Descreve-se a utilização de um vírus vaccinia repórter fluorescente que permite a medição em tempo real da infectividade viral e a expressão do gene através da expressão específica da fase de fluoróforos espectralmente distintos repórter. Detalhamos um método baseado em placa para identificar com precisão a fase em que a replicação do vírus é afetada em resposta a pequena inibição molécula.
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Artigo de método
Repórter Vaccinia vírus para quantificar Função Viral em todas as fases da Expressão Gênica
Neste artigo
Resumo
Resumo
Poxviruses são uma família de vírus de DNA fita dupla que incluem patógenos ativos humanos, tais como macacos, molusco contagiousum e vírus Contagalo. A família também inclui o vírus da varíola, da varíola. Devido à complexidade da replicação de poxvírus, muitas questões ainda permanecem em relação à sua estratégia de expressão gênica. Neste artigo, descreve-se a concepção e utilização de vírus vaccinia recombinantes que permitem a medição em tempo real das fases únicas e múltiplas de expressão de genes virais em um formato de alto rendimento. Esta é activada através da utilização de proteínas fluorescentes espectralmente distintos como repórteres para cada uma das três fases da replicação viral. Estes vírus proporcionar uma razão elevada de sinal-para-ruído de fase, mantendo padrões específicos de expressão, permitindo ensaios baseados em placas e as observações microscópicas de propagação de vírus e de replicação. Estas ferramentas têm usos para descoberta antiviral, os estudos sobre a interação vírus-hospedeiro, e bio evolutivologia.
Introdução
Tradicionalmente, a expressão do vírus é estudada, utilizando técnicas de biologia molecular (por exemplo, transferência de Northern, transferência de western, de microarray de hibridação, etc) 1. Enquanto estes métodos são capazes de fornecer a informação detalhada com respeito à categorização mudanças de mRNAs individuais ou de proteínas de expressão, que não são normalmente passíveis de processos em tempo real e de alto rendimento. Abordagens alternativas usando os repórteres à base de fluorescência foram aplicadas anteriormente ao trabalhar com poxvírus; no entanto, o seu desenvolvimento e uso foi motivado por objetivos variados. Vári....
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Protocolo
1. Placa Células
- Dissociar células HeLa a partir de chapa e dilua em meio de crescimento (DMEM, 2 mM de L-glut, FBS a 10%) para aproximadamente 2,0 x 10 5 células / ml. Distribuir 100 ^ l / poço de uma, claro placa de 96 poços de fundo plano com paredes pretas (20000 células / poço).
- Incubar as células durante 24 horas até à confluência em uma incubadora a 37 ° C + 5% de CO 2.
2. Infectar as células
- Diluir vírus e infectar as células.
- Thaw TRPV (vírus Triplo; Precoce Vênus, Intermediário mCherry, Late TagBFP) e PLV (Promotor-less Vênus) vírus fluorescente e desagregar ut....
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Resultados
Como exemplo do uso típico destes vírus, o vírus da fluorescência repórter triplo foi utilizada para comparar o ponto de inibição de vários inibidores de poxvírus bem definidas.
As células HeLa foram colocadas em cultura de tecidos tratados claras placas de 96 poços de paredes pretas de fundo plano e incubadas durante a noite. As monocamadas confluentes foram infectadas a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 usando um triplo vírus repórter (TRPV; Tabela 1) ou o promoto.......
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Discussão
Aqui, nós descrevemos o uso prático de um multi-estágio vírus vaccinia repórter (TRPV), que fornece em tempo real reprodutíveis medidas, feedback de replicação do vírus. Ao utilizar inibidores poxvírus bem definidos, fomos capazes de mostrar que TRPV responde de uma maneira consistente com o mecanismo entendido de ação para cada inibidor. Embora o vírus TRPV fornece as informações mais abrangentes sobre vírus progressão etapa, em duas etapas (iRev, LREV) e de fase única (EV, IV, LV) vírus também pode ser usado da mesma .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar e sem patentes estão pendentes de vírus ou métodos de rastreio.
Agradecimentos
Agradecemos SIGA Technologies (Corvallis, OR) para a prestação de ST-246. DKR foi apoiado por uma bolsa de formação NIH em imunologia para Boston University (5T32AI 7309). Este trabalho foi financiado em parte pelo P41 086.180, NIH RO1AI1096159-01, e SR3 (a JHC).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| Soro Fetal Bovino - Optima, Inativado por Calor (FBS) | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| 200 mM L-Glutamina, (L-glut) | Gibco | 25030-081 | |
| 96 Microplacas de Poliestireno Preto Tratadas com TC de Fundo Plano de 96 Poços | Corning | 3603 | |
| 384 Microplacas de Poliestireno Preto de Fundo Plano de 384 Bem Tratadas com TC | Corning | 3712 | |
| Tripsina, 2X, Estéril, Irradiada | Worthington Biochemical Corp. | TRLVMF | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO) | American Bioanalytical | AB03091 | |
| 1-β-D-Arabinofuranosilcitosina (AraC), MW= 280 g/mol | SigmaAldrich Co | C6645 | |
| isatina β -tiosemicarbazona (IBT), MW= 234 g/mol | Fisher Scientific | NC9075202 | |
| Rifampicina, MW= 823 g/mol | SigmaAldrich Co | R3501 | |
| ST-246, MW= 376 g/mol | SIGA Labs, Corvallis, OU | ||
| solução aquosa de paraformaldeído (formaldeído) a 8% | Microscopia eletrônica Sciences | 157-8 | |
| TempPlate RT filme opticamente transparente | USA Scientific | 2978-2700 | |
| Opti-MEM Soro Reduzido Médio | Gibco | 31985-070 |
Referências
- Yen, J., Golan, R., Rubins, K. Vaccinia virus infection & temporal analysis of virus gene expression: part 1. J Vis Exp. 26 (26), (2009).
- Hansen, S. G., Cope, T. A., Hruby, D. E. BiZyme: a novel fusion protein-med....
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Reimpressões e permissões
