Monitoramento de ativação do Padrão Antiviral Reconhecimento Receptores RIG-I e PKR por limitada Protease Digestão e PAGE nativo

Resumo

Defesas inata de infecções por vírus são acionados por receptores de reconhecimento de padrões (PRRs). Os dois PRRs citoplasmáticos RIG-I e PKR ligam para RNAs virais de assinatura, mudança de conformação, oligomerizar e ativar sinalização antiviral. São descritos métodos que permitem monitorizar convenientemente a comutação conformacional e a oligomerização destes PRRs citoplasmáticos.

Resumo

Defesas do hospedeiro à infecção do vírus são dependentes de uma rápida detecção pelos receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) do sistema imune inato. No citoplasma, PRRS RIG-I e PKR de ligação a ligandos específicos de RNA viral. Esta primeira medeia comutação conformacional e oligomerização, e, em seguida, permite a ativação de uma resposta interferon antiviral. Embora os métodos para medir a expressão do gene antiviral acolhimento estão bem estabelecidos, os métodos para monitorar diretamente os estados de ativação de RIG-I e PKR são apenas parcialmente e menos bem estabelecida.

Aqui, descrevemos dois métodos para monitorar estimulação RIG-I e PKR sobre a infecção com um indutor interferon estabelecido, o vírus da febre do Vale do Rift clone mutante 13 (Cl 13). Digestão de tripsina limitada permite analisar as alterações na sensibilidade da protease, indicando alterações de conformação de PRRS. Digestão de tripsina de lisados ​​de simulações de células infectadas resulta em uma rápida degradação da RIG-I e PKR, whereainfecção s Cl 13 leva ao surgimento de um RIG-I fragmento resistente à protease. Também PKR mostra uma resistência parcial induzida por vírus para a digestão com tripsina, o qual coincide com a sua fosforilação marca em Thr 446. A formação de RIG-I e oligómeros PKR foi validado por electroforese em gel de poliacrilamida nativo (PAGE). Após a infecção, há um forte acumulação de RIG-I e complexos oligoméricos PKR, que estas proteínas permaneceram como monómeros em amostras infectadas simuladas.

Digestão protease limitada e PAGE nativa, ambos acoplados a análise western blot, permitir uma medição sensível e direta de dois diferentes etapas do RIG-I e ativação PKR. Estas técnicas são relativamente fácil e rápido de executar e não requer equipamento caro.

Introdução

Um acontecimento importante na defesa do hospedeiro antiviral é a detecção rápida do agente patogénico pelos chamados receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) ^1,2. Detecção intracelular de infecção por vírus de ARN é dependente de dois helicases de ARN citoplasmáticos, RIG-I (ácido retinóico gene indutível I) e MDA5 (diferenciação associado a melanoma de proteína 5) ^3-5. RIG-I é composto por dois domínios N-terminais de recrutamento de caspase (cartões), um tipo de caixa de DECH-domínio RNA helicase central, e um domínio C-terminal (CTD) ^4,6. Considerando que a CTD eo domínio helicase são necessários para o reconhecimento da não-auto (virais) RNAs, os cartões mediar sinalização a jusante levando ao estabelecimento de um estado anfitrião antiviral.

Se RIG-I está no estado de silêncio, isto é, na ausência de um ligando de ARN específico, a segunda placa interage com o domínio da helicase central e mantém RIG-I numa conformação auto-inibidora ^7-11. RIG-I liga-se a curto duploARN de cadeia (ds) contendo um 5'-trifosfato (5'PPP), dsRNA longo, e RNA PolyU / UC-rico, estruturas clássicas de assinatura que estão presentes nos genomas de muitos vírus de ARN de ^12-16. Duas características principais de ativação RIG-I é uma mudança para uma conformação fechada ^6,17 eo homo-oligomerização ^6,18,19. A mudança conformacional aumenta a ligação do RNA, expõe os cartões para sinalização a jusante, e reconstitui um site ATPase ativa ^8,9,11,20. A formação de complexos oligoméricos RIG-I conduz a uma melhor recrutamento de moléculas adaptadoras de sinalização a jusante de modo a formar uma plataforma para a transdução de sinal antiviral ^11. A cadeia de sinalização RIG-I-regulada, eventualmente, ativa o fator de transcrição IRF-3 para o aumento da regulação do interferon (IFN-alpha/beta) genes e, portanto, a expressão gênica de genes interferon estimulada (ISGs) por uma resposta antiviral completo ^21,22 . Um dos ISGs melhor caracterizada é a protei activado ARNn quinase (PKR) ^23. PKR pertence à família do factor de iniciação da tradução eucariótica 2 alfa (eIF2α) quinases e é composta de um domínio de cadeia dupla de RNA de ligação N-terminal e um domínio de cinase de terminal-C. O domínio cinase constitui a interface de dimerização crucial para a activação PKR e realiza as funções catalíticas da proteína. A ligação de PKR para dsRNA viral leva à sua alteração conformacional que permite a dimerização e auto-fosforilação em Thr 446 entre outros resíduos. PKR então medeia fosforilação de eIF2α, bloqueando assim a tradução de mRNAs viral ^23-27.

Ambos RIG-I e PKR sofrer grandes rearranjos estruturais, formam complexos oligoméricas e são modificada após a tradução por fosforilação / desfosforilação e ubiquitination ^{10,11,19,23,24,26-29.} Para uma melhor compreensão do que as estruturas do RNA viral está ativando RIG-I e PKR (e em que estágio antagonistas virais poderia be interferindo), é importante para determinar com precisão o estado de activação. Para ambos os PRRs foi previamente descrito que a activação conduz ao aparecimento de fragmentos de proteína de tripsina-resistente ^6,17,30 e oligómeros de ordem superior ^6,18,19. No entanto, dada a riqueza da literatura sobre esses fatores-chave da resposta do hospedeiro antiviral ^1,2,24, a aplicação de métodos diretos parece comparativamente raros. Na esperança de estimular o uso mais amplo, nós fornecemos protocolos convenientes e sensíveis para analisar de forma robusta os estados de ativação de RIG-I e PKR. O IFN competente linha celular humana A549 está infectado com um ativador estabelecido de RIG-I e PKR, o atenuado vírus da febre do Vale do Rift clone mutante 13 (Cl 13) ^31,32. Depois de um procedimento de lise simples, os extratos de células infectadas são testados por tripsina digestão / western blot limitado para avaliar mudança conformacional, e pelo azul de eletroforese em gel de poliacrilamida nativa (PAGE) / analys Western bloté medir a formação de oligômeros.

Protocolo

1. Sementeira de Células A549 para a Infecção

1. Cultivar um frasco T75 de células A549 a 37 ° C e 5% de CO ₂ em meio de cultura celular (DMEM suplementado com FCS a 10%, 526,6 mg / l de L-glutamina, 50,000 U / l de penicilina, e 50 mg / l de estreptomicina).
2. Antes de iniciar a colheita das células, aquecer-se o meio de cultura de células, PBS e 0,05% de tripsina-EDTA em um banho de água aquecida a 37 ° C.
3. Remover o meio e lava-se as células com 10 ml de PBS. Remover o PBS novamente.
4. Adicionar 3 ml de tripsina-EDTA e distribuir igualmente no balão. Transferir o frasco em um incubador com 37 ° C e 5% de CO _2.
5. Quando todas as células são separadas, adicionar 7 ml de meio de cultura celular, ressuspender as células, e transferir a suspensão de células para um tubo Falcon de 15 ml.
6. Centrifugar as células a 800 xg durante 5 min à temperatura ambiente, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de meio de cultura de células fresco.
7. Contar as células com uma câmara de contagem.
8. Adicionar 2,5 x 10 ⁶ células em 5 ml de meio de cultura de células em frascos T25 dois cada. Incubar durante 16 horas a 37 ° C e 5% de CO _2. Um frasco serve para o controle de simulação e outro para infecção Cl 13.

2. Infecção com Vírus da Febre do Vale do Rift Clone 13 (Cl 13)

1. NOTA: Cl 13 é um mutante do vírus atenuado, que na Alemanha pode ser tratado sob condições de NBS-2. Por favor, consulte as diretrizes nacionais relevantes. Outros indutores de IFN típicas seria vírus Sendai (cepa Cantell) ou vírus da doença de Newcastle.
2. PBS, meio isento de soro pré-quente, e meio de cultura de células, contendo 5% de FCS.
3. Prepare a 1,25 x 10 ⁷ PFU / ml de Cl 13 em meio isento de soro, para infectar de 2,5 x 10 ⁶ células A549 com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5. Prepara-se uma quantidade ligeiramente (aproximadamente 10%) maior do que o necessário para ter em conta erros de pipeta.
4. Lavar as células com PBS, como descrito em 1.3.
5. Adicionar 1 ml da diluição 13 Cl oude meio isento de soro (controlo não infectado, simulada) para as células, e incuba-se durante 1 hora a 37 ° C e 5% de CO _2. Mova o frasco com cuidado a cada 15 minutos para garantir a igualdade de distribuição de Cl 13 diluição e meio livre de soro, respectivamente.
6. Após 1 hr de infecção, remover o inóculo, adicionam-se 5 ml de meio de cultura de células pré-aquecido com 5% de FCS, e incubar durante 5 horas a 37 ° C e 5% de CO _2.

3. Preparação de Lisados ​​celulares

1. Prepare PBS / 0,5% de Triton X-100 a 4 ° C. Não adicionar inibidores de protease serina.
2. Lavar as células com PBS frio e adicione 10 ml de PBS fresco.
3. Raspar as células fora e transferir a suspensão de células num tubo de Falcon, e centrifugar a 800 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
4. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 30 ul de PBS / 0,5% de Triton X-100. Transferir o lisado para um novo tubo de 1,5 ml e incubar durante pelo menos 10 min a 4 ° C.
5. Centrifugar o lisado às 10h000 xg durante 10 min a 4 ° C e transferir o lisado celular clarificado (sobrenadante) para um tubo fresco.
6. Determinar a concentração de proteína pelo ensaio de Bradford, tal como descrito noutro local ^33.
7. Armazenar a -20 ° C, ou prosseguir para a digestão de tripsina (4,1) ou PAGE nativa (5,1).

4. Determinação de alterações na conformação do Pattern Recognition Receptores

1. Tratamento de TPCK-tripsina de lisados ​​celulares
   1. Dilui-se L-1-tosylamido-2-fenil-etil-clorometil tratada cetona (TPCK) tripsina em PBS para uma concentração de trabalho final de 2 mg / mL.
   2. Ajustar em dois novos tubos de uma concentração final de proteína de 25 ug de proteína de cada ligado (simulada ou Cl 13) em um volume final de 9 mL com PBS. Por isso, deve ser de quatro tubos com 25 mcg lisado cada, duas vezes simulados e duas vezes Cl infecção 13. Uma definido como controle de entrada (sem tratamento) e um conjunto para o tratamento com TPCK-tripsina.
   3. Adicionar 1 ml de PBS (sem tratamento)ou 1 ul de 2 mg / mL de TPCK-tripsina (concentração final: 0,2 mg / mL) para os lisados ​​de células e misturar as reacções por pipetagem. NÃO congelar e descongelar alíquotas TPCK-tripsina, porque vai comprometer a eficiência da digestão.
   4. Incubar os lisados ​​a 37 ° C durante 25 min. Parar a reacção por adição de 5x tampão de desnaturação da amostra (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 50% glicerol, 25% β-mercaptoetanol, 0,5% de azul de bromofenol) e por ebulição durante 5 min a 95 ° C. É importante para não aumentar o tempo de incubação com tripsina. No caso de não haver fragmentos resistentes à protease são detectáveis, o tempo de digestão de tripsina deve ser encurtado.
   5. Depois de ferver, as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C.
2. SDS poliacrilamida Eletroforese em Gel (PAGE) e Western Blotting
   1. Coloque as amostras em um dodecil sulfato de sódio (SDS) em gel de poliacrilamida contendo um empilhamento de 5% ao longo de um gel de resolução de 12%. Separam-se as proteínas a 25 mA por gel atéo azul de bromofenol se esgote.
   2. Ative uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) por 30 segundos com metanol e colocá-lo em tampão de transferência (Tris 48 mM, glicina 39 mM, SDS 1,3 mM, 20% de metanol).
   3. Prepare o blotting com um sistema de mancha semi-seco e permitir a transferência das proteínas a 10 V durante 1 hora. Tome a membrana para fora, lave-o rapidamente com água e deixe secar.
   4. Reativar a membrana por pouco transferindo para o metanol. Lavar durante 5 minutos com TBS. Bloco com 10% de leite desnatado em TBS durante 1 hora à temperatura ambiente ou a 4 ° CO / N. Lava-se a membrana 3 vezes durante 5 minutos cada com TBS.
   5. Prepare a diluição de anticorpo, tal como recomendado na tabela 1 e incubar a membrana durante 1 hora à temperatura ambiente ou a 4 ° CO / N.
   6. Lava-se a membrana 3 vezes durante 10 minutos cada com TBS-T. Adicionar o anticorpo secundário adequado, juntamente com peroxidase de rábano, a uma diluição de 1:20000 em 1% de leite desnatado em TBS. Incubar 45 min a RT.
   7. Lava-se a membrana 3 vezes durante 10 minutos cada com TBS-T, e otempo adicional ne com TBS.
   8. Para a detecção do sinal usar um kit de quimioluminescência comercial e de um sistema de imagem gel digital.
3. Coomassie Brilliant Blue G-Coloração 250
   1. Realize SDS-PAGE como descrito no ponto 4.2.1. Carregar as amostras em um gel de poliacrilamida SDS e executar o gel a 25 mA por gel até bromofenol azul esgote.
   2. Realizar Comassie coloração azul L-250 à temperatura ambiente. Faça todas as incubações sob agitação constante.
   3. Transferir o gel para a solução de fixação contendo 40% de metanol e 10% ácido acético durante 30 min.
   4. Trocar o tampão de solução de descoloração (25% de etanol e ácido acético a 8%) e incubar durante 5 min.
   5. Corar o gel com 0,2% de Coomassie Brillant Blue G-250 em 40% de metanol e 10% ácido acético durante 1 hora.
   6. Destain o gel com a solução de descoloração e trocar o tampão depois de 10 min, 30 min e 60 min.
   7. Armazenar o gel em 25% de etanol, ácido acético a 8%, e 4% de glicerol, a 4 ° C.
   8. Realizar imagem e análise, como descrito em 4.2.8.

5. Análise de Oligomeric Unidos da Pattern Recognition Receptores

1. PAGE nativo
   1. Preparar 50 ug de lisado de células, num volume final de 10 ul com tampão de PBS e adicionar 5 × nativa amostra (250 mM Tris-HCl pH 6,8, desoxicolato de sódio a 1%, 50% de glicerol, 0,5% de azul de bromofenol) para uma concentração final de 1x.
   2. Coloque as amostras imediatamente sobre um gel de poliacrilamida nativa, com 5% de empilhamento e 8% como resolver gel. Qualquer atraso irá resultar numa perda de ³⁴ complexos nativos.
   3. Submeter o gel a 20 mA por gel a 4 ° C com 50 mM de Tris-NaOH pH 9,0, 384 mM de glicina como como ânodo e 50 mM Tris pH 8,3, glicina 384 mM, 1% de desoxicolato de sódio, como tampão de cátodo. Após 1,5-2 h (azul de bromofenol banda deixou o gel cerca de 45 min antes) a eletroforese é concluída.
2. Western Blotting
   1. Activar um polyvinylidene fluoreto (PVDF) de membrana durante 30 segundos com metanol e colocá-la em tampão Towbin (25 mM Tris, 192 mM glicina, 0,1% de SDS, 20% metanol).
   2. Montar uma câmara mancha húmida de acordo com as instruções do fabricante e encher o tanque com tampão Towin.
   3. Realizar o blotting com 250 mA durante 1,5 horas a 4 ° C.
   4. Ao borrar está terminado proceda conforme descrito a partir de 4.2.3 diante.

Resultados

O reconhecimento de um agonista viral por RIG-I ou PKR desencadeia mudança conformacional ^6,17,30 e oligomerização ^6,18,27. Analisamos estes dois marcadores de activação por digestão com protease limitado e electroforese em gel de poliacrilamida nativo (PAGE), respectivamente.

As células A549 humanas infectadas com o clone de vírus da febre do vale do Rift 13 (Cl 13), que é caracterizada por uma mutação do antagonista de IFN NSS ^35,36. Devido à ausência de NS...

Discussão

Sentindo a presença de vírus e ativação do tipo I IFN antiviral sistema são cruciais para a resposta imune inata de sucesso ^22. A detecção de vírus é assim mediada por receptores de reconhecimento de patógenos (PRRs) como RIG-I e PKR, permitindo uma resposta rápida e ativação de mecanismos de defesa anti-virais. Aqui, descrevemos dois métodos para avaliar diretamente o status de ativação de RIG-I e PKR.

Digestão protease limitada como uma ferramenta para monitorar as mudanças conf...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cultura de células
Dulbecco' s Águia modificada' s medium (DMEM)	Gibco	21969-035
OptiMEM	Gibco	31985-47
L-glutamina	PAA	25030-024
Penicilina-estreptomicina	PAA	15070-063
Soro fetal de bezerro (FCS)	PAA	10270
0,05% Tripsina-EDTA	Gibco	25300-054
Chemicals
L-1-tosylamido-2-feniletil clorometilcetona tratada com tripsina (TPCK)	Sigma Aldrich	T1426
Anticorpos
Camundongo monoclonal anticorpo anti-RIG-I (ALME-1)	Enzo Life Sciences	ALX-804-849-C100	WB: 1:500 em 1% de leite desnatado em camundongo TBS
anti-PKR monoclonal (B10)	Santa Cruz	sc-6282	WB: 1:500 em leite desnatado a 1% em TBS
Coelho monoclonal anti-P-PKR (Thr446)	Epitomics	1120-1	WB: 1:1.000 em 5% BSA em TBS
Coelho policlonal anti-IRF-3	Santa Cruz	sc-9082	WB: 1:500 em leite desnatado a 1% em TBS
Coelho monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386)	IBL	og-413	WB: 1:100 em leite desnatado a 1% em TBS
Soro hiperimune anti-RVFV de coelho "C2" (MP-12)	Gentilmente cedido por Alejandro Brun CISA-INIA		WB: 1:2.000 em leite desnatado a 1% em TBS
Anti-beta-actina monoclonal de camundongo (8H10D10)	Sinalização celular	3700	WB: 1:1.000 em leite desnatado a 1% em TBS
Anti-coelho de cabra conjugado com peroxidase policlonal	Thermo Fisher	0031460 1892914	WB: 1:20.000 em leite desnatado a 1% em TBS
Cabra conjugada com peroxidase policlonal anti-camundongo	Thermo Fisher	0031430 1892913	WB: 1:20.000 em leite desnatado a 1% em TBS