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Artigo de método

Recuperação cirúrgica, isolamento e

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DOI:

10.3791/51597

⸱

30 de abril de 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology, Immunology & Cell Biology, Southern Illinois University School of Medicine, 2Division of Orthopaedics and Rehabilitation, Department of Surgery, Southern Illinois University School of Medicine, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Biomedical Engineering Program, Southern Illinois University Carbondale, 4University of Illinois at Springfield

Neste artigo

Resumo

Para aplicações futuras como um remendo para reparar ruptura parcial do ligamento cruzado anterior (LCA), LCA humano células derivadas foram isolados a partir de tecidos obtidos durante procedimentos reconstrutivos, expandidas in vitro e cultivados em engenharia de tecidos andaimes. Adesão celular e morfologia foi então realizada para confirmar a biocompatibilidade na superfície andaime.

Resumo

Prejuízo para o ACL é um problema comumente encontrado em indivíduos ativos. Mesmo lágrimas parciais deste intra-articular do ligamento do joelho levam a deficiências biomecânicas que prejudicam a função e estabilidade. As opções atuais para o tratamento das lesões do LCA parciais vão desde, o tratamento conservador não cirúrgico para várias opções cirúrgicas, tais como: modificação térmica, reparação de um único pacote, a reconstrução completa, ea reconstrução da parte danificada do ligamento nativo. Poucos estudos, se houver, têm demonstrado um método único para a gestão a ser consistentemente superior, e, em muitos casos, os pacientes continuam a demonstrar instabilidade persistente e outras co-morbidades.

O objetivo deste estudo é identificar a fonte de células potencial de utilização no desenvolvimento de um patch de engenharia de tecidos que podem ser implementadas na reparação de uma ACL parcialmente rasgada. Um novo protocolo foi desenvolvido para a expansão de células derivadas de patients submetidos a reconstrução do LCA. Para isolar as células, tecidos HACL picada obtida durante a reconstrução ACL foi digerido numa solução de colagenase. A expansão foi realizada utilizando um meio de DMEM/F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina (P / S). As células foram então armazenadas a -80 ° C ou em azoto líquido num meio de congelamento que consiste em DMSO, de FBS e o meio de expansão. Após descongelação, as células derivadas HACL foram então semeados em um andaime de engenharia de tecidos, PLAGA (ácido láctico-co-glicólico poli) e controlo de cultura de tecidos de poliestireno (TCPS). Após 7 dias, SEM foi realizada para comparar a adesão celular à PLAGA versus o controlo TCPS. Morfologia celular foi avaliada utilizando técnica de imunofluorescência. SEM (Scanning Electron Microscope) micrografias demonstraram que as células cresceram e respeitados em ambas as superfícies plaga e PFC e foram confluentes sobre as superfícies inteiras por dia 7. Imunofluorescência mostrou morfológico normal, não-estressadospadrões AL em ambas as superfícies. Esta técnica é promissora para aplicações em LCA regeneração e reconstrução.

Introdução

O ligamento cruzado anterior (LCA) é um ligamento intra-articular comumente lesionado do joelho. Aproximadamente 200.000 (LCA) são relatados anualmente nos Estados Unidos. Mais de 75% dos pacientes que sofreram lesão do LCA opt para a cirurgia reconstrutiva ortopédico 1,2,3,4. A intervenção cirúrgica é muitas vezes indicada devido a um potencial de cura inerentemente pobre 3. Reconstrução ACL é tipicamente conseguida por meio de um auto-enxerto ou enxerto de tendão. Autotransplante e enxerto representam o padrão ouro para a reconstrução, como eles possuem altas taxas de sucesso, e reparo sutura primária, a outra opção de tratamento, mostrou taxas de falha de até 94% 5,6,7.

Ruptura parcial do ACL representam 10% a 28% de todas as lesões do LCA 8. Em um estudo prospectivo, Noyes et al. Estima-se que 50% dos pacientes com lesões parciais que afetam mais da metade da ACL progrediu para completar ACL insuficiência depois nãotratamento cirúrgico 9. Outros estudos relatam instabilidade persistente e diminuição da função com menos de 30% dos pacientes capazes de retornar à sua pré-lesão nível de atividade 9,10,11,12,13. As opções de tratamento são limitadas e incluem modalidades conservadoras, encolhimento térmico do restante ACL, ou a reconstrução do LCA. Recentemente, tem havido um interesse crescente em reparo primário aumentada. Estas técnicas utilizam produtos biológicos para melhorar reparos sutura primária 14. Uma pesquisa recente tentou colher mesenquimais semelhantes HACL derivados de células-tronco para contornar as limitações do enxerto, 31,32 mas a validade e eficácia destas células ainda é desconhecido. A fonte ideal de células para aplicações de engenharia de tecidos parece ser não-mesechymal HACL derivadas de células de fibroblastos.

A pesquisa atual está focada na identificação de um material de matriz adequada e fonte de células para o cadafalso engenharia. É procedimento padrão para um ACL rasgado para ser descartado como suresíduos rgical durante a cirurgia de reconstrução, no entanto, este ligamento danificado pode ser uma fonte de qualidade para a aquisição de células necessárias para desenvolver e melhorar um tecido ideal projetado substituição ACL. Nosso laboratório desenvolveu um protocolo para a expansão in vitro de células derivadas destas HACL colhidas. Usando uma matriz 2D engenharia infundido com células derivadas HACL, criamos um patch que pode potencialmente aumentar o reparo ACL parcial e fortalecer ligamentos rompidos.

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Protocolo

1. Recuperação Cirúrgica

Nota: Uma aprovação IRB foi obtida para coletar o coto do LCA durante a cirurgia de reconstrução do LCA. Isenção IRB foi dado como o coto ACL usado geralmente eram descartados como lixo cirúrgico. 20 pacientes foram usados ​​para coletar o coto do LCA.

  1. Administrar anestesia geral e antibióticos pre-operatórios, conforme o protocolo da instituição para o paciente.
  2. Aplicar torniquete e inflar 100 mg acima da pressão arterial sistólica.
  3. Situar o paciente em decúbito dorsal. Faça uma incisão horizontal ântero-lateral com o joelho em flexão de 30-45 ° para um portal de 5 mm e inserir a trocar artroscópica e câmera na bolsa suprapatelar em 30 °.
  4. Realize uma artroscopia diagnóstica de rotina.
  5. Digite um entalhe e debridar sinóvia membranoso sobre o ACL rasgado.
  6. Use uma máquina de barbear 4,5 mm e ablator para identificar o coto do LCA.
  7. Use um bico de pato reta amargo para coletar SPE múltiplacimens do coto ACL restantes.
  8. Manter a amostra em solução salina normal, num recipiente estéril.
  9. Enviar amostras de patologia para decodificação e entrega final para a instalação do laboratório.
  10. Recuperar paciente e executar cuidados pós-operatórios, conforme o protocolo da instituição.

2. Digestão do tecido e HACL Isolamento

  1. Transferir o tecido de leishmaniose humana recebido de patologia para uma placa de Petri com solução salina estéril / PBS (Tampão fosfato salino).
  2. Picar o tecido, utilizando uma tesoura esterilizada em 1-2 mm 3 pedaços e lavar o tecido moído com uma solução salina, pelo menos, 3 vezes.
  3. Digerir o tecido moído com 0,4% de colagenase em DMEM/F-12 (50/50, 1x), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de Penicilina / Estreptomicina para 4-6 horas a 37 ° C.
  4. Centrifugar as células a 1000 g durante 5 min e, em seguida, voltar a suspender as células no meio.
  5. Lavar as células com o meio de 2-3 vezes e, em seguida, seed / cultura na T-25 frascos para 2-3 dias.

3. Expansão celular, congelamento e descongelamento

  1. Use de um microscópio de luz para visualizar as células em cultura durante 2-3 dias num frasco T-25.
  2. Manter as células a 37 ° C no DMEM/F-12 (50/50, 1x), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de Penicilina / Estreptomicina (P / S).
    Nota: Altere a mídia quando as células mostram adesão e morfologia normal. Use de um microscópio de luz para observar as células.
  3. Lave as células confluentes com PBS no dia 7 (~ 1,3 X 10 6 células / frasco). Adicionar tripsina (0,5 g / L) e incuba-se as células a 37 ° C durante 5 min. Adicionar mídia para células em suspensão para neutralizar a tripsina. Divida a mistura de células de mídia entre três T-25 frascos.
  4. Lave as células confluentes com PBS, adicionar tripsina (0,5 g / L), e ressuspender-los em meio contendo DMSO a congelação, de FBS e o meio completo (DMEM/F-12 Médio + FBS a 10% + 1% P / S) no proporção 01:02:07.
  5. Lojaos frascos criogénicos a -80 ° C, se as células serão usados ​​dentro de um mês, e em azoto líquido, se as células será armazenada por períodos mais longos.
  6. Descongelar os frascos num banho de água a 37 C ° para reutilização.
    Nota: Normalmente as células 90-95% sobreviver.

4. Fabricação de engenharia de tecidos 2-D Poly láctico-co-glicólico Ácido (PLAGA) Scaffold

  1. Dissolve-se 1 g de PLAGA em 12 ml de diclorometano num frasco de cintilação de 20 ml e vortex a solução durante 8 horas a uma velocidade constante (800 rpm).
    Nota: A descrição detalhada em 15 de Gupta et al.
  2. Transferir a solução dissolvida a uma placa de Petri de vidro forrado com papel de proteção fluorados.
  3. Colocar a placa de Petri, sob uma câmara de vácuo durante 30 min. Deixar a placa de Petri, a -20 ° C durante a noite e, em seguida, à temperatura ambiente. Colocar as placas de Petri em liofilizador para assegurar a completa evaporação do solvente para obtenção de películas finas de polímero.
  4. Coloque o fi polímerolms num exsicador durante 24 horas.
  5. Cortar os filmes de polímeros em 12 mm de diâmetro discos circulares e armazená-los num exsicador até ser necessário.

5. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

  1. Lavar as células (50.000 células / disco) semeado na TCPS controle eo andaime PLAGA com PBS sete dias posteriores à semeadura.
  2. Use 1,5% de glutaraldeído em tampão cacodilato 0,1 M para corrigir as células e 2,5% OsO 4 em tampão cacodilato 0,1 M para a pós-fixação.
  3. Lave as células fixadas com tampão de cacodilato 0,1 M. Secam-se as células fixadas utilizando desidratação série etanol (50%, 70%, 80%, 90% e 100%) durante 15 min cada, e ainda mais seco em hexametildisilazano (HMDS) durante a noite.
  4. Ventilação da câmara de SEM sistema de revestimento por pulverização com válvula de botão e levantar a placa superior.
  5. Coloque as amostras secas na câmara. Abaixe a placa superior.
  6. Desligue o botão de controle para a bomba para começar a evacuar a câmara.
  7. Válvula de escape aberta árgon. Esperepara o vácuo cair para 0,05 mbar.
  8. Brasão das amostras secas com uma camada fina (0,13 nm) de ouro / paládio.
  9. Retorne a válvula de escape de argônio para sua posição fechada.
  10. Desligue o botão de controle para fora.
  11. Alivie a câmara com válvula de botão e levantar a placa superior.
  12. Remover as amostras e armazená-los em um dessecador por 24 horas.
  13. Observe as amostras sob um microscópio eletrônico de varredura.

6. Imunofluorescência Coloração

  1. Lavar as células (50.000 células / disco) semeado na TCPS controle eo andaime PLAGA com PBS sete dias posteriores à semeadura.
  2. Fixar as células com 70% de etanol (frio) por 10 min.
  3. Incubar as células fixas à temperatura ambiente com 1% de Albumina de Soro Bovino (BSA) em PBS com 0,05% de Triton X-100 durante 20 min.
  4. Mergulhar as amostras em 1% de Tween à temperatura ambiente durante 20 min.
  5. Adicionar monoclonal de ratinho anti-actina-β anticorpo (1:400) e incuba-se as células OvernighT, a 4 ° C.
  6. Lavar as células com 0,05% de Tween. Adicionar anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-rato F (ab ') 2 fragmentos de IgG conjugado com uma sonda fluorescente, 1:400) para as células e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente.
  7. Lavar as células com PBS. Mancha as células com mancha nuclear e montar usando 80% de glicerol.
  8. Observe as células em um microscópio confocal.

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Resultados

O modelo de trabalho para recuperação cirúrgica, a digestão do tecido e isolamento do ser humano Ligamento Cruzado Anterior (HACL) células derivadas é mostrado na Figura 1. As células migraram de explantes e aderiu à T-25 frascos. Estas células foram cultivadas durante 3 dias e, em seguida, foram visualizados sob um microscópio de luz (Figura 2). Uma monocamada confluente foi obtido no dia 7. A presença de células viáveis, saudáveis ​​indicou a recuperação bem sucedida e a cultura de cé...

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Discussão

O objetivo principal deste estudo andaime hACL/2D era usar as células obtidas em um patch para aumentar o reparo primário de lágrimas ACL parciais. Tratamento não-cirúrgico de lesões do LCA parciais podem incluir um curto período de imobilização, órtese, um programa de reabilitação progressiva, e as avaliações de acompanhamento regulares 13,16,17. No entanto, muitos estudos mostraram que o tratamento conservador em atletas tem sido associado com resultados pobres e falha. Buckley et al. Avaliaram 25 ...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer do fundo e departamento de cirurgia bolsa de pesquisa da Southern Illinois University, School of Medicine start-up; ea concessão Memorial Medical Foundation.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de PetriFisher Scientific08-757-103C
Phosphate Buffered Saline (PBS)Fisher ScientificBP3994
CollagenaseGibco17018-029Armazenar em 4 ° C
DMEM/F-12Cellgro10-092-CVLoja em 4 °C. Quente em 37 ° C banho-maria antes de usar.
Soro Fetal Bovino (FBS)Gibco10082Armazenar em -80 ° C
Penicilina / EstreptomicinaLonza17-602ELoja em 4 &# 176; C
Tubos de centrífuga - 15 mlCorning430790
Frascos T-25 BDFalcon3013
Mistura de tripsina-versenaLonza17-161EArmazene em 4 °C. Quente em 37 ° C banho-maria antes de usar.
DMSOFisher ScientificBP231-100Líquido combustível. Pode causar irritação na pele, nos olhos e nas vias respiratórias.
Frascos criogênicosCorning430489
PLAGAPurac BiomaterialsPurasorb PLG8523Store em -80 ° C
Discos TCPSFisher Scientific12-545-82
DiclorometanoFisher ScientificAC36423-0010Possível risco de câncer. Armazene em local seco e fresco.
de cintilação de plástico de desempenho Saint gobinpapel Bytac1420652 Fisher
Scientific03-339-21G
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma AldrichA7906Loja em 4 ° C
Tween FisherScientificBP337-500
anticorpo anti-β-actina de camundongo (1° Ab)Sigma AldrichA5441Store em -20 &# 176; Anticorpo
anti-camundongo de cabra C (2° Ab)Sinalização Celular4408Armazenar em -20 &# 176; C
Hoechst coranteSigma Aldrich14530Loja em -20 ° C
GlicerolFisher ScientificBP229-1
GlutaraldeídoFisher ScientificBP2547-1Tóxico por inalação e se ingerido. Causa queimaduras por todas as vias de exposição.
HexametildisilazaneFisher ScientificAC43085-1000Líquido e vapor inflamáveis. Causa queimaduras por todas as vias de exposição.
Tesoura EstérilMcKesson25-716
CentrífugaEppendorf5804R
Microscópio de LuzOlympusCK40
Banho-mariaThermo scientific2845
VortexLabnetVX-200
Placas de Petri de vidrofisher ScientificS31473
Acu-PunchAcuderm Inc.P1225Acu-Punch foi usado para cortar discos de 12 mm
Tampão cacodilatoSigma Aldrich97068Líquido inflamável, cancerígeno e irritante.
Tetraóxido de ósmioSigma Aldrich201030Altamente tóxico
Triton X-100Sigma AldrichT8787Nocivo se ingerido
EtanolDecon Labs2705Mantenha longe do calor, faíscas, chamas e outras formas de ignição.
Anestesia geral/regionalAmphastar produtos farmacêuticos1% Lidocaína, 0,25% Bupivacaína, agentes anestésicos para indução e manutenção
AntibióticosHospira0409-0805-01Ancef 1 g i.v.
Trocarte de artroscopiaSmith e sobrinho
Câmera de artroscopiaSmith e sobrinho
Pinça artroscópica e amargoBarbeador Arthrex
4,5 mmArthrex
Parafusosde aço inoxidávelArthrex
Sputter CoaterPolaronE5400
Frasco de Parafusos de interferência

Referências

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