Imagens em tempo real de uma única Engineered RNA transcritos em células vivas usando raciométrica Bimolecular Beacons

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de transcritos de RNA único em células vivas em tempo real. Isso é feito primeiro hibridizando dois oligonucleotídeos que foram projetados para formar uma sonda formadora de grampos conhecida como métrica de proporção por farol molecular. O segundo passo é purificar a métrica de proporção por beacons moleculares por cromatografia de exclusão de tamanho.

Em seguida, a métrica de proporção por beacons moleculares é introduzida em células que expressam o alvo de RNA projetado via micro porion. A etapa final é ver as células em uma placa de micropoços adequada para microscopia de células vivas. Em última análise, a microscopia de fluorescência é usada para monitorar os movimentos de transcritos de RNA individuais visualizados como pontos fluorescentes brilhantes dentro de células individuais.

A principal vantagem desta técnica é que ela utiliza sondas sintéticas que são fotoestáveis brilhantes e exibem um alto sinal para o fundo, o que abre a possibilidade de obter imagens de qualquer RNA endógeno Comece a preparação da razão métrica por balizas moleculares ou RBM BS misturando os seguintes reagentes em um tubo. 20 microlitros de Rbm B um 30 microlitros de Rbm B dois seis microlitros de 10 x tampão fosfato, e quatro microlitros de água livre de DNAs e RNAs. Isso normalmente é suficiente para aproximadamente 50 estudos.

Incube a mistura em temperatura ambiente por 30 minutos. Enquanto isso, prepare uma coluna de cromatografia líquida para remover qualquer oligonucleotídeos RBM B hibridizado UN dois. Use 75 super decks de grau de preparação em uma coluna de cromatografia líquida de oito mililitros com um volume de leito de cerca de quatro mililitros usando uma bomba de seringa funcionando a uma taxa de fluxo de 0,6 mililitros por minuto.

Lave e equilibre o SUEx com cerca de 50 mililitros de um tampão fosfato antes que todo o fluido entre no volume do leito. Pare a bomba de seringa, desconecte-a e deixe o líquido restante passar pela coluna por gravidade. Em seguida, coloque a mistura RBMB na coluna de cromatografia.

Depois que a amostra RBMB entrar completamente no leito, adicione lentamente mais 250 microlitros de um tampão fosfato x no topo do leito para garantir que toda a amostra tenha entrado completamente na coluna. Encha a coluna até a borda com um tampão fosfato. Feche a parte superior e ligue a bomba de seringa.

A seringa é preenchida com cerca de 50 mililitros de um XPBS e funciona a uma taxa de fluxo de 0,6 mililitros por minuto. Normalmente, a amostra RBMB pode ser facilmente visualizada devido à cor do corante incorporado à sonda. Assim que o RBMB se aproximar da parte inferior da coluna, colete o fluxo através de duas gotas por tubo de microcentrífuga.

Pare de coletar a amostra. Assim que a cor da amostra dentro dos tubos de microcentrífuga ficar clara, combine os tubos contendo a amostra RBMB colorida, normalmente de cinco a seis tubos e carregue em um dispositivo de filtro centrífugo. Centrifugar a amostra a 10 000 RCF durante 20 minutos ou até atingir o volume desejado.

Essa velocidade e tempo normalmente produzem um volume final de cerca de 30 microlitros. Neste protocolo, uma linhagem celular de fibrossarcoma humano foi projetada para expressar Q-F-P-R-N-A com 96 repetições em tandem da sequência alvo RBMB nas três UTR principais, a linha celular de controle foi projetada para expressar células de placa de entrega de sonda selvagem um dia antes da entrega da sonda em um frasco T 25 em cultura de fluência de 40 a 50% co. As células com meio DMEM suplementado com 1% de estreptococos e 10% de soro fetal bovino e incubam a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono no dia seguinte.

Ligue o micro por e configure os parâmetros de microportration otimizados para células HT 10 80. Encha o tubo de micro porion com quatro mililitros de tampão eletrolítico e coloque-o na estação de micro preparação. Descongelar uma amostra de estoque de RBMB purificado e diluir vários microlitros até uma concentração final de 12 micromolares com um tampão fosfato.

Um microlitro é necessário para cada micro porion. Para cada reação de microporion, pipetar um mililitro de meio de cultura com FBS, mas sem antibióticos, em um tubo de microcentrífuga. Coloque-o de lado perto do dispositivo de micro porion.

Ele será usado posteriormente para suspender as células imediatamente após a micropreparação. Os antibióticos não são usados porque diminuiriam a viabilidade celular após a micropreparação. As células HT 10 80 projetadas no dia anterior devem agora ser 60 a 80% confluentes.

Remova o meio de cultura de células e lave as células uma vez com um mililitro de DPBS livre de cálcio e magnésio incube com um mililitro de tripsina por um a dois minutos. Pare a tripsina adicionando um mililitro de meio DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal sem antibióticos e vermelho de fenol e transfira as células para dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Gire as células no tubo de microcentrífuga a 200 vezes G por cinco minutos.

Remover a ressuspensão sobrenadante e combinar os grânulos celulares num volume final de um mililitro de DPBS. Remova 10 microlitros da suspensão de células bem misturadas para contar as células, pipete as células para cima e para baixo várias vezes para garantir que estejam bem dispersas e transfira 300.000 células com DPBS para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Gire para baixo a 200 vezes G por cinco minutos.

Remova o sobrenadante tomando cuidado para não perturbar o pellet celular. Ressuspenda o pellet em 11 microlitros de suspensão Resus, tampone e pipete para cima e para baixo várias vezes para garantir que as células estejam bem dispersas. Certifique-se de não gerar bolhas de ar.

Adicione um microlitro do RBMB diluído e misture bem pipetando para cima e para baixo várias vezes. Novamente, tome cuidado para não gerar bolhas de ar. É fundamental evitar a introdução de qualquer bolha de ar na suspensão de vendas do RBMB porque as bolhas de ar causarão uma faísca durante a microoperação e resultarão em má entrega de RBMB e mortes celulares.

Usando a pipeta de micropreparação, aspire 10 microlitros da mistura de células RBMB e insira a pipeta no tubo de micropreparação. Pressione o botão Iniciar para iniciar a microcorporação. Não deve haver bolhas de ar visíveis na ponta quando a tela do micro por mostrar a conclusão.

Remova a pipeta da estação e expulse a mistura de 10 microlitros para o tubo de microcentrífuga previamente preparado contendo um mililitro de meio de cultura com FBS, mas sem antibióticos misturados suavemente, balançando o tubo de um lado para o outro várias vezes. Gire as células a 200 vezes G por cinco minutos. Lave as células duas vezes em um mililitro de meio de cultura livre de vermelho de fenol com FBS, mas sem antibióticos para remover qualquer rbm BS que não tenha sido entregue nas células.

Após a segunda lavagem. Resus suspende as células em 400 microlitros de meio de cultura livre de vermelho de fenol com FBS, mas sem antibióticos. Colocar as células micro rateadas em uma lamínula de cobertura com oito poços revestida com poli de lisina previamente preparada a 200 microlitros por poço ou na fluência desejada.

Coloque a lamínula com câmara em uma incubadora de cultura de células. A imagem pode ser realizada até 30 minutos após a micropreparação. Para iniciar este procedimento, ligue o sistema de incubação superior do estágio de célula viva e equilibre-o até atingir 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 75% de umidade.

Ligue o microscópio e a fonte de luz fluorescente e abra o software de aquisição de imagem metamorfo. Aplique óleo imersivo na objetiva. Transfira a lamínula com câmara com células microporosas para a fase de células vivas.

Sistema de incubação superior. Incube o stage sistema superior até que a temperatura e os níveis de dióxido de carbono estejam estabilizados. Abra a guia adquirir no software metamorfo

Clique no botão mostrar ao vivo para encontrar o campo. Ajuste o foco sob luz branca e clique no botão parar ao vivo. Na guia Adquirir.

Clique e abra o botão pop-up de aquisição de fluxo e configure os parâmetros de aquisição de filme desejados. Adquira 150 quadros usando o filtro SCI cinco CF seis 40 R. Salve as imagens no disco rígido.

Aqui são mostradas imagens representativas de células HT 10 80 expressando RNA de forma estável com 96 repetições em tandem, ou quatro repetições em tandem do local de ligação RBMB nos três UTR principais. Após a administração intracelular de mbs. A presença de 96 repetições em tandem permite que transcritos individuais de RNA apareçam como pontos fluorescentes brilhantes.

Em contraste, o RNA contendo apenas quatro repetições em tandem aparece como pontos fluorescentes muito fracos e muitas vezes só é detectável em áreas de fundo excepcionalmente baixo. A aquisição de imagens de streaming permite que transcritos individuais de RNA sejam visualizados em tempo real. Transcritos individuais de RNA podem ser facilmente vistos dentro do citoplasma e do núcleo das células que sofrem movimentos brownianos ou subdifusos.

Em casos raros, um RNA submetido a transporte direcionado será observado conforme mostrado aqui. Os transcritos de RNA submetidos a transporte direcionado normalmente se movem rapidamente ao longo de um caminho reto. Nesta montagem, a trajetória do transcrito de RNA é mostrada sobreposta a um único quadro da série temporal.

Os movimentos direcionados do RNA são consistentes com o transporte de RNA ao longo de microtúbulos e microfilamentos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar e purificar a métrica racial por beacons moleculares. Forneça métricas raciais por beacons moleculares nas células por meio de micro parion e imagens de transcritos de RNA único por microscópio fluorescente.