O nosso relatório descreve um método único para visualizar e analisar as interações CTC / CE no câncer de próstata em condições de fluxo fisiológicos.
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Artigo de método
Método in vitro para observar interações E-selectina mediadas entre próstata células tumorais circulantes derivadas de pacientes e células endoteliais humanas
Neste artigo
Resumo
Resumo
A metástase é um processo em que as células tumorais derramado a partir do tumor primário intravasate vascular arterial e do sistema linfático, assim, ganhar acesso ao extravasamento e formar um nicho secundário. A extravasão de células de tumor a partir do sistema vascular de sangue podem ser estudados utilizando células endoteliais (ECs) e as células tumorais obtidas a partir de diferentes linhas celulares. Os estudos iniciais foram realizados usando condições estáticas, mas tem sido bem documentado que os CEs se comportar de forma diferente sob condições de fluxo fisiológico. Portanto, diferentes conjuntos de câmara de fluxo estão sendo usados para estudar as interações de células de câncer com ECs. Montagens atuais câmara de fluxo oferecem resultados reproduzíveis, seja através de diferentes linhagens celulares ou fluidos em diferentes condições de estresse de cisalhamento. No entanto, para observar e estudar as interações com células raras, tais como células tumorais (CTCs) circulando, algumas alterações são necessárias a serem feitas para a montagem de câmara de fluxo convencional. CTCssão uma população de células raras entre os milhões de células sanguíneas. Por conseguinte, é difícil a obtenção de uma população pura do CTC. Contaminação de CTCs com diferentes tipos de células normalmente encontradas na circulação é inevitável o uso presente enriquecimento ou técnicas de depleção. No presente relatório, nós descrevemos um método único para rótulo circulando células cancerosas da próstata fluorescente e estudar as suas interacções com os ECs em um sistema de câmara de fluxo auto-montados. Esta técnica pode ser aplicada ainda para observar as interações entre CTCs próstata e qualquer proteína de interesse.
Introdução
A metástase é um processo multi-passo complexo que permanece pouco compreendido. O eixo ligando E-selectin/selectin tem mostrado desempenhar um papel importante na metástase de tumores através da promoção de interacções adesivas primárias entre o endotélio vascular e nas células cancerosas 1,2. Endotelial (E)-selectina é uma proteína transmembranar expressa por células endoteliais activadas, enquanto ligando diferente (s) de E-selectina é expressa por células de tumor 3. Numerosas abordagens in vitro têm sido utilizados com sucesso para modelar as interacções ligando E-selectin/selectin entre células tumorais e células endoteliais (ECs)....
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Protocolo
1. Cultivar HUVECs em Microslides para Interações Observing CTC-endoteliais
- Sob a capa de cultura de tecidos, primeiro lave o MicroSlide, a largura do canal de 1 mm com PBS. Suavemente revestimento a microlâmina com 200 mL de 50 ug / ml de fibronectina (dissolvida em PBS) utilizando uma seringa de 1 ml de bloqueio Luer.
- Cobrir a microlâmina com a tampa e mantê-lo dentro do capuz de cultura de tecidos durante 30 min. Distribuição lenta do líquido na microlâmina impede a formação de bolhas no canal.
- Perfundir 200 mL de água morna (37 ° C) HUVEC meio de crescimento (meio M199, 1M de HEPES, 20% FBS, 5 mg / ml de heparina, factor de crescime....
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Resultados
A Figura 1 mostra uma cultura D / N de uma monocamada de células endoteliais na microlâmina. Os extrapolação da Figura 1A mostra que 100% da microlâmina é visível usando objectivo 5X, enquanto 70% é visível usando uma objectiva de 10X (Figura 1B). Para o E-selectina interacções mediadas, as células que rolam nas bordas não são considerados o que torna mais do que 70% da microlâmina disponível para gravação de vídeo e análise de reprodução. Em nossa experiência, inicialm.......
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Discussão
Devido ao baixo número de CTCs entre as células do sangue, é difícil isolar CTCs como uma população pura de células. Para estudar interações CTC / CE, a população rara e impura de CTCs coloca dois desafios principais: a) Identificação de CTCs entre as células do sangue; b) Observação de interações CTC / CE.
Para superar a primeira limitação de identificar CTCs próstata entre as células do sangue, aproveitamos o fato de que praticamente todas as células tumorais da.......
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Divulgações
Dr. Bander é o inventor de patentes que são atribuídos a Fundação de Pesquisa de Cornell ("CRF") para o anticorpo J591 utilizado neste artigo. Dr. Bander é consultor e possui ações em BZL Biologics, a empresa para a qual as patentes foram licenciadas pelo CRF para novas pesquisas e desenvolvimento.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por financiamento do Departamento de Defesa, da próstata Cancer Research Program (W81XWH-12-1-0124), U54CA143876 do Instituto Nacional do Câncer, ea McCooey geniturinário Fundo de Investigação Oncológica Robert. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Annarita Lorenzo (Departamento de Patologia) para a prestação de anticorpos VE-caderina, e Dr. Marco Seandel (Departamento de Cirurgia) para a prestação de HUVECs.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Microslide | Ibidi | 80331 | |
| Fibronectina | Millipore | FC010 | |
| Tubo de plástico | Cole Parmer | EW-96115-08 | |
| Adaptador Luer masculino | GlycoTech | 31-001 | |
| Adaptador Luer feminino | GlycoTech | 31-001 | |
| Bomba de seringa | Chemyx Inc | Fusion 100 | |
| Seringa Luer-lock | BD Biosciences | 309628 | |
| M199 médio | Sigma | M7653 | |
| Endotelial Mitogen | Biomedical Technologies | BT-203 | |
| HBSS | Sigma | H9269 | |
| Anti-PSMA J591-488 | Weill Cornell Medical College-Laboratório de Oncologia | ||
| Interleucina-1 beta | Peprotech | 200-01B | |
| Tripsina | Millipore | SM-2002-C | |
| Heparina | Sigma | H-3149 | |
| HUVECs | Weill Cornell Medical College-Departamento de Cirurgia | fornecido por Marco Seandel | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-5648 | |
| 10x objetiva | Zeiss Plan Neofluar | ||
| Reagente de dissociação de células livres de enzimas | Millipore | S-004-C | |
| RPMI-1640 | Lonza | 12-702-F | |
| Ficoll-paque mais | GE healthcare | 17-1440-02 |
Referências
- Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
- Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J.
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Reimpressões e permissões
