Summary
Inhibición presináptica GABAérgicas es un poderoso mecanismo inhibitorio en la médula espinal importante para el motor y la integración de la señal sensorial en las redes de la médula espinal. Subyacente despolarización aferente primaria se puede medir mediante el registro de los potenciales de la raíz dorsal (DRP). Aquí se demuestra un método de grabación en vivo de DRP en ratones.
Abstract
La inhibición presináptica es uno de los más poderosos mecanismos inhibitorios en la médula espinal. El mecanismo fisiológico subyacente es una despolarización de las fibras aferentes primarias mediada por sinapsis GABAérgicas axo-axonales (despolarización aferente primaria). La fuerza de la despolarización aferente primaria se puede medir mediante el registro de los potenciales de volumen-llevado a cabo en la raíz dorsal (potenciales de la raíz dorsal, DRP). Los cambios patológicos de la inhibición presináptica son cruciales en la central de procesamiento anormal de ciertas condiciones de dolor y, en algunos trastornos de la hiperexcitabilidad del motor. Aquí se describe un método de DRP grabación en vivo en ratones. Se explica la preparación de las raíces dorsales de la médula espinal en el animal anestesiado y el procedimiento de registro con electrodos de succión. Este método permite medir GABAérgica DRP y por lo tanto la estimación de la inhibición presináptica de la médula en el ratón vivo. En combinación con modelos de ratones transgénicos, la grabación puede DRP sírve como una herramienta poderosa para investigar la enfermedad asociada a la columna vertebral fisiopatología. In vivo la grabación tiene varias ventajas en comparación con las preparaciones in vivo de médula espinal aisladas ex, por ejemplo, la posibilidad de grabar o la manipulación de las redes supraespinales y la inducción de DRP por la estimulación de los nervios periféricos simultánea.
Introduction
La inhibición presináptica es uno de los más poderosos mecanismos inhibitorios en la médula espinal. Inhibe los potenciales postsinápticos excitatorios (EPSPS) en motoneuronas monosinápticamente excitados sin cambiar el potencial de la membrana postsináptica y la excitabilidad de las motoneuronas 1-3. Despolarización aferente primaria (EAP) inducida por la sinapsis GABAérgicas axo-axonal presináptica sobre las fibras sensoriales es el mecanismo subyacente 4-7 (véase también Figure1a). Estas sinapsis contienen GABA A y GABA-B (receptores GABA A y GABA B R R). La actividad de GABA A R conduce a un aumento en la conductancia de cloruro que provoca PAD debido a la distribución de iones local. Esta despolarización bloques de la propagación de potenciales de acción en los terminales de los axones y reduce su fuerza que conduce a una disminución de Ca 2 +-afluencia y la reducción de la liberación del transmisor. La activación de los receptores GABA B no hacet contribuyen a PAD, pero conduce a una reducción de la Ca 2 +-afluencia mejorando así la inhibición presináptica. Mientras que la activación de GABA A R parece estar implicado en la inhibición a corto plazo, el GABA B R están implicados en la modulación de largo plazo 8-10. Además de GABA, que representa la mayor parte de la PAD y la inhibición presináptica, otros sistemas transmisores también podrían modular y contribuir a este mecanismo de 11,12.
Los cambios patológicos en la inhibición presináptica parecen ser cruciales en varios estados de enfermedad, por ejemplo, la inflamación y el dolor neuropático periférico 13,14, así como el procesamiento anormal de dolor central 15, lesión de la médula espinal 16, y enfermedad del SNC con hiperexcitabilidad del motor mediada por la transmisión GABAérgica defectuoso 17, 18. Por lo tanto, la estimación de la inhibición presináptica la pena investigar las condiciones patológicas experimentales a nivel de la médula espinal en vivo 7.
Las primeras mediciones de DRP se han reportado en los gatos y ranas 19 y fueron intensamente estudiado en gatos por Eccles, Schmidt, y otros en la década de 1970 3,4,20,21. Mientras grabaciones in vivo de DRP en los gatos 22 y 23 ratas han sido ampliamente utilizados, las mediciones en los ratones se han realizado casi exclusivamente en preparaciones aisladas ex vivo de la médula espinal 15,24. Aquí, se describe un método para grabar DRP en ratones anestesiados in vivo que permite una medida directa de la inhibición presináptica en el organismo intacto.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales se mencionan en el siguiente protocolo fue aprobado por las autoridades del estado de Turingia (Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Reg.-Nr. 02-044/12).
1. Los preparativos para el Experimento
- La fabricación de electrodos de succión
- Tire una micropipeta utilizando un capilar de vidrio de borosilicato de serie con un extractor de micropipeta, por ejemplo, un electrodo de conexión estándar.
- Freno el electrodo a la punta diámetro de 0,5-1 mm (un poco más grande que el diámetro de las raíces dorsales) utilizando un archivo de diamante.
- Esmalte de calor de la punta para que no se dañe la raíz dorsal cuando es aspirado pulg Una antorcha de laboratorio estándar será adecuada.
- Monte el filamento de vidrio en un titular de electrodo conectado a una jeringa a través del cual puede aplicarse presión negativa.
- Preparación de las soluciones
- Inyección de anestesia para los ratones: Mezclar 0,75 ml de ketamina 10%, 0,24 ml de xilazina 2%º 5 ml de solución salina al 0,9%. 10 l / g de peso corporal (BW) de la solución se inyecta por vía intraperitoneal (IP).
- Líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa): Diluir en agua doblemente destilada las siguientes sales (en mM): NaCl 134; KCl 3; KH 2 PO 4 1,25; MgSO 4 • H 2 O 2, NaHCO3 25; CaCl2 2, D- glucosa 10. Añadir H 2 O 2 a una concentración final de 0,003%. Use la solución siempre recién preparado.
- Preparación de la configuración de la grabación (Figura 2)
- Conecte el amplificador a una interfaz de PC para la digitalización de datos.
- Utilice un programa basado en PC o un temporizador analógico para desencadenar un estimulador pulso cuadrado y adquisición de datos en el disco duro del PC.
- Utilice silverwires clorada conectados a las pinzas de soldadura de vidrio estándar como para estimulación y registro.
- Ensamblar tres manipuladores para la estimulación, la grabación y el electrodo de referencia, respectivamente en torno a un estéreomarco otactic para los ratones, de manera que todos los electrodos tienen acceso a la médula espinal preparado más adelante.
- Conecte los tubos y jeringas para los portaelectrodos ser manzana de aplicar presión negativa.
2. Comentarios generales de la experimentación animal y Preparación de los animales para el Procedimiento de grabación
- Lleve a cabo todos los experimentos con ratones de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado de Animales institucional y el uso respectivo. Lleve a cabo todas las cirugías y las grabaciones bajo anestesia profunda asegurando que el sufrimiento de los animales se reduce al mínimo.
- Anestesiar al animal mediante inyección ip de ketamina / xilazina (125 mg y 8 mg por g de peso corporal de ketamina y xilazina, respectivamente; 10 l / g de peso corporal de la solución preparada tal como se describe más arriba). Si es necesario durante las grabaciones a largo plazo, las inyecciones adicionales se pueden hacer ip o im
Nota: repetitivas inyecciones im de 0,05-0,1 ml de solución de ketamina / xilazina en los muslos superiores han demostrado ser adecuadopara mantener al animal en la anestesia profunda hasta por 3 horas. - Use ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia.
- Fijar la cabeza del animal en un marco estereotáctico y use una almohadilla eléctrica con sonda rectal y bucle reflejo de controlar la temperatura corporal de los animales durante el experimento. Fijación de la médula espinal en un marco estereotáxico no es necesario.
- Antes de empezar la preparación, comprobar la profundidad de la narcosis por reflejo de parpadeo y espasmos entre los dedos de los ratones. Los reflejos deben ser abolidas.
- Abra la piel a lo largo de la línea media por encima de la médula espinal desde el nivel superior torácica para reducir las zonas lumbar para obtener un campo operacional clara con un bisturí. No utilice tijeras para hacer incisiones en la piel. Perder con cuidado la piel del tejido subyacente. Durante las etapas posteriores mantienen la herida humedecida en un 0,9% de solución salina.
- Corte los tendones y el tejido conectivo en ambos lados de las vértebras de la zona lumbar a los niveles torácicos usando escalpelo y tijeras. Retire las apófisis espinosas y resto de tejido conectivo que rodea las vértebras usando una pequeña pinza.
- Romper con cuidado vértebras con la pinza a partir de los niveles lumbares (L4/L5) bajo un microscopio de disección. Empuja la punta de la pinza en el espacio entre las vértebras y la médula espinal y levantar piezas de hueso aparte. No hagáis daño a la dura y evitar la presión en la médula espinal. Ambos son críticos para el éxito. Mantener la médula espinal humedecido durante todo el procedimiento. Proceder a niveles de mediados de torácicos.
3. La separación de las raíces dorsales y DRP de grabación (Figura 2)
- Abra la duramadre con cuidado usando una aguja fina (30 G) con una punta doblada. Utilice LCRa para humedecer de ahora en adelante.
- Separar las raíces dorsales medida de lo posible utilizando el medidor y cortar dos raíces adyacentes como distal como sea posible. Vigorosa tirando de las raíces durante la separación afecta el éxito del experimento.
- Baje el electrodo de succión hasta el doRSAL raíces. Añadir como mucho LCRa a la médula espinal como sea posible porque el líquido ayuda a succionar en las raíces dorsales.
- Suck el extremo cortado de uno de la raíz dorsal en uno pipetas de vidrio mediante la aplicación de presión negativa a través de una jeringa. Si es necesario, mover la raíz dorsal en frente de la abertura de electrodo usando una aguja fina.
- Si la raíz dorsal se encuentra seca en el electrodo de succión, añadir un poco de LCRa a su punta mientras chupa con cuidado hasta que la pipeta está suficientemente llena de LCRa.
- Después de la raíz dorsal es aspirado, levante la punta del electrodo de la médula espinal. Tenga cuidado de que no "puente de agua" entre la punta de la pipeta y el cable de cortocircuito de la médula del electrodo de registro / estimulación.
- Repita los pasos 3.3 a 3.6 para una raíz adyacente ipsilateral.
- Coloque el electrodo de referencia lo más cerca posible a las raíces dorsales y mantenerlo humedecido mediante la aplicación de LCRa.
- Al establecer la configuración de la grabación, uno de raíz ya está elegido para la estimulación, laotro para la grabación. El incremento progresivo de tensión durante la grabación de la segunda raíz dorsal se realiza en el modo de pinza de corriente. Uno puede notar una desviación hacia abajo corto que es seguido por una larga duración de desviación lenta, hacia arriba que representa el DRP.
- Ajuste la tensión de estímulo para supramáxima niveles y grabar varios barridos (por lo menos 20 a 30 barridos / raíz dorsal a 0,1 Hz, filtro de entre 0,3 Hz-3 kHz).
- Registre trenes cortos de tres estímulos (100 Hz) para obtener información acerca de la suma que depende del tiempo de la DRP.
- Conmutador de grabación y el sitio de estimulación para las grabaciones contralaterales adicionales.
- Animales no están destinados a sobrevivir el procedimiento. Sacrificio de animales después de la última grabación mediante decapitación mientras estaba todavía bajo anestesia profunda (ketamina / xilazina, ver más arriba, paso 2.2).
4. Análisis de Datos
- Transferencia de datos con el programa de análisis (por ejemplo, Sigma Plot, Igor Pro o MATLAB).
- Calcula el promedio huellas from 20-30 barridos.
- Tome la amplitud máxima de la desviación de tensión (a partir de la línea de base; DRP pico de amplitud) para su posterior análisis (Figura 3).
- Calcular la relación de la amplitud de pico de DRP después de tres pulsos y solo pulso para obtener una medida de la suma dependiente del tiempo de los potenciales posteriores.
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Representative Results
Trazas de DRP típicos se muestran en la Figura 3. El artefacto de estimulación prominente es generalmente seguido por una breve desviación hacia abajo. A partir de entonces una larga duración deflexión ascendente lento, en representación de la DRP se distingue claramente. En un subgrupo de las grabaciones, los reflejos de la raíz dorsal son visibles como pequeños picos en la parte superior de la DRP. En los ratones normales de tipo salvaje, los reflejos de la raíz dorsal aparecen más a menudo cuando el voltaje de estimulación es excesiva. A medida que los reflejos de la raíz dorsal no pueden ser provocados con una alta reproducibilidad en esta preparación, no se tomaron para el análisis y se tuvo cuidado para reducir la tensión de la estimulación a la más baja, pero la fuerza todavía supramáxima. Para el análisis de las amplitudes máximas de DRP, promediaron los rastros de 20-30 barridos posteriores se utilizan (Figura 3a). Las amplitudes de pico de DRP pueden calcularse en comparación con los niveles de línea de base antes de la artefacto de estimulación.
La suma que depende del tiempo de la DRP se puede analizar desde repetitivo stimulations (3 estímulos; 100 Hz; Figura 3b). La amplitud de pico se calcula de acuerdo con el único experimento de estimulación. La relación de las amplitudes después de una única y tres estimulaciones a alta frecuencia da una estimación de la suma dependiente del tiempo de la PAD.
Figura 1. Dibujos esquemáticos de las vías medulares asociadas-PAD y configuración de la grabación. A. El diagrama muestra la vía esquemática de la inhibición presináptica en la médula espinal después de la estimulación de una raíz dorsal (3). Despolarización aferente primaria (EAP) está mediada por la activación de un grupo de neuronas de primer orden (1) e inhibición GABAérgica consecutivamente por una interneurona inhibitoria con una sinapsis axo-axonal en las fibras aferentes Ia (2). Potenciales de la raíz dorsal (RDP) reflejar el PAD, extendido por vía electrónica a lo largo de la raíz dorsal y se registraron cerca de su entrada a la médula espinal (4). B. La adquisición de datos se realiza mediante un software patchmaster funcionamiento de computadoras personales (1) el uso de un interfaz de 8 +8 ordenador LIH (2). Las señales de voltaje del amplificador universal de ELC (7) son digitalizadas a 10 kHz. La estimulación se desencadena por una señal TTL controlar un S88 doble salida cuadrada estimulador del pulso (3). Impulsos de tensión se aplican a través de un electrodo de succión (4). El electrodo de registro está conectado a un preamplificador (6). Un alambre de plata clorurada se utiliza para conectar a tierra (5). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2.Grabación de DRP in situ. Una. La médula espinal del ratón anestesiado se expone, la duramadre eliminó, y se humedece con líquido cefalorraquídeo artificial. Los electrodos de succión (1: estimulantes electrodo; 2: grabación de electrodo,) están posicionados en la médula espinal. El recuadro muestra la médula espinal (flecha negro) y las raíces dorsales (flechas azules). Las raíces dorsales se separan, cortar, y absorbidos por las puntas de los electrodos (1,2). B. Las puntas de las pipetas que contienen las raíces dorsales (inserción, flechas amarillas) tienen que ser cuidadosamente elevada de la superficie de la médula espinal, de manera que no están en contacto con el fluido circundante. El estiramiento de las raíces dorsales y tocando la médula espinal debe ser evitado (en A y B: la estimulación del electrodo 1, electrodo de registro 2, el electrodo de referencia 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Los resultados representativos. Promedió una grabación (del panel izquierdo). De 28 huellas consecutivas (panel derecho) de un par de raíces dorsales. El artefacto de estimulación (1) es seguido por un potencial negativo prolongado (2, hacia arriba), que refleja la DRP. En algunas grabaciones, latido del corazón (ECG) es visto como un artefacto (panel de la derecha, las flechas rojas), pero puede ser claramente diferenciada de la DRP. Huellas con artefactos de ECG superpuestas superpuestas a la DRP tienen que ser excluidos del análisis. B. La estimulación repetitiva (3 estímulos, 10 Hz) conduce a una suma que depende del tiempo de la DRP (abscisa se agranda para aclarar suma temporal). C. Ejemplo grabaciones de DRP antes (línea de color negro) y 5 minutos después (línea roja) localesaplicación de la bicucullin bloqueador de GABAérgica (0,5 mM, 500 l) en la médula espinal expuesta. El bloqueo de las interneuronas locales GABAérgicas conduce a un marcado descenso de DRP amplitud pico confirmando origen GABAérgicas del potencial registrado (nota el artefacto de 50 Hz onda sinusoidal en la curva roja, que en ocasiones se produce durante el DRP en la grabación vivo ya veces no se puede evitar, incluso mediante una política adecuada de puesta a tierra y el blindaje).
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Discussion
Extra-e intracelulares registros electrofisiológicos de la actividad neuronal y sináptica potenciales in vivo son el estado de las técnicas más avanzadas en la investigación de las funciones neuronales del sistema nervioso central y la fisiopatología. Integración espinal es fundamental para la función del motor, por ejemplo, el movimiento de las extremidades y de la percepción sensorial multimodal. Inhibición presináptica es un mecanismo fundamental en este proceso computacional asegurar respuestas adecuadas a los estímulos sensoriales. Sinapsis GABAérgicas en fibras aferentes Ia inhiben la excitación de las neuronas motoras por PAD. De la raíz dorsal potencial-grabación en vivo abre la posibilidad de medir directamente PAD en el animal intacto. Esta técnica puede ser de especial interés para la investigación relacionada con enfermedades en las que la inhibición de la médula anormal es pertinente, como el dolor, la lesión de la médula espinal, lesión de nervios periféricos, o inflamación. En combinación con el uso de modelos de ratón genéticamente modificados esta técnica puede ser de gran alcance para investigate mecanismos subyacentes perturbados inhibición de la médula. El método aquí supera algunas limitaciones de la forma alternativa de grabaciones de DRP en ratones utilizando preparaciones de médula espinal aisladas. Así, las vías a las redes supraespinales se conservan y también análisis combinado de la actividad neuronal espinal y supraespinal es posible. El efecto de la actividad supraespinal el PAD puede ser investigado por la estimulación eléctrica en paralelo de los respectivos centros cerebrales. Además, DRP puede ser evocado por la estimulación de los nervios periféricos directamente, lo que podría ser de relevancia en modelos animales de lesión del nervio periférico o la inflamación. El uso de la anestesia adecuada, la vigilancia y control de la temperatura, las grabaciones se pueden realizar por hora en el animal intacto en condiciones fisiológicas.
En contraste, en comparación con el uso de preparaciones de médula espinal aisladas, la grabación en vivo de DRP es en cierta medida limitada respecto a la aplicación local de la droga controlado y la perfusión de bañera, asílución. Los medicamentos pueden ser aplicados tópicamente, pero debido a la difusión incierta en el tejido circundante, el intercambio solución variable y cantidad de solución en la preparación de grabación no es posible controlar la concentración de fármaco dentro de la médula espinal y el sitio de grabación. Cuando se estudian los efectos agudos de la aplicación a la superficie, estas limitaciones pueden resolverse en parte mediante la aplicación local a través de pipetas.
La médula espinal de los ratones es pequeño, altamente sensible a la presión y de torsión, y la cirugía es difícil. Por lo tanto, la preparación de la médula espinal de ratón para electrofisiología in vivo necesita un poco de entrenamiento. Hay ciertos puntos críticos. Es esencial que durante la preparación de la duramadre no se vea perjudicada y que preferiblemente no o al menos muy pocos se aplica presión a la médula espinal. La médula espinal debe mantenerse humedecido durante todo el procedimiento, antes y después de la apertura de la duramadre con NaCl y LCRa, respectivamente. La señal a ruidorelación de grabaciones de DRP se puede aumentar mediante la estimulación de la grabación y lo más cerca posible al punto de entrada de la raíz dorsal respectiva. Tierra diligente y blindaje de la configuración de la grabación ayuda a reducir el ruido no específica, lámparas del microscopio de disección deben apagarse o se quitan durante la grabación.
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Disclosures
Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Damos las gracias a Manfred Heckmann útil para los debates durante el establecimiento del método. Además, agradecemos a Claudia Sommer para la asistencia técnica y Frank Schubert para la producción del vídeo de la ayuda. El trabajo fue apoyado por el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF), Alemania, FKZ: 01EO1002 y el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica (IZKF) del Hospital de la Universidad de Jena.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass tubing (inner diameter 1.16 mm) | Science Products (Hofheim, Germany) | GB200F-10 | Other glass tubing might also be suitable |
| Superfusion solution (sterile, 0,9% NaCl) | Braun Melsungen AG | 3570350 | |
| Rompun 2% (Xylazine) | Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Germany) | ||
| Ketamine 10% | Medistar GmbH (Ascheberg, Germany) | KETAMIN 10% | |
| 30 G Microneedle/ Sterican | Braun Melsungen AG | 4656300 | |
| Salts for aCSF | Sigma-Aldrich | Diverse | |
| S88 Dual Output Square Pulse | Grass Technologies (Warwick, USA) | S88X | |
| SIU5 RF Transformer Isolation Unit | Grass Technologies (Warwick, USA) | SIU-V | |
| InstruTECH LIH 8+8 | HEKA (Lambrecht, Deutschland) | LIH 8+8 + Patchmaster software | |
| Universal amplifier | NPI (Tamm, Deutschland) | ELC-03X | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | P-1000 | |
| Dissecting microscope | Olympus (Tokyo, Japan) | ||
| Micromanipulator | Sutter Instruments (Novato, USA) | MPC-200/MPC-325 | Mechanical micromanipulators also possible |
| Homeothermic Blanket System | Stoelting (Wood Dale, USA) | 50300V | |
| Intra-/extracellular recording electrode holder | Harvard Apparatus (Holliston, USA) | 641227 |
References
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