Formação de biomembrana Microarrays com um método de montagem baseada em Rodo

Summary

Bicamadas lipídicas suportadas e partículas de membranas naturais são sistemas convenientes que podem aproximar as propriedades das membranas celulares e ser incorporadas em uma variedade de estratégias de análise. Aqui demonstramos um método para a preparação de compostos de microarrays de suporte revestidas de lípidos em bicamada-SiO ₂ grânulos, vesículas de fosfolípidos ou partículas de membranas naturais.

Abstract

Membranas de bicamada lipídica formar as membranas plasmáticas de células e definir os limites de organelos subcelulares. Na natureza, estas membranas são misturas heterogéneas de vários tipos de lípidos, contêm proteínas ligadas à membrana, e são decorados com hidratos de carbono. Em algumas experiências, é desejável para dissociar as propriedades biofísicas ou bioquímicas da bicamada lipídica dos da membrana natural. Tais processos requerem o uso de sistemas modelo tais como vesículas gigantes, lipossomas ou bicamadas lipídicas suportados (EBSL). Matrizes de EBSL são particularmente atraentes para aplicações de detecção e imitando interações célula-célula. Aqui nós descrevemos um novo método para a formação de matrizes SLB. Submicron diâmetro SiO ₂ grânulos são primeiro revestidas com camadas duplas de lípido para formar EBSL esféricas (SSLBs). Os grânulos são, em seguida, depositada numa matriz de micropoços micro fabricado submícron de diâmetro. A técnica de preparação utiliza um "rodo" para limpar a superfície do substrato, enquanto deixandog trás SSLBs que se instalaram em micropoços. Este método não requer nenhuma modificação química do substrato de micropoços, nem quaisquer ligandos alvo particulares no SSLB. Os micropoços são ocupados por grânulos individuais, porque o diâmetro do poço é ajustado para ser apenas maior do que o diâmetro do cordão. Tipicamente, mais de 75% dos poços estão ocupados, enquanto o restante permanece vazio. Em tampão de matrizes SSLB exibir estabilidade a longo prazo maior do que uma semana. Vários tipos de SSLBs podem ser colocados em uma única matriz pela deposição de série, e as matrizes podem ser usados ​​para a detecção, o que demonstramos ao caracterizar a interação da toxina da cólera com gangliosídeo GM1. Mostramos também que as vesículas de fosfolípidos, sem os suportes de talão e biomembranas de fontes celulares podem ser dispostos com o mesmo método e os lípidos da membrana específicos para células podem ser identificadas.

Introduction

Membranas lipídicas bicamada são estruturas essenciais na natureza. Membranas plasmáticas celulares e membranas de organelas são compostas por bicamadas lipídicas que incorporam uma série de moléculas que são necessárias para a vida. Muitos processos que sustentam a vida ocorrem na superfície de células ou são mediadas por moléculas associadas com membranas de bicamada lipídica. De facto, muitos processos farmacêuticos alvo ou moléculas são encontrados sobre ou dentro de membranas ^{de 1,2.} Por conseguinte, é necessário investigar analiticamente processos, tais como reacções químicas ou eventos de ligação não covalentes que ocorrem sobre as superfícies da membrana. Porque as membranas naturais podem ser difíceis de isolar e / ou de interface com os sensores, muitos investigadores empregam membranas modelo simplificado para a realização de estudos analíticos. Um certo número de sistemas de membranas modelo são descritos na literatura, variando a partir de vesículas gigantes que podem ser dezenas a centenas de microns de diâmetro até os lipossomas com dimensões nanométricas ^3,4. Alterntivamente, bicamadas lipídicas planas depositados em suportes sólidos, isto é, suportadas bicamadas lipídicas (EBSL), pode ser formado de uma série de superfícies diferentes e têm sido amplamente utilizados em biofísicos, bioquímicos, e aplicações analíticas ^5. Acoplamento EBSL com materiais eléctricos ou ópticos permite a investigação de bioquímica e biofísica da membrana, através da utilização de diferentes técnicas analíticas. A microscopia de fluorescência ^{6, 7} eletroquímica, espectroscopia óptica ^8, microscopia de varredura por sonda ^9, a ressonância de plasma de superfície ^10, e espectrometria de massa ¹¹ têm sido utilizados para estudar a estrutura e propriedades de EBSL.

Matrizes SLB oferecem versatilidade adicional na concepção de sensores para ensaios multiplex ^12,13. Outras aplicações utilizam matrizes SLB para imitar a junção que se forma entre células do sistema imunológico ^14. Métodos de preparação para matrizes SLB têm variado de microfluidic se aproxima ^{de 15} a aqueles que empregam as barreiras físicas entre os patches SLB adjacentes. ¹⁶ Outros grupos têm usado métodos de impressão ^17, padronização fotoquímica ¹⁸ e vários nanoengineering se aproxima ^{de 19} a criar matrizes SLB.

Neste artigo e vídeo que acompanha demonstramos um método para formar matrizes SLB SLB depositando-revestidos SiO ₂ contas em conjuntos ordenados de micropoços ^20. Referimo-nos aos SLB-revestidos SiO ₂ pérolas esféricas como bicamadas lipídicas suportadas (SSLBs). Esta técnica é uma extensão do trabalho anterior que criou conjuntos de vesículas de fosfolipídios e biomembranas derivados de fontes naturais ^21, de onde também mostram exemplos de resultados. Outros métodos para arraying partículas de membranas ou vesículas têm contado com padrões de ligantes específicos de segmentação em superfícies que se associam com ligantes complementares contidas na superfície da vesícula. Exemplos incluem a biotina-associação avidina ^22,23 e esquemas de hibridização DNA ^24. Nossa abordagem requer apenas uma matriz de micropoços sem partes necessárias de segmentação ou de reconhecimento. O tamanho de SSLBs é definida pelo diâmetro das SiO ₂ suportes de talão, que têm baixa poli-dispersividade. Ao ajustar o diâmetro de micropoços apenas maior que o diâmetro SSLB, apenas um único SSLB depositada em cada microplaca. Um poli (dimetilsiloxano) (PDMS) rodo então remove da superfície de todos os SSLBs que não estão imobilizados em micropoços. Os micropoços e matrizes SSLB resultantes têm elevada densidade (~ 10 ⁵ SSLBs / mm ²⁾ com 3 um espaçamento centro-a-centro e periodicidade hexagonal. Por serialmente depositando SSLBs com diferentes composições de lípidos, é possível criar matrizes de múltiplos componentes com SSLBs posicionados aleatoriamente. Para demonstrar a capacidade de detecção de matrizes SSLB, usamos a interação da toxina da cólera (CTx) com um gangliosídeo (GM1) incorporada nas SSLBs. Compartículas de membranas naturais, que eram capazes de detectar lípidos específicos de células em matrizes de multicomponentes que contenham material de membrana a partir de dois tipos de células diferentes.

Protocol

1. Microfabricação de Microwell matriz Substrato

1. Comece com uma pastilha de silício de 4 polegadas com 100 nm de óxido crescido termicamente.
2. Gire SPR-955 0.7 photoresist na bolacha a 4.000 rpm por 30 seg.
3. Asse numa placa de aquecimento a 115 ° C durante 90 seg.
4. Expor photoresist.
   1. Use uma máscara que irá criar uma mM buracos dispostos em um arranjo hexagonal com um período de 3 um, onde a matriz de cobre a 2 mm Área x 2 mm.
   2. Expor bolacha num passo i-line utilizando um tamanho de passo de 6 mm e uma exposição de 200 mJ / cm ^2.
5. Asse numa placa de aquecimento a 115 ° C durante 90 seg.
6. Desenvolver usando um desenvolvedor de spin para depositar duas poças de CD-26 no wafer para um tempo de desenvolvimento total de 90 seg.
7. Enxaguar abundantemente com água ultrapura DI e seco com _N2.
8. Etch do óxido em um etcher reativa-ion para 6 min com 50 sccm de Ar, 25 sccm de CF ₄ e 50 sccm de CHF ₃ floasa, a uma pressão de 75 mTorr.
9. Etch silício em um ICP profunda trincheira etcher reativa-ion por 2 min com 63 sccm de C ₄ F _8, 27 sccm de SF _6, 40 sccm de Ar, e 10 sccm _de O2 que flui a uma pressão de 14 mTorr.
10. Enxaguar em acetona, metanol e isopropanol, para remover resistir.
11. Coloca-se num banho de H ₂ SO _4: H ₂ O _{2 a} 1:01 durante 10 minutos para limpar a superfície.
12. Enxaguar abundantemente com água ultrapura DI e seco com _N2.
13. Deposite 1,080 Å de Al ₂ O ₃ por deposição de camadas atômicas a 250 ° C.

2. Preparação de Poli (dimetilsiloxano) Rodo

1. Se possível, trabalhar em uma sala limpa. Caso contrário, trabalhar no ambiente mais limpo possível.
2. Obter um prato de plástico Petri (ou outro recipiente descartável limpo) com ≥ lados 13 mm.
3. Nesse prato, despejar 5 g agente PDMS cura, seguido de 50 g de PDMS base agente (ou qualquer coisa com uma relação de 01:10 que a maioria irá preencher a placa de Petri). Misture bem com uma pipeta de plástico descartável ou vara.
4. Retirar as bolhas, colocando o PDMS misturados numa câmara com uma linha de vácuo, a aplicação de vácuo, até sair bolhas de mistura (cerca de 30 min).
5. Se ainda não estiver na placa de Petri, despeje PDMS em placa de Petri, evitando a criação de bolhas de ar.
6. Curar durante a noite numa placa de aquecimento a> 50 ° C (mais elevada de calor durante menos tempo também funciona).
7. Com lâmina de barbear novo / limpo, cuidadosamente cortar um pedaço retangular de aproximadamente 2,5 x 2,5 cm, mantendo a superfície superior o mais limpo possível. Descasque fora com um pano limpo fórceps. Apare uma borda (até 1,5 cm), pressionando para baixo em lâmina de barbear em um movimento, para fazer borda superior tão afiada quanto possível (esta será a borda utilizada no processo de rodo).
8. Limpa-se com acetona, metanol, álcool isopropílico, e ultrapura DI água, e, em seguida, secar com azoto gasoso limpo. Guarde em um prato limpo Petri.

3. Preparação de vesículas

1. Recolhe soluções de lipídicos de fosfatidilcolina de 25 mg / ml de ovo (PC) e 1 mg / ml de 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N - (lissamina rodamina B sulfonil) de sal de amónio (Rho-DPPE) em clorofórmio e uma solução a 0,5 mg / ml de mono-sialogangliósido GM1, em clorofórmio / metanol (2:1 v / v).
2. Num frasco pequeno de vidro fazer uma mistura que resulta em 97% molar de PC, 2% molar de GM1 e 1% molar de DPPE-Ró, adicionando 18,9 uL de 25 mg / mL de PC, 39,6 ul de 0,5 mg / ml de GM1 e 7,9 ul de 1 mg / mL de Rho-DPPE utilizando seringas de vidro.
3. Nota:. O material suplementar para Nair et al ²⁵ contém uma excelente planilha Excel customizáveis ​​para o cálculo das quantidades de lipídios necessários para criar vesículas de qualquer composição desejada.
4. Coloque frasco num exsicador de vácuo e remover o solvente deixando o frasco sob vácuo durante 6 horas.
5. Adicione uma solução aquosa de 0,1M de NaCl. Adicionar 0,5 ml de solução de NaCl 0,1 M para o frasco contendo a película de lípidos seca.
6. Permitir que a mistura aquosa de lípido para descansar durante a noite.
7. Resumidamente mistura vortex para criar uma suspensão de vesículas, em seguida, sonicar durante 20 min num banho de ultra-sons à temperatura ambiente.
8. Extrude a suspensão vesícula através de uma membrana de policarbonato com 100 nm de tamanho de poros. Passar a suspensão de vesículas através do filtro de 17x.
9. Armazenar as vesículas extrusadas em um frasco de vidro a 4 ° C.

4. Formação de esféricas lipídicas Bicamadas suportados

1. Colete 700 nm de diâmetro SiO ₂ contas. As contas são fornecidos em água destilada com uma concentração estoque de 1,4 x 10 ¹¹ contas / ml.
2. Num tubo de Eppendorf de 1,5 ml preparar uma suspensão de esferas de 1 ml, com uma concentração de 1,5 x 10 ¹⁰ contas / ml pela adição de 107 ul de solução-mãe de talão de 893 ul de 0,1 M de NaCl.
3. Vortex a suspensão para garantir que ele está bem mixa.
4. Centrifugar a suspensão a 1700 xg durante 20 min, em seguida, descartar o sobrenadante. Ressuspender as pérolas em 1 ml de 0,1 M de NaCl. Repita este passo mais duas vezes para lavar bem as contas.
5. Para formar os SSLBs, num tubo Eppendorf de 1,5 ml adicionar 25 ul da suspensão de esferas de SiO ₂ para 200 ul de 1 mg / ml de suspensão de vesículas. Vortex a mistura e deixar repousar durante 1 hora à temperatura ambiente. Nesta fase, a concentração deve ser SSLB 1,7 x 10 ⁹ SSLBs / ml.
6. Centrifugar a 1700 xg por 20 min para agregar as SSLBs. A pastilha deve aparecer rosa devido à ruptura de vesículas com Rho-DPPE sobre as contas.
7. Descartar o sobrenadante e ressuspender em 225 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH = 7,4. Repita os passos de 4,6-4,7 mais duas vezes para remover quaisquer vesículas unruptured da suspensão SSLB.

5. Assembleia da SSLB Matriz

1. Wafer Cleave de matrizes de micropoços, resultando em peças retangulares com 4-6 micmatrizes rowell por peça.
2. Vortex misturar a suspensão SSLB, em seguida, coloque 10 ml de suspensão SSLB em cada matriz de micropoços. Para que não descanso para 1 hora para permitir SSLBs para resolver para a superfície.
3. Lave cuidadosamente o chip conjunto de micropoços com PBS a partir de um frasco de lavagem, em seguida, mergulhe em um banho de PBS preparada em um prato raso.
4. Enquanto submerso, coloque delicadamente o PDMS rubor rodo no chip conjunto de micropoços e gentilmente deslize-o ao longo da superfície de 5x para remover SSLBs que não estão imobilizadas em micropoços.
5. Segure o chip conjunto de micropoços, com uma pinça e agite no banho PBS para remover quaisquer SSLBs excesso.
6. Remover rapidamente o chip do banho de rodo e coloque em banho-PBS fresco até à sua utilização. Certifique-se que a superfície superior do chip permanece molhado para preservar os SSLBs.

Nota: O processo de montagem descrito acima pode ser utilizado para criar matrizes de partículas de membranas naturais, como partículas de mielina isoladas de cérebro de rato, ou phovesículas spholipid sem os SiO ₂ suportes talão. Este trabalho é descrita em pormenor em Wittenberg et ²¹ al. E os resultados representativos são apresentados abaixo.

6. Cholera Toxin Binding Assay

1. Prepara-se uma solução de 2 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA) em PBS.
2. Prepara-se uma solução com a concentração desejada de Alexa 488 conjugado com a toxina da cólera subunidade B em PBS com 2 mg / ml de BSA.
3. Retire o chip conjunto SSLB do banho de PBS e pavio fora a maior parte da solução PBS usando um laboratório de limpar. Deixar simplesmente suficiente PBS no chip para manter a matriz SSLB hidratado.
4. Para impedir a ligação não específica, adicionar 200 ul de 2 mg / ml de solução de BSA a matriz do chip SSLB. Deixe descansar por 1 hora em uma caixa umidificado.
5. Com uma micropipeta, remover 200 mL de solução a partir do topo do chip de matriz SSLB.
6. Adicione 200 ml de solução de toxina da cólera ao chip conjunto SSLB e deixe descansar por 1 hora em uma caixa umidificado.
7. Lave cuidadosamente o chip conjunto SSLB com PBS a partir de um frasco de lavagem para remover qualquer toxina da cólera não ligado.
8. Wick o excesso de PBS usando um laboratório de limpar. Antes de imagem de chip tampa com um pedaço 24 milímetros tampa x 40 mm.
9. Matrizes de imagem com um microscópio vertical usando filtro define apropriado para os fluoróforos de interesse.
10. Analisar a intensidade de fluorescência de SSLBs individuais em uma matriz usando a função de análise de partículas automatizada de software ImageJ.
11. Compilar intensidades de fluorescência média de SSLBs individuais em histogramas que resumem as intensidades de SSLBs encontrados em uma determinada matriz.

Results

Quando SiO ₂ pérolas são misturadas com uma solução de vesículas compostas por fosfolípidos, lípidos fluorescentes e outros lípidos, tais como gangliósidos, as vesículas se rompem na superfície do grânulo de SiO ₂ para formar SSLBs, como mostrado esquematicamente na Figura 1A. Depois de lavar as SSLBs, uma gota de solução SSLB é colocada sobre uma matriz de micropoços, e os grânulos são deixadas assentar à superfície. (Figura 1b1) Isto também pode ser feito com uma...

Discussion

Neste trabalho é mostrar que monodispersas SiO ₂ contas revestidas com camadas duplas lipídicas suportados podem ser dispostos em conjuntos de micropoços, sem a necessidade de ligandos alvo nas bicamadas lipídicas ou a superfície do substrato, e as matrizes podem ser usadas para caracterizar as interacções lípido-toxina. A nós constante de dissociação calculada para a ligação CTx/GM1 compara favoravelmente, dada a grande disparidade de valores na literatura, com um relatório anterior por Winter et al.,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bolachas de silício de 4 polegadas	University Wafer	425
Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0,7 fotorresistente	MicroChem	SPR955-CM
Shipley MICROPOSIT CD-26 desenvolvedor	MicroChem	CD-26
i-line stepper	Canon	2500 i3 stepper
Vision 320 íon reativo etcher	Advanced Vacuum	Vision 320 RIE
Gravura a água-forte reativa profunda do íon da trincheira	Plasma Therm	SLR-770
Sistema atômico do depósito da camada	Cambridge NanoTech	Savannah
Dow Corning Sylgard 184 poli (dimethylsiloxane) jogo	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST JOGO 0.5KG
Fosfatidilcolina do ovo	Avanti Lipídios polares	840051C
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(lissamina rodamina B sulfonil) sal de amônio	Avanti Polar Lipids	810158C
Monosialoganglioside GM1	Avanti Polar Lipids	860065P
Grânulos de sílica	Bangs Laboratories	SS03N/4666	A embalagem no recipiente de contas afirma que as contas têm 900 nm de diâmetro. No entanto, após dispersão de luz e microscopia eletrônica, determinamos que as esferas têm aproximadamente 700 nm de diâmetro.
Subunidade B da toxina da cólera,	Sondas moleculares	C-34775
Anticorpo anti-oligoinócito IgM O4, conjugado NorthernLights 557	R& D Systems	NL1326R
FM1-43	Sondas Moleculares	T-3136
Eppendorf MiniSpin centrífuga	Fisher Scientific	05-401-09