Imagens em tempo real de uma única Engineered RNA transcritos em células vivas usando raciométrica Bimolecular Beacons

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de transcritos individuais de RNA em células vivas em tempo real. Isso é realizado primeiramente hibridizando dois oligonucleotídeos projetados para formar uma sonda em estrutura de alfinete, conhecida como baliza molecular ratiométrica. O segundo passo consiste em purificar as balizas moleculares ratiométricas por cromatografia de exclusão por tamanho.

Em seguida, a métrica de razão por balizas moleculares é introduzida em células que expressam o RNA alvo projetado por meio de microinjeção. O passo final consiste em transferir as células para uma placa de microplaca adequada para microscopia de células vivas. Em última análise, a microscopia de fluorescência é utilizada para monitorar os movimentos de transcritos individuais de RNA visualizados como pontos fluorescentes brilhantes dentro de células individuais.

A principal vantagem desta técnica é que utiliza sondas sintéticas que são brilhantes, fotostáveis e exibem um alto sinal em relação ao fundo, o que abre a possibilidade de imageamento de qualquer RNA endógeno. Inicie a preparação do indicador de razão por sondas moleculares ou RBM BS misturando os seguintes reagentes em um tubo: 20 microlitros de Rbm B um, 30 microlitros de Rbm B dois, seis microlitros de tampão fosfato 10x e quatro microlitros de água livre de DNA e RNA. Isso geralmente é suficiente para aproximadamente 50 estudos.

Incube a mistura à temperatura ambiente por 30 minutos. Enquanto isso, prepare uma coluna de cromatografia líquida para remover quaisquer oligonucleotídeos RBM B dois hibridizados UN. Utilize 75 super decks grau preparativo em uma coluna de cromatografia líquida de oito mililitros com um volume de leito de aproximadamente quatro mililitros, usando uma bomba de seringa operando a uma taxa de fluxo de 0,6 mililitros por minuto.

Lave e equilibre o SUEx com cerca de 50 mililitros de tampão fosfato 1x antes de todo o fluido entrar no volume da coluna. Pare a bomba de seringa, desconecte-a e deixe o líquido restante passar pela coluna por gravidade. Em seguida, aplique a mistura RBMB na coluna de cromatografia.

Após a amostra de RBMB ter entrado completamente no leito, adicione lentamente mais 250 microlitros de tampão fosfato 1x ao topo do leito para garantir que toda a amostra tenha entrado completamente na coluna. Encha a coluna até a borda com tampão fosfato 1x. Feche a parte superior e inicie a bomba de seringa.

A seringa é preenchida com cerca de 50 mililitros de um XPBS e opera com uma taxa de fluxo de 0,6 mililitro por minuto. Normalmente, a amostra de RBMB pode ser facilmente visualizada devido à cor do corante incorporado na sonda. Quando o RBMB se aproximar da base da coluna, colete o fluxo que passa em tubos microcentrífugos, com duas gotas por tubo.

Interrompa a coleta da amostra. Assim que a cor da amostra dentro dos tubos de microcentrífuga ficar transparente, combine os tubos contendo a amostra colorida de RBMB, normalmente cinco a seis tubos, e transfira para um dispositivo de filtro centrífugo. Centrifugue a amostra a 10.000 RCF por 20 minutos ou até atingir o volume desejado.

Essa velocidade e tempo normalmente produzirão um volume final de cerca de 30 microlitros. Neste protocolo, uma linhagem celular de fibrossarcoma humano foi modificada para expressar Q-F-P-R-N-A com 96 repetições tandem da sequência alvo RBMB na região UTR três prima; a linhagem celular controle foi modificada para expressar o tipo selvagem Q-F-P-R-N-A um dia antes da entrega da sonda. Plaqueie as células em um frasco T25 com 40 a 50% de confluência. Incube as células em meio DMEM suplementado com 1% de penicilina-estreptomicina e 10% de soro bovino fetal a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono no dia seguinte.

Ligue o micro poro e configure os parâmetros de micro porção otimizados para células HT 10 80. Encha o tubo de micro porção com quatro mililitros de tampão eletrolítico e coloque-o na estação de micro preparação. Descongele uma amostra estoque de RBMB purificado e dilua várias microlitros até uma concentração final de 12 micromolar com tampão fosfato 1 x.

É necessário um microlitro para cada micro porção. Para cada reação de micro porção, pipete um mililitro de meio de cultura com FBS, mas sem antibióticos, para um tubo de microcentrífuga. Deixe-o reservado próximo ao dispositivo de micro porção.

Será usado posteriormente para suspender as células imediatamente após a preparação da micro. Antibióticos não são utilizados porque reduziriam a viabilidade celular após a preparação da micro. As células HT 1080 modificadas geneticamente, semeadas no dia anterior, devem agora estar entre 60 e 80% confluentes.

Remova o meio de cultura celular e lave as células uma vez com um mililitro de DPBS sem cálcio e magnésio. Incube com um mililitro de tripsina por um a dois minutos. Interrompa a ação da tripsina adicionando um mililitro de meio DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal, sem antibióticos e sem vermelho de fenol, e transfira as células para dois tubos microcêntrifugos de 1,5 mililitro. Centrifugue as células nos tubos microcêntrifugos a 200 × g por cinco minutos.

Remova o sobrenatante, ressuspenda e combine os pellets celulares em um volume final de um mililitro de DPBS. Retire 10 microlitros da suspensão celular bem misturada para contagem das células, pipete as células para cima e para baixo várias vezes para garantir que estejam bem dispersas e transfira 300.000 células com DPBS para um novo tubo microcêntrifugo de 1,5 mililitro. Centrifugue a 200 × g durante cinco minutos.

Remova o sobrenatante tendo o cuidado de não perturbar o pellet celular. Reuspenda o pellet em 11 microlitros de solução de ressuspensão, tamponada, e pipete para cima e para baixo várias vezes para garantir que as células estejam bem dispersas. Certifique-se de não gerar bolhas de ar.

Adicione um microlitro do RBMB diluído e misture bem pipetando para cima e para baixo várias vezes. Novamente, tenha cuidado para não gerar bolhas de ar. É essencial evitar a introdução de qualquer bolha de ar na suspensão de células de RBMB, porque bolhas de ar causarão uma faísca durante a microoperação e resultarão em má entrega de RBMB e morte celular.

Usando a pipeta de preparo micro, aspire 10 microlitros da mistura de células RBMB e insira a pipeta no tubo de preparo micro. Pressione o botão de início para iniciar a micro corporação. Não deve haver bolhas de ar visíveis na ponta quando a tela do micro por indicar conclusão.

Retire a pipeta da estação e expulse a mistura de 10 microlitros no tubo de microcentrífuga previamente preparado contendo um mililitro de meio de cultura com FBS, mas sem antibióticos, misturando suavemente ao balançar o tubo lateralmente várias vezes. Centrifugue as células a 200 vezes G durante cinco minutos. Lave as células duas vezes em um mililitro de meio de cultura sem vermelho de fenol, com FBS, mas sem antibióticos, para remover qualquer BS de rbm que não tenha sido entregue nas células.

Após a segunda lavagem, ressuspenda as células em 400 microlitros de meio de cultura livre de vermelho de fenol com FBS, mas sem antibióticos. Plaque as células microproporcionadas em uma lâmina de cobertura com oito poços previamente preparada e revestida com poli-L-lisina, utilizando 200 microlitros por poço ou na confluência desejada.

Coloque a lâmina de vidro com câmara em uma incubadora de cultura celular. A aquisição de imagens pode ser realizada já 30 minutos após o preparo do micro. Para iniciar este procedimento, ligue o sistema de incubação no estágio do microscópio para células vivas e deixe em equilíbrio até atingir 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 75% de umidade.

Ligue o microscópio e a fonte de luz fluorescente e abra o software de aquisição de imagens Metamorph. Aplique óleo de imersão na objetiva. Transfira a lâmina com câmara contendo células em microporos para o estágio de células vivas.

Sistema de incubação superior. Incube o sistema de platina até que a temperatura e os níveis de dióxido de carbono estejam estáveis. Abra a guia de aquisição no software Metamorph.

Clique no botão mostrar em tempo real para localizar o campo. Ajuste o foco sob luz branca e clique no botão parar visualização em tempo real. Na guia adquirir.

Clique e abra o botão pop-up de aquisição de fluxo e configure os parâmetros desejados para a aquisição do filme. Adquira 150 quadros utilizando o filtro SCI five CF six 40 R. Salve as imagens no disco rígido.

Mostradas aqui estão imagens representativas de células HT 1080 expressando estavelmente RNA com 96 repetições em tandem ou quatro repetições em tandem do sítio de ligação RBMB no UTR três primo. Após a entrega intracelular de mbs. A presença de 96 repetições em tandem permite que transcritos individuais de RNA apareçam como pontos fluorescentes intensos.

Em contraste, o RNA contendo apenas quatro repetições em tandem aparece como pontos fluorescentes muito fracos e muitas vezes é detectável apenas em áreas com fundo excepcionalmente baixo. A aquisição de imagens em sequência permite que transcritos de RNA individuais sejam visualizados em tempo real. Transcritos de RNA individuais podem ser facilmente observados no citoplasma e no núcleo das células, realizando movimentos brownianos ou subdifusivos.

Em casos raros, um RNA em transporte direcionado será observado conforme mostrado aqui. Transcritos de RNA em transporte direcionado geralmente se movem rapidamente ao longo de um caminho retilíneo. Neste mosaico, a trajetória do transcrito de RNA é mostrada sobreposta a um único quadro da série temporal.

Os movimentos direcionados de RNA são compatíveis com o transporte de RNA ao longo de microtúbulos e filamentos microscópicos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar e purificar métrica racial por meio de balizas moleculares. Entregar métrica racial por balizas moleculares em células por meio de microparião e imaginar transcritos de RNA individuais por microscópio fluorescente.