente desafiador e as doações de embriões são muito raros. Estes problemas estão relacionados com o progresso na biologia das células estaminais, o que levou ao desenvolvimento de células estaminais pluripotentes induzidas (hiPSCs).

IPSCs humanos são geneticamente reprogramadas a partir de células somáticas adultas humanas e abrigam células-tronco pluripotentes como características semelhantes a hESCs, o que os torna uma fonte útil para a medicina regenerativa, como ddescoberta tapete, modelagem de doença e terapia celular em pacientes específicos ^1,2 maneira.

Até agora, existem vários métodos para gerar iPSCs humanos, incluindo mediada por vírus (retrovírus e adenovírus) ^3, non-vírus mediada (sistema BAC e vetores de transfecção) ⁴ transduções genes e proteínas do sistema de entrega ^5-7.

Embora a entrega de genes mediada por vírus pode garantir um certo nível de eficiência, vectores virais pode deixar pegada genética, porque eles se integram nos cromossomas do hospedeiro para expressar genes de reprogramação de uma maneira descontrolada. Mesmo quando a integração viral de fatores de transcrição podem ativar ou desativar genes do hospedeiro ^8, ele pode causar uma aberração genética inesperado eo risco de desenvolvimento de neoplasias ^5,9. Por outro lado, a introdução directa de proteínas ou RNA em células somáticas foram relatados, mas tem algumas desvantagens, tais como, transf repetido trabalho intensivoexão e baixo nível de reprogramação ^7,10. Mesmo epissómico e não integrante de adenovírus, de vírus adeno-associados, vectores de plasmídeo e ainda são relativamente menos eficiente ^11. Por estas razões, é plausível para escolher métodos de reprogramação não-integração com alta eficácia de geração iPSC e menos anormalidades genéticas. Neste estudo, utilizamos uma reprogramação baseado Sendai-vírus. Este método é conhecido como sendo não integrado no genoma do hospedeiro e produz consistentemente iPSCs humanos sem integração do transgene.

Protocolo

1. Preparação de celular e Mídia (Dia 1)

1. Cultura e expandir de fibroblastos humanos com meio DMEM contendo 10% de FBS.
2. Placa de fibroblastos humanos (Figura 1) para uma placa de 24 poços a uma densidade apropriada por poço no dia antes da transdução.
   NOTA: As seguintes diluições em série são recomendados (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K e 6.25K) porque diferentes tipos de células têm diferentes capacidade de fixação.
3. Incubar as células durante mais um dia em 37 ° C, 5% de _CO2, garantindo as células foram totalmente colada e estendida.

2. Execute Transdução (dia 2)

1. No dia da transdução, verificar a densidade celular e escolheu os poços de densidade mais eficientes (Figura 2). É melhor escolher três densidades diferentes: alta (80 ~ 90%), médio (50 ~ 70%) e baixa (20 ~ 40%).
2. Pelo menos 1 hora antes de transdução, aspirar o fibroblmeios de ast a partir das células e alterar novas 300 ul de meio de fibroblastos.
3. Remover um conjunto de quatro diferentes tubos de vírus Sendai da -80 ° C de armazenamento. Descongelar a cada tubo ao mesmo tempo em um banho de água a 37 C ° por alguns segundos e, em seguida, tomar os tubos fora do banho de água. Depois disso, o descongelamento à temperatura ambiente; tubos de centrifugação a 6.000 xg por 10 segundos e coloque-os em gelo até o uso. Não voltar a congelar e descongelar o vírus uma vez que os títulos não vai manter.
4. Adicionar os volumes indicados de cada um dos quatro tubos de vírus Sendai (Oct-4, Klf-4, c-Myc e Sox-2) para tubos de micro-centrífuga. Certifique-se de que a solução é bem misturada, pipetando cuidadosamente.
   Por exemplo, se 50K células / poço de uma placa de 24 poços para a transdução lookwell:
   (Titer base no Certificado de Análise da Life Technologies, pode ser diferente de um lote para outro)
   Tubo hOct-4 = 6,0 x 10 ⁷ OIC, 3 MOI = 5 mL
   Tubo hSox-2 = 6,5 x 10 ⁷ OIC, 3 MOI = 4,6 μ; L
   Tubo hKlf-4 = 6,3 x 10 ⁷ OIC, 3 MOI = 4,8 mL
   Tubo hc-Myc = 7,8 x 10 ⁷ OIC, 3 MOI = 3,8 mL
   Total = 18.2 ul de mistura de quatro factores de vírus / um poço (50K células) de placa de 24 poços
5. Dependendo densidades celulares; adicionar 2X, 1X, e volume de 0,5 X de a mistura de vírus no poço. Agitar suavemente a placa da frente para trás, esquerda e direita (2X: 36,4 mL de mistura de vírus, 1X: 18,2 ul e 0,5 X: 9,1 mL).
6. Colocar as células em 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora e incubar durante a noite.

3. Substituição de Meio de Cultura (dia 3 e dia 5)

1. 24 horas após a transdução, substituir o meio com 500 mL meio de fibroblastos fresco.
2. No dia 5, mudar Médio com a mídia de fibroblastos fresco.

4. Prepare MEF Pratos para o Co-cultura (dia 8)

1. Preparar células MEF em placas de cultura de 60 milímetros, com 10% de FBS continha um meio DMEM day antes passaging o fibroblasto transdução em células-alimentadoras MEF.
   Nota: Estamos usando 5 x 10 ⁵ de MEF em cada 60 milímetros prato.

5. Comecem a co-cultura com células transduzidas células alimentadoras MEF (dia 9)

1. Antes de cultivo de células transduzidas, aspirado 10% FBS contida meios DMEM de pratos alimentadoras MEF e adicione fresco 10% FBS continha meio DMEM.
2. Remover o meio a partir dos fibroblastos transduzidos que estão na placa de 24 poços e lavam as células uma vez com STP-D. Adicionar 200 mL de 0,25% tripsina / EDTA para as células de fibroblasto inthe placa de 24 poços. Depois de menos de 5 minutos de incubação com tripsina / EDTA, quando as células começam a separar a partir da placa, recolher as células com meio de crescimento no tubo de 15 ml. Em seguida, centrifugar-los em 6000 xg por 4 min.
   NOTA: O agrupamento 2X, 1X, 0.5X e vírus fibroblastos transduzidas é recomendado.
3. Remova o meio sobrenadante e lavar a re-suspensãoo aglomerado de células com 4-5 ml de meio fresco para a neutralização de fibroblastos a partir de tripsina. Em seguida, centrifugar-los em 135 g durante 4 min.
4. Células da placa como série de diluição de densidade e começam a co-cultura com os meios de fibroblastos para MEF: tal como 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 e 1/128 por 60 mm prato. Dependendo da taxa de morte celular durante a primeira semana de transdução, não ser necessário diluir a 1/2 ou 1/128 densidade. Pôr de lado as restantes células para extrair o RNA total como um controlo positivo para o transgene de RT-PCR.
5. Colocar placas de 60 mm em 37 ° C, 5% de _CO2 durante a noite.

6. Alimente embrionárias humanas Médio Stem Cell e monitorar o Cells (dia 10)

1. No dia seguinte, mudar de mídia para mídia ES fibroblastos humanos com 10 mM Y-27632. Depois disso, alterar médio diário com meio ES humano: 800 ml + 200 ml de DMEM/F12 KO substituição Serum + 10 ml de L-glutamina + 10 ml de MEM 10 mM de ácidos aminados mínimos não essenciais+ 1 ml de 2-mercaptoetanol + 10 ng / mL de Factor de Crescimento de Fibroblastos básico.
2. Fazer uma mudança de mídia diária com a mídia ES humanos frescos. Depois de uma semana, verifique os pratos uma vez por 2 a 3 dias sob um microscópio para a formação de aglomerados de células ES de colônia-like. Dependendo do tipo de célula, a cultura irá demorar mais ou menos tempo, antes colónias são encontrados.

7. Escolher o-tronco pluripotentes induzidas colônias de células e expandir as células (dia 20 ~)

1. Três semanas após a transdução, as colônias devem aparecer crescido adequadamente para a colheita.
2. Um dia antes de escolher as colônias, preparar alimentador MEF em placa de 24 poços.
   NOTA: Nós estamos usando 12,5 x 10 ⁵ de MEF em uma placa de 24 poços.
3. No dia seguinte, mudar médio de pratos MEF de mídia para mídia ES fibroblastos humanos com 10 mM Y-27632. Escolher manualmente uma colônia de cada vez sob o microscópio no picking-capa e fazer pedaços menores por pipetagem e transferi-lospara recém-preparado MEF dishes.Try escolher vários clones.
4. Passagem e expandir-se a cada poço de uma placa de 24 poços para uma placa de 6 bem inicialmente. Então, a partir de 6 bem-placa a um 60 milímetros pratos antes ainda de propagação.

8. Caracterização de iPSCs Humana (após 10 passagens)

1. Imunofluorescência
   1. Placa iPSCs humanos em placa de 24 poços e cultura durante 4-5 dias com mudança de mídia diária.
   2. Para iniciar ensaio de imunofluorescência, lavar a placa com D-PBS uma vez. Em seguida, fixar as células imediatamente em 0,4% de paraformaldeído durante 30 min. Depois disso lavar três vezes em D-PBS durante 5 min.
   3. Tratar as células fixas com 0,1% de Triton X-100 em PBS durante 15 min à temperatura ambiente.
   4. Aspirar a solução permeablization (0,1% de triton X-100 a solução), em seguida, adicionar uma solução de bloqueio de BSA a 0,5% durante 1 hora à temperatura ambiente.
   5. Executar uma detecção de Nanog, Oct-4, SSEA (específico do estágio embrionário antigbr) e TRA-1-81 (antigénio de rejeição de tumor) através de um anticorpo anti-humano em solução de BSA a 0,5% (veja a tabela de materiais para a taxa de diluição do anticorpo). Incubar Anticorpo primário durante 2 horas à temperatura ambiente. Em seguida, lavar três vezes em D-PBS durante 5 min cada.
   6. Verifique usando microscopia de fluorescência após 1 hora de incubação com 488 anticorpos IgG de cabra anti-rato Alexa Fluor como 2 ^nd anticorpo, que são diluídos 1:2000 em solução de BSA a 0,5% à temperatura ambiente. Mancha todos os núcleos de cada células alimentadoras MEF e hiPSCs com DAPI.
2. RT-PCR de Confirmação Transgene
   1. Extrair ARNm total de sedimento celular utilizando reagentes de extracção do ARN.
   2. Fazer uma transcrição reversa em alíquotas (1 jig) do ARN total e o cDNA resultante para a amplificação por PCR de transcriptase reversa.
   3. Preparar as misturas de PCR para conter 2 ul de molde de ADNc, 10 ul de 2X PCR master mix, 2 ul de 2 pmol de iniciadores(Para frente: 1 ml e inverter: 1 ml) e 6 mL de DW. Para detectar a expressão do gene, fazer a RT-PCR com os iniciadores listados na Tabela 1.
   4. Realizar a RT-PCR com o gene GAPDH como um controlo para a eficiência das reacções de amplificação. Visualizar e analisar o produto de PCR por electroforese em gel de agarose 1%.

Resultados

Normalmente fibroblastos infectados não apresentam quaisquer alterações morfológicas nos vários dias após a transdução de vírus Sendai, mas cinco dias depois, eles começam a ter formas diferentes (Figura 1). Conforme descrito em um painel direito da Figura 1, as células não têm morfologia de fibroblastos típico mais. Eles têm uma forma redonda e núcleo maior do que o citoplasma. Mesmo quando a transdução é realizada em 80% de confluência celular, parece que eles são menos confluentes no...

Discussão

Reprogramação de células somáticas humanas para hiPSCs detém promessas sem precedentes na biologia básica, medicina pessoal, e transplante ^12. Anteriormente, as gerações iPSC humanos necessários vírus de DNA que tem risco de integração no genoma do hospedeiro, que pode criar mutações genéticas indesejáveis ​​que limitam outras aplicações clínicas, tais como desenvolvimento de medicamentos e terapias de transplante ^13. Com esta razão, muitos estudos foram relatados para gerar sistema iPSCs humanos l...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de Reprogramação CytoTune-iPS	Invitrogen	A1378002
CF-6, MEFs, resistente à neomicina, tratado com mitomicina C	Haste global	GSC-6105M	5 x 105/6 cm ou 12,5 x 105/24 poços
Tripsina EDTA 0,25% Tripsina com EDTA 4Na 1X	Invitrogen	25200114
DMEM/F-12 médio	Invitrogen	11330-032
Placa de cultura de células de 24 poços, fundo plano com tampa	BD	353935
Y-27632	TOCRIS	1254	10 μ M (Estoque: 10 mM)
fator básico de crescimento de fibroblastos	LIFE TECHNOLOGIES	PHG0263	10 ng (Estoque: 100 ug)
Knock-out substituição de soro	Gibco	10828028
Dulbecco' s Meio de Águia Modificado (D-MEM, DMEM) (1X), líquido (glicose alta)	Invitrogen	11965118
Soro bovino fetal	Thermo Scientific Fermentas	SH30071.03
L-Glutamina-200 mM (100X), líquido	GIBCO	25030-081	1/100
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais, 100X	LIFE TECHNOLOGIES		1/100
2-Mercaptoetanol (1.000X), líquido	GIBCO	21985023	1/1.000
Hausser Hemacitômetros de contraste de fase	Hausser Scientific	02-671-54
EmbryoMax 0,1% Solução de gelatina	Millipore	ES-006-B
SSEA-4	DSHB	MC-813-70	1/200
anti-Tra-1-81	Sinalização celular	4745S	1/200
anticorpo Oct4 monoclonal de camundongo	Santa Cruz	SC-5279	1/1.000
Nanog	R& D	AF1997	1/1,000
Alexa Flouor 488 cabra anti-mouse	Invitrogen		948492 1/2,000
DPBS (Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato), 1X sem cálcio e magnésio	Cellgro	21-031-CV
QuantiTect Kit de Transcrição Reversa	QIAGEN	205313
PCR Master Mix [2X]	Thermo Scientific Fermentas	K0171
Trizol	Invitrogen	15596018
capuz de dissecação	NuAire	NU-301
	Nikon	SMZ745