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Medindo Spinal pré-sináptica Inibição em Ratos por raiz dorsal Gravação Potencial

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DOI:

10.3791/51473

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29 de março de 2014

 , 
1Hans Berger Department of Neurology, Jena University Hospital, Jena, Germany, 2Integrated Research and Treatment Center, Center for Sepsis Control and Care (CSCC), Jena University Hospital, Jena, Germany

Neste artigo

Resumo

GABAérgica inibição pré-sináptica é um poderoso mecanismo de inibição na espinal medula importante para o motor e a integração do sinal sensorial em redes da medula espinal. Subjacente despolarização aferente primário pode ser medido por registo dos potenciais de raiz dorsal (DRP). Aqui demonstramos um método in vivo de gravação de DRP em ratinhos.

Resumo

A inibição pré-sináptica é um dos mais poderosos mecanismos de inibição na espinal medula. O mecanismo fisiológico subjacente é uma despolarização das fibras aferentes primários mediadas por GABAergic sinapses axo-axonal (despolarização aferente primário). A força de despolarização aferente primário pode ser medido por registo dos potenciais conduzida de volume na raiz dorsal (potenciais de raiz dorsal, DRP). As alterações patológicas de inibição pré-sináptica são cruciais para o processamento central anormal de determinadas condições de dor e em alguns transtornos de hiperexcitabilidade motor. Aqui, descrevemos um método de gravação DRP in vivo em camundongos. A preparação das raízes dorsais da medula espinhal do animal anestesiado eo procedimento de gravação usando eletrodos de sucção são explicados. Este método permite medir GABAergic DRP e, assim, estimar a inibição pré-sináptica da medula em ratos vivos. Em combinação com os modelos de camundongos transgênicos, a gravação DRP pode serve como uma ferramenta poderosa para investigar associada à doença da coluna vertebral fisiopatologia. In vivo gravação tem várias vantagens em relação ao ex vivo preparações medulares isoladas, por exemplo, a possibilidade de gravação ou manipulação de redes supra-e indução de DRP por estimulação de nervos periféricos simultâneos.

Introdução

A inibição pré-sináptica é um dos mais poderosos mecanismos de inibição na espinal medula. Inibe potenciais pós-sinápticos excitatórios (EPSPS) em motoneurónios monosynaptically excitado sem alterar o potencial da membrana pós-sináptica e a excitabilidade de neurónios motores 1-3. Despolarização aferente primário (PAD) induzida por GABAergic sinapses axo-axonal em fibras pré-sinápticas sensoriais é o mecanismo subjacente 4-7 (ver também Figura 1A). Essas sinapses contêm GABA A e GABA-B (receptores GABA A e GABA B R R). A actividade do GABA R conduz a um aumento da condutância de cloreto que provoca PAD, devido à distribuição de iões local. Esta despolarização bloqueia a propagação dos potenciais de ação nos terminais do axônio e reduz a sua força levando a uma diminuição da Ca 2 +-influxo e uma redução da liberação do transmissor. A ativação dos receptores GABA B não fazt contribuir para PAD, mas leva a uma redução de Ca 2 +-influxo reforçando assim a inibição pré-sináptica. Enquanto a activação de receptores GABA A R parece estar envolvido na inibição de curto prazo, o GABA B R estão envolvidos na modulação de longo prazo de 8-10. Além de GABA, que representa a maior parte do PAD e inibição pré-sináptica, outros sistemas transmissores também pode modular e contribuir para este mecanismo 11,12.

As alterações patológicas na inibição pré-sináptica parece ser crucial em vários estados de doença, por exemplo, inflamação e dor neuropática periférica 13,14, bem como anormal processamento da dor central 15, lesão medular 16, e doença do SNC com hiperexcitabilidade motora mediada pela transmissão gabaérgica defeituoso 17, 18. Assim, a estimativa inibição pré-sináptica a pena investigar patologias experimentais no nível da medula espinhal in vivo . PAD dá origem a volumes conduzidos potenciais fornecem uma medida directa da inibição pré-sináptica na medula espinal. Esses potenciais são chamados potenciais de raiz dorsal (DRP) e pode ser medido a partir de raízes dorsal da coluna vertebral após a estimulação das raízes dorsais adjacentes 7.

As primeiras medidas de DRP foram relatados em gatos e sapos 19 e foram intensamente estudado em gatos por Eccles, Schmidt, e outros no início dos anos 1970 3,4,20,21. Enquanto in vivo gravações de DRP em gatos 22 e 23 ratos foram amplamente usadas, as medidas em ratinhos foram realizados quase exclusivamente em preparações isoladas ex vivo da medula espinhal 15,24. Aqui, descrevemos um método para gravar DRP em ratos anestesiados in vivo, permitindo uma medida direta da inibição pré-sináptica no organismo intacto.

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Protocolo

Todos os procedimentos experimentais mencionados no seguinte protocolo foi aprovado pelas autoridades do estado da Turíngia (Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Reg.-Nr. 02-044/12).

1. Preparativos para Experiment

  1. Fabricação de eletrodos de sucção
    1. Puxe uma micropipeta usando um capilar de vidro de borosilicato de fábrica com um puxador de micropipeta, por exemplo, um eletrodo de patch padrão.
    2. Freio o eletrodo de ponta diâmetro de 0,5-1 mm (um pouco maior do que o diâmetro das raízes dorsais), usando um arquivo de diamante.
    3. Polonês de calor na ponta para que ele não irá prejudicar a raiz dorsal quando ele é sugado dentro Uma tocha do laboratório padrão será adequado.
    4. Montar o filamento de vidro sobre um suporte de eléctrodo ligada a uma seringa por meio do qual a pressão negativa pode ser aplicada.
  2. Preparação de soluções
    1. Injeção de anestesia para ratos: Misturar 0,75 ml de cetamina 10%, 0,24 ml de xilazina 2% aond 5 ml 0,9% de soro fisiológico. 10 mL / g de peso corporal (BW) da solução será injectado por via intraperitoneal (ip).
    2. Fluido cerebroespinal artificial (ACSF): Dilui-se em água destilada duas vezes os seguintes sais (em mM): NaCl 134; KCl 3, KH 2 PO 4 1,25; MgSO4 • H 2 O 2, NaHCO3 25, CaCl2 2, D- glicose 10. Adicionar H 2 O 2 a uma concentração final de 0,003%. Use solução sempre preparados na hora.
  3. Preparação de a configuração de gravação (Figura 2)
    1. Ligue o amplificador a uma interface de PC para a digitalização de dados.
    2. Use um programa baseado em PC ou um temporizador analógico para acionar um estimulador de pulso quadrado e aquisição de dados no disco rígido do PC.
    3. Use silverwires clorada conectados à porta eletrodos de vidro padrão como para a estimulação e gravação.
    4. Montar três manipuladores de estimulação, gravação e eletrodo de referência, respectivamente, em torno de um stereQuadro otactic para ratinhos, de modo a que todos os eléctrodos de ter acesso à medula espinal preparada posteriormente.
    5. Conecte tubulações e seringas para os detentores de eletrodo a ser maçã para aplicar pressão negativa.

2. Comentários Gerais para Experimentação Animal e Preparação Animal para Procedimento de gravação

  1. Realizar todos os experimentos com ratos de acordo com as diretrizes da respectiva comissão cuidados com os animais institucional e uso. Realize todas as cirurgias e gravações sob anestesia profunda, garantindo que o sofrimento animal é minimizado.
  2. Anestesiar os animais por injecção ip de cetamina / xilazina (125 mg e 8 mg por g de peso corporal de cetamina e xilazina, respectivamente, 10 mL / g de peso corporal de solução preparada como descrito acima). Se necessário durante as gravações de longo prazo, injeções adicionais podem ser feitas ip ou im
    Nota: im injecções repetitivas de 0,05-0,1 ml de solução de cetamina / xilazina na parte superior das coxas têm provado ser adequadospara manter o animal durante a anestesia profunda durante até 3 horas.
  3. Use veterinário pomada nos olhos para evitar a secura sob anestesia.
  4. Fixe a cabeça do animal em um quadro estereotáxico e usar uma almofada de aquecimento com sonda retal e loop reflexo para controlar a temperatura do corpo do animal durante o experimento. A fixação da medula espinhal em uma estrutura estereotáxica não é necessário.
  5. Antes de iniciar a preparação, verifique a profundidade da narcose por reflexo piscar de olhos e se contorcendo entre os dedos dos ratos. Reflexos deve ser abolido.
  6. Abra a pele ao longo da linha mediana da medula espinal acima do nível superior do tórax para diminuir áreas lombares para obter um campo operacional claro usando um bisturi. Não use a tesoura para fazer incisões na pele. Afrouxar cuidadosamente a pele do tecido subjacente. Durante as etapas subsequentes de manter a ferida humedecidos em 0,9% de solução salina.
  7. Corte tendões e tecido conjuntivo em ambos os lados das vértebras da lombar para os níveis torácicos usando bisturi e tesoura.
  8. Remover os processos espinhosos e resto de tecido conjuntivo em torno das vértebras com uma pequena pinça.
  9. Cuidadosamente quebrar vértebras com a pinça a partir de níveis lombares (L4/L5) sob um microscópio de dissecação. Enfiar a ponta da pinça, no espaço entre as vértebras e a medula espinal e levantar pedaços de osso distante. Não danificar a dura-máter e evitar a pressão para a medula espinhal. Ambos são críticos para o sucesso. Manter a medula espinhal humedecido durante todo o procedimento. Prossiga para níveis de meados de tórax.

3. A separação de raízes dorsais e DRP Gravação (Figura 2)

  1. Abra a dura-máter com cuidado usando uma agulha fina (30 g) com uma ponta dobrada. Use aCSF para umedecer a partir de agora.
  2. Separa-se as raízes dorsais, tanto quanto possível, utilizando o medidor e cortar duas raízes adjacentes como distal possível. Vigorosa puxando as raízes durante a separação afecta o sucesso da experiência.
  3. Abaixe o eletrodo de sucção para baixo para o fazerRsal raízes. Adicionar tanto ACSF para a medula espinhal possível porque o líquido auxilia a chupar nas raízes dorsais.
  4. Chupar a extremidade cortada de uma raiz dorsal em uma pipetas de vidro pela aplicação de pressão negativa por meio de uma seringa. Se necessário, passar da raiz dorsal, em frente da abertura do eléctrodo utilizando uma agulha fina.
  5. Se a raiz dorsal fica seco no interior do eletrodo de sucção, adicione um pouco aCSF a sua ponta, enquanto cuidadosamente sugando até que a pipeta está suficientemente preenchido com aCSF.
  6. Depois da raiz dorsal é sugado, levantar a ponta do eletrodo a partir da medula espinhal. Tome cuidado para que não "ponte de água" entre a ponteira ea medula espinhal de curto-circuito do eletrodo de gravação / estimulação.
  7. Repita os passos de 3,3-3,6 para uma raiz adjacente ipsilateral.
  8. Posicione o eletrodo de referência mais próximo possível às raízes dorsais e mantê-lo úmido, aplicando aCSF.
  9. Ao estabelecer a configuração de gravação, uma raiz já está escolhido para a estimulação, ooutra para gravação. O aumento gradual da tensão durante a gravação da segunda raiz dorsal é feito no modo braçadeira atual. Pode-se notar uma deflexão para baixo curto, que é seguido por um, de longa duração deflexão ascendente lento representando o DRP.
  10. Ajuste a tensão de estímulo à supramáximos níveis e gravar várias varreduras (pelo menos 20 - 30 varreduras / raiz dorsal de 0,1 Hz, filtro entre 0,3 Hz-3 kHz).
  11. Grave comboios curtos de três estímulos (100 Hz) para obter informações sobre o somatório tempo-dependente do DRP.
  12. Mudar de gravação e local de estimulação para gravações contralateral adicionais.
  13. Os animais não têm a intenção de sobreviver ao processo. Sacrificar animais após a última gravação por decapitação, ainda sob anestesia profunda (cetamina / xilazina, veja acima, o passo 2.2).

4. Análise de Dados

  1. Transferência de dados para programa de análise (por exemplo, Sigma Plot, Igor Pro, ou MATLAB).
  2. Calcular média traços from 20-30 varreduras.
  3. Leve a amplitude máxima de deformação da tensão (a partir da linha de base; DRP amplitude do pico), para posterior análise (Figura 3).
  4. Calcula-se a razão entre a amplitude de pico de DRP após três pulsos e pulso único para obter uma medida do tempo de soma dependente de potenciais subsequentes.

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Resultados

Vestígios de DRP típicos são mostrados na Figura 3. O destaque artefato estimulação é geralmente seguido por uma deflexão para baixo curto. Posteriormente um, de longa duração deflexão ascendente lento, representando o DRP é claramente distinguíveis. Num subgrupo de gravações, reflexos de raiz dorsal são visíveis como pequenos picos no topo da DRP. Em camundongos normais do tipo selvagem, os reflexos da raiz dorsal aparecem mais frequentemente quando a tensão estimulação excessiva. Como os reflexos da r...

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Discussão

Registros eletrofisiológicos extra e intracelulares de atividade neuronal e potenciais sinápticos in vivo são o estado da arte das técnicas de investigação de funções neuronais do sistema nervoso central e fisiopatologia. Spinal integração é fundamental para o funcionamento do motor, por exemplo, os movimentos dos membros e para a percepção sensorial multimodal. Inibição pré-sináptica é um mecanismo fundamental neste processo computacional garantindo respostas adequadas aos estímulos sensoriais. Sinaps...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos Manfred Heckmann para discussões úteis durante o estabelecimento do método. Além disso, agradecemos a Claudia Sommer para assistência técnica e Frank Schubert para o apoio a produção do vídeo. O trabalho foi apoiado pelo Ministério Federal da Educação e Pesquisa (BMBF), na Alemanha, FKZ: 01EO1002 e do Centro Interdisciplinar de Pesquisa Clínica (IZKF) do Hospital Universitário de Jena.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de vidro (diâmetro interno 1,16 mm)Science Products (Hofheim, Alemanha)GB200F-10Outros tubos de vidro também podem ser adequados
Solução de superfusão (estéril, 0,9% NaCl)Braun Melsungen AG3570350
Rompun 2% (Xilazina)Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Alemanha)
Cetamina 10%Medistar GmbH (Ascheberg, Alemanha)KETAMIN 10%
30 G Microneedle/ StericanBraun Melsungen AG4656300
Sais para aCSFSigma-AldrichDiverse
S88 Dual Output Square PulseGrass Technologies (Warwick, EUA)S88X
SIU5 RF Transformer IsolationUnit Grass Technologies (Warwick, EUA)SIU-V
InstruTECH LIH 8+8HEKA ( Lambrecht, Deutschland)LIH 8+8 + software Patchmaster Amplificador
universalNPI (Tamm, Deutschland)ELC-03X
Extrator de micropipetasSutter Instruments (Novato, EUA)P-1000
Microscópio de dissecaçãoOlympus (Tóquio, Japão)
MicromanipuladorSutter Instruments (Novato, EUA)MPC-200/MPC-325Micromanipuladores mecânicos também são possíveis
Sistema de Manta HomeotérmicaStoelting (Wood Dale, EUA)50300V
Suporte de eletrodo de gravação intra/extracelularHarvard Apparatus (Holliston, EUA)641227

Referências

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