Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus

Resumo

Aqui, apresentamos o nosso método estabelecido para reprogramar células somáticas humanas em iPSCs humanos sem transgene com o vírus Sendai, que mostra resultado consistente e maior eficiência.

Resumo

Há alguns anos, a criação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs humanos) marcou o início de uma nova era na área da biomedicina. Os usos potenciais de iPSCs humanos incluem modelagem patogênese de doenças genéticas humanas, a terapia celular autóloga após a correção do gene, e triagem de drogas personalizado, fornecendo uma fonte de células relevantes e sintomas específicos para cada paciente. No entanto, existem vários obstáculos a ultrapassar, tais como a eliminação da expressão do transgene factor de reprogramação remanescente após a produção iPSCs humanos. Mais importante ainda, a expressão do transgene residual em iPSCs humanos indiferenciadas poderia dificultar diferenciações adequadas e desencaminhar a interpretação em fenótipos vitro relevante doença. Com isso, iPSCs humanos sem transgene livre de integração e / ou que tenham sido desenvolvidos usando vários métodos, tais como adenovírus, o sistema piggyBac, minicírculo vetor, vetores epissomais, entrega direta e proteína sintetizada mRNA. No entanto, a eficiência de reprogramming usando métodos livre de integração é bastante baixo na maioria dos casos.

Aqui, apresentamos um método para isolar iPSCs humanos usando Sendai-vírus (vírus RNA) sistema de reprogramação base. Este método de reprogramação mostra resultados consistentes e de alta eficiência em termos de rentabilidade.

Introdução

Células estaminais embrionárias humanas (hESCs) têm a capacidade de se auto-renovar pluripotência in vitro e têm, o que poderia ser potencialmente útil para a modelagem de doenças, para a triagem de drogas e para desenvolver terapias baseadas em células para tratar lesões e doenças do tecido. No entanto, hESCs tem uma limitação para a terapia de reposição celular por causa de barreiras imunológicas, oncológicas e éticos, e estudar genes de doenças relacionadas, hESCs específicos da doença poderia ser isolado por meio de diagnóstico genético pré-implantação (PGD) se aproxima, mas ainda é tecnicamente desafiador e as doações de embriões são muito raros. Estes ....

Protocolo

1. Preparação de celular e Mídia (Dia 1)

1. Cultura e expandir de fibroblastos humanos com meio DMEM contendo 10% de FBS.
2. Placa de fibroblastos humanos (Figura 1) para uma placa de 24 poços a uma densidade apropriada por poço no dia antes da transdução.
   NOTA: As seguintes diluições em série são recomendados (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K e 6.25K) porque diferentes tipos de células têm diferentes capacidade de fixação.
3. Incubar as células durante mais um dia em 37 ° C, 5% de _CO2, garantindo as células foram totalmente colada e estendida.

2. Execute Transdução ....

Resultados

Normalmente fibroblastos infectados não apresentam quaisquer alterações morfológicas nos vários dias após a transdução de vírus Sendai, mas cinco dias depois, eles começam a ter formas diferentes (Figura 1). Conforme descrito em um painel direito da Figura 1, as células não têm morfologia de fibroblastos típico mais. Eles têm uma forma redonda e núcleo maior do que o citoplasma. Mesmo quando a transdução é realizada em 80% de confluência celular, parece que eles são menos confluentes no.......

Discussão

Reprogramação de células somáticas humanas para hiPSCs detém promessas sem precedentes na biologia básica, medicina pessoal, e transplante ^12. Anteriormente, as gerações iPSC humanos necessários vírus de DNA que tem risco de integração no genoma do hospedeiro, que pode criar mutações genéticas indesejáveis ​​que limitam outras aplicações clínicas, tais como desenvolvimento de medicamentos e terapias de transplante ^13. Com esta razão, muitos estudos foram relatados para gerar sistema iPSCs humanos l.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de Reprogramação CytoTune-iPS	Invitrogen	A1378002
CF-6, MEFs, resistente à neomicina, tratado com mitomicina C	Haste global	GSC-6105M	5 x 105/6 cm ou 12,5 x 105/24 poços
Tripsina EDTA 0,25% Tripsina com EDTA 4Na 1X	Invitrogen	25200114
DMEM/F-12 médio	Invitrogen	11330-032
Placa de cultura de células de 24 poços, fundo plano com tampa	BD	353935
Y-27632	TOCRIS	1254	10 μ M (Estoque: 10 mM)
fator básico de crescimento de fibroblastos	LIFE TECHNOLOGIES	PHG0263	10 ng (Estoque: 100 ug)
Knock-out substituição de soro	Gibco	10828028
Dulbecco' s Meio de Águia Modificado (D-MEM, DMEM) (1X), líquido (glicose alta)	Invitrogen	11965118
Soro bovino fetal	Thermo Scientific Fermentas	SH30071.03
L-Glutamina-200 mM (100X), líquido	GIBCO	25030-081	1/100
MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais, 100X	LIFE TECHNOLOGIES		1/100
2-Mercaptoetanol (1.000X), líquido	GIBCO	21985023	1/1.000
Hausser Hemacitômetros de contraste de fase	Hausser Scientific	02-671-54
EmbryoMax 0,1% Solução de gelatina	Millipore	ES-006-B
SSEA-4	DSHB	MC-813-70	1/200
anti-Tra-1-81	Sinalização celular	4745S	1/200
anticorpo Oct4 monoclonal de camundongo	Santa Cruz	SC-5279	1/1.000
Nanog	R& D	AF1997	1/1,000
Alexa Flouor 488 cabra anti-mouse	Invitrogen		948492 1/2,000
DPBS (Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato), 1X sem cálcio e magnésio	Cellgro	21-031-CV
QuantiTect Kit de Transcrição Reversa	QIAGEN	205313
PCR Master Mix [2X]	Thermo Scientific Fermentas	K0171
Trizol	Invitrogen	15596018
capuz de dissecação	NuAire	NU-301
	Nikon	SMZ745

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