Este protocolo descreve um procedimento para amostragem seriada da medula óssea (MO) femoral sem exigir o sacrifício de camundongos. Este procedimento facilita estudos longitudinais da composição da MO de camundongos ao longo do tempo e fornece acesso serial às células dentro da MO para estudos ex vivo e de transplante.
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Artigo de método
Femoral Medula Óssea aspiração Live Ratos
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Resumo
Resumo
A amostragem seriada da composição celular da medula óssea (MO) é um procedimento de rotina crítico para a hematologia clínica. Este protocolo descreve um procedimento técnico detalhado passo a passo para um procedimento análogo em camundongos vivos que permite a caracterização seriada das células presentes na MO. Este procedimento facilita estudos destinados a detectar a presença de células administradas exogenamente dentro da MO de camundongos, como seria feito em estudos de xenoenxerto, por exemplo. Além disso, este procedimento permite a recuperação e caracterização de células enriquecidas na MO, como células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs), sem sacrifício de camundongos. Dado que a composição celular do sangue periférico não reflete necessariamente as proporções e tipos de células-tronco e progenitoras presentes na medula, os procedimentos que fornecem acesso a esse compartimento sem exigir a terminação dos camundongos são muito úteis. O uso da aspiração da medula óssea femoral é ilustrado aqui para análise citológica de células da medula, caracterização por citometria de fluxo do compartimento tronco hematopoiético/progenitor e cultura de HSPCs selecionadas obtidas por aspiração femoral de MO em comparação com a coleta convencional de medula.
Introdução
Todas as células sanguíneas são derivadas de células-tronco hematopoiéticas (HSCs). Procedimentos que permitem o acesso à medula óssea (MO), local da grande maioria das CTHs em camundongos e homens, sem exigir o sacrifício de animais, fornecem um recurso para monitorar a fonte de hematopoiese em série. O objetivo geral do procedimento descrito aqui é fornecer um protocolo detalhado para a amostragem de células BM do fêmur de camundongos vivos que forneça material representativo das células que seriam recuperadas pela colheita convencional de células BM por meio do sacrifício dos camundongos. A vantagem desse procedimento sobre a coleta convencional de células MO é que esse procedimento não requer o sacrifício de camundongos e, portanto, permite o estudo longitudinal do compartimento da medula óssea de camundongos ao longo do tempo.
Embora este procedimento de aspiração de medula óssea murina tenha sido usado em vários estudos e descrito anteriormente (ver Sundberg et al. Para uma revisão histórica1), procedimentos formais passo a passo que ilustram essa técnica não foram publicados anteriormente. Este protocolo permite a amostragem seriada de rotina da MO para fins como a avaliação do enxerto na MO de células introduzidas exogenamente no camundongo (como seria feito em estudos de xenoenxerto, por exemplo, 2,3), análise do quimerismo na MO para comparação com o sangue periférico (onde os resultados não são necessariamente congruentes), monitoramento da abundância de tipos específicos de células normalmente enriquecidas na medula, como células-tronco hematopoiéticas e progenitoras, e recuperação de células MO para cultura ex vivo e/ou transplante. Além disso, a avaliação do conteúdo da medula pode ser muito útil em modelos murinos de doença hematológica, pois a aspiração é útil na avaliação da carga de doença hematológica em momentos em que a doença pode não ser evidente no sangue periférico3-5. Além disso, essa técnica pode ser usada para avaliar a resposta da doença hematológica na medula a drogas administradas em estudos terapêuticos. Assim, o procedimento descrito aqui é ideal para investigadores que desejam obter acesso a células hematopoiéticas da medula óssea de camundongos para análise citológica, análise de citometria de fluxo, cultura in vitro e/ou estudos de transplante in vivo sem exigir sacrifício ou dano aos camundongos.
O protocolo de amostragem de MO aqui descrito é bastante semelhante à técnica utilizada para injeção intrafemoral de material diretamente na cavidademedular3,6. A principal diferença é que este protocolo detalha o procedimento para remoção de células da medula, em vez de instilar material diretamente no espaço da cavidade da medula, como é feito com a injeção intrafemoral.
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Protocolo
Todos os procedimentos com animais descritos neste protocolo foram conduzidos de acordo com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Animal Care e Use Comitê Institucional (IACUCs) no Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.
1. Aspiração de medula óssea (BM) As células do Fêmur
- Anestesiar o rato que passará por aspiração da medula óssea do fêmur com isoflurano (1-4%) administrado com um vaporizador de precisão. Profundidade da anestesia deve ser monitorada a cada 5-10 min durante todo o procedimento por meio da observação de que não há nenhuma alteração na taxa respiratória associada à manipulação cirúrgica e / ou ouvido, do dedo do pé, e a cauda de aperto. A anestesia é induzida com isoflurano e também mantida durante todo o procedimento com isoflurano. Uma dose pré-processual de preferência de buprenorfina a uma dose de 0,05-0,1 mg / kg por via subcutânea a cada 6-12 horas pode ser usado para prevenir a dor associada com o processo como um adjUNCT ao carprofeno.
- Aplicar pomada oftálmica para os olhos do rato após a indução da anestesia para evitar o ressecamento da córnea.
- A pele é cuidadosamente cortado a partir de uma área de pele de cerca de 150% maior do que a área do local da aspiração pretendido. Pele frouxa é removido com uma gaze úmida. Por favor, mantenha o mouse sobre uma almofada de água quente circulando ou outra superfície segura termóstato para evitar hipotermia durante o procedimento.
- Desinfetar toda a perna contendo o fêmur, que passará por aspiração com três conjuntos de scrubs alternada (alternando com qualquer um iodopovidona (Betadine) ou um de clorexidina (Nolvasan) esfoliação e 70% de álcool isopropílico ou 70% de etanol embebido esponjas de gaze).
- Umedeça um 0,5 ml de tuberculina Seringa (volume: 0,5 cc; bitola: 27,5 g) com tampão fosfato estéril (PBS), antes de aspirar o BM. Encha a seringa com 200-500 mL de PBS e expulsar imediatamente o PBS. Repita este procedimento 2-3 times.
- Manter a tíbia dobrada do fémur, empurrando a tíbia ou com o dedo ou do quinto dedo. Confirme se um plano anestésico adequado foi atingido. A seringa é realizada utilizando o polegar e o dedo indicador. Isto permite que os côndilos a ser expostos e facilita a inserção da agulha.
- Depois de molhar a seringa inserir a agulha através do tendão patelar, de modo que a agulha é apresentada de forma segura entre os dois côndilos do fémur. Mantendo a diáfise próxima da epífise do fémur com o polegar eo dedo indicador, a agulha é inserida no eixo do fémur facilmente.
- Rodar a agulha para fora e para cima, de modo que é paralelo com o eixo do fémur. Esta acção facilita a recuperação do conteúdo de medula óssea a partir do eixo do fémur.
- Gire o agulha e anti-horário, enquanto empurrando-o lentamente na cavidade da medula do fêmur. Confirme o correto posicionamento da agulha movendo suavemente a syRinge lateralmente.
- Com cuidado, puxe o êmbolo agulha para trás, criando uma pressão negativa, enquanto movendo a agulha para trás e para a frente dentro da cavidade BM. Nota: O volume da BM aspirado será de aproximadamente 5 mL, que corresponde tipicamente a 0,4-0,8 x 10 6 células mononucleares. Aspiração bem sucedida será confirmado visualmente pelo aparecimento de sangue no topo da agulha na base da seringa. Se o sangue não é visto na seringa, é provável que um fragmento de osso ou tecido pequena está preso no interior da agulha. Este pode ser retirado a partir da agulha, movendo o êmbolo para cima e para baixo em PBS (este é uma razão para que a seringa deve ser previamente cheio com PBS antes de aspirar a BM). Se o tecido não pode ser desalojado da seringa, usar uma nova agulha e seringa (de novo molhar a seringa com 200-500 ul de PBS).
- Uma vez BM é aspirado com sucesso a partir do fêmur, retire a agulha e seringa do fêmur e mouse.
- Mover aspirado BM para um pr microtuboefilled com 500 ul de PBS. Para a maioria das aplicações, as células BM deve, então, ser mantido no gelo até o processamento, se possível.
- Após a conclusão do procedimento, administrar analgésico com carprofeno 5 mg / kg por via subcutânea. Em seguida, retire do mouse da anestesia e coloque em uma almofada aquecida até que esteja totalmente recuperado. NOTA: Não deve haver nenhuma complicação ou angústia experimentada após o procedimento de aspiração, se feito corretamente.
- Antes de devolver os ratos para a área de habitação, garantir que eles são capazes de atingir e deambular comida e água. Observe os ratos para detectar sinais de perigo ou procedimento pós infecção no próximo 24 horas. Os sinais incluem: sangramento constante, anemia, letargia. Se algum destes sinais são vistos após o procedimento, o animal (s) devem ser sacrificados. Nota: BM aspiração / amostragem pode ser repetida, mas o procedimento de repetição devem ser realizadas sobre o fémur oposta para prevenir o trauma repetido da mesma perna. Há pouca informação disponível sobre o frequency essa aspiração BM pode ser realizada. Aspiração da medula óssea do fêmur é geralmente repetida não mais frequentemente do que a cada 2 semanas.
2. Avaliação do conteúdo celular em Aspirado BM Células
- Células de pellets obtidos a partir BM aspiração e coloque em um tubo de microcentrífuga por centrifugação a 300 xg por 5 min a 4 ° C ou RT.
- Aspirar o sobrenadante e, em seguida, voltar a suspender o sedimento em 500 ul de sangue vermelho ACK tampão de lise celular (tamp de lise "de amónio-cloreto de potássio").
- Incubar as células em tampão de lise de glóbulos vermelhos, durante 10 min e em seguida adicionar 1 ml de PBS e girar novamente a mistura a 300 xg por 5 min a 4 ° C ou TA. Nota: Os sedimentos de lise de glóbulos vermelhos é agora constituído por células mononucleares do BM. Estes podem ser ressuspendidos em coloração de FACS, a contagem das células, o transplante, a análise de citospina e / ou qualquer outra utilização (tal como células de MO colhidas a partir de ratinhos sacrificados seria utilizado).
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Resultados
Femoral BM aspiração de um rato C57/B6 vivo foi utilizado para obter as células mononucleares, seguido de colheita de BM BM convencional do mesmo rato, após sacrifício. Células mononucleares BM obtidos pelos dois métodos foram então analisadas por (1) análise citológica de células BM, (2) determinar a freqüência relativa das células-tronco / progenitoras hematopoiéticas (HSPCs), e (3) ex vivo cultura de HSPCs ordenados. No último ensaio, Sca1 linhagem negativa + c-kit + células (LSK) foram classificadas a parti...
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Discussão
Serial aspiração BM é um procedimento de rotina fundamental para investigação clínica de distúrbios hematológicos em seres humanos. A capacidade de executar uma série de amostragem análoga do BM em ratos para a caracterização da composição celular e componentes da BM em todo longas experiências é também muito valioso. Este processo é útil para a caracterização de HSPC de sem sacrificar o rato, mas também para detectar a presença de tipos de células adicionais na BM nos casos em que o conteúdo do sangue periférico não po...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
O.A.-W. é apoiado por um Prêmio de Investigador Clínico NIH K08 (1K08CA160647-01), um Prêmio de Pós-Doutorado do Departamento de Defesa dos EUA em Pesquisa de Falha da Medula Óssea (W81XWH-12-1-0041), o Programa de Investigadores Josie Roberston e um Prêmio de Investigador Clínico Damon Runyon com o apoio da Fundação Evan.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| PBS | PAA | H15-002 | |
| Albumina de soro bovino | PAA | K41-001 | |
| ACK tampão de lise | Caseiro | em 1 L. Ajuste o pH 7,2 ~ 7,4 e filtre estéril com 0,22 μ M filtro de vácuo. | |
| 8.3 g de cloreto de amônio | Fisher Scientific | A661-500 | |
| 1 g de bicarbonato de potássio | Fisher Scientific | P184-500 | |
| 200 μ l 0,5 M EDTA pH 8 | Gibco | 15575-038 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| Seringa de tuberculina de 0,5 ml 27,5 G | Becton Dickinson | 305620 | |
| Filtro de células estéreis 70 μ m | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Isoflurano, USP | Attane | NDC:66794-014-25 | |
| Agulha de ponta romba | Stemcell Technologies | 28110 | |
| Agulha PrecisionGlide 23 G | Becton Dickinson | 305193 | |
| Seringa de 3 ml Ponta Luer-Lok Becton | Dickinson | 309657 | |
| Placa não tratada para cultura de tecidos, 6 Poços | Becton Dickinson | 351146 | |
| 12 x 75 mm tubos de 5 ml | Coloração Becton Dickinson | 352054 | FACS 12 |
| x 75 mm tubos de 5 ml com tampa do filtro de células | Coloração Becton Dickinson | 352235 | FACS coloração |
| NK1.1 APC-Cy7 | Biolegend | 108723 | |
| CD11b APC-Cy7 | Biolegend | 101225 | |
| CD45R (B220) APC-Cy7 | Biolegend | 103223 | |
| CD3 APC-Cy7 | Biolegend | ||
| Ly-6G e Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7 | Biolegend | 108423 | |
| Ter119 APC-Cy7 | Biolegend | 116223 | |
| CD19 APC-Cy7 | Biolegend | 302217 | |
| CD4 APC-Cy7 | BioLegend | 317417 | |
| CD117 (c-KIT) PE | BioLegend | 105808 | |
| Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7 | Biolegend | ||
| CD34 APC | Biolegend | 128612 | |
| CD16 / 32 e450 | eBioscience | 48-0161-82 | |
| DAPI (4′, 6-Diamidino-2-fenilindol dicloridrato) | Sigma-Aldrich | 32670 | |
| MethoCult GF M3434 | STEMCELLTECHNOLOGIES | 3434 | Para cultura de metocelulose |
| Carprofeno | Crescent Chemical Empresa | C11045850 | 1 dose (5mg/kg) |
| Citômetro de fluxo, LSRFortessa | Becton Dickinson | ||
| Puralube vet pomada (pomada oftálmica de petrolato estéril) | Dechra-US | 17033-211-38 |
Referências
- Sundberg, R., Hodgson, R. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, 557-561 (1949).
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- Warner, J. K., et al. Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells. Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).
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Reimpressões e permissões
