Femoral Medula Óssea aspiração Live Ratos

Resumo

Este protocolo descreve um procedimento para amostragem seriada da medula óssea (MO) femoral sem exigir o sacrifício de camundongos. Este procedimento facilita estudos longitudinais da composição da MO de camundongos ao longo do tempo e fornece acesso serial às células dentro da MO para estudos ex vivo e de transplante.

Resumo

A amostragem seriada da composição celular da medula óssea (MO) é um procedimento de rotina crítico para a hematologia clínica. Este protocolo descreve um procedimento técnico detalhado passo a passo para um procedimento análogo em camundongos vivos que permite a caracterização seriada das células presentes na MO. Este procedimento facilita estudos destinados a detectar a presença de células administradas exogenamente dentro da MO de camundongos, como seria feito em estudos de xenoenxerto, por exemplo. Além disso, este procedimento permite a recuperação e caracterização de células enriquecidas na MO, como células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs), sem sacrifício de camundongos. Dado que a composição celular do sangue periférico não reflete necessariamente as proporções e tipos de células-tronco e progenitoras presentes na medula, os procedimentos que fornecem acesso a esse compartimento sem exigir a terminação dos camundongos são muito úteis. O uso da aspiração da medula óssea femoral é ilustrado aqui para análise citológica de células da medula, caracterização por citometria de fluxo do compartimento tronco hematopoiético/progenitor e cultura de HSPCs selecionadas obtidas por aspiração femoral de MO em comparação com a coleta convencional de medula.

Introdução

Todas as células sanguíneas são derivadas de células-tronco hematopoiéticas (HSCs). Procedimentos que permitem o acesso à medula óssea (MO), local da grande maioria das CTHs em camundongos e homens, sem exigir o sacrifício de animais, fornecem um recurso para monitorar a fonte de hematopoiese em série. O objetivo geral do procedimento descrito aqui é fornecer um protocolo detalhado para a amostragem de células BM do fêmur de camundongos vivos que forneça material representativo das células que seriam recuperadas pela colheita convencional de células BM por meio do sacrifício dos camundongos. A vantagem desse procedimento sobre a coleta convencional de células MO é que....

Protocolo

Todos os procedimentos com animais descritos neste protocolo foram conduzidos de acordo com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Animal Care e Use Comitê Institucional (IACUCs) no Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.

1. Aspiração de medula óssea (BM) As células do Fêmur

1. Anestesiar o rato que passará por aspiração da medula óssea do fêmur com isoflurano (1-4%) administrado com um vaporizador de precisão. Profundidade da anestesia deve ser monitorada a cada 5-10 min durante todo o procedimento por meio da observação de que não há nenhuma alteração na taxa respiratória associada à ....

Resultados

Femoral BM aspiração de um rato C57/B6 vivo foi utilizado para obter as células mononucleares, seguido de colheita de BM BM convencional do mesmo rato, após sacrifício. Células mononucleares BM obtidos pelos dois métodos foram então analisadas por (1) análise citológica de células BM, (2) determinar a freqüência relativa das células-tronco / progenitoras hematopoiéticas (HSPCs), e (3) ex vivo cultura de HSPCs ordenados. No último ensaio, Sca1 linhagem negativa + c-kit + células (LSK) foram classificadas a parti.......

Discussão

Serial aspiração BM é um procedimento de rotina fundamental para investigação clínica de distúrbios hematológicos em seres humanos. A capacidade de executar uma série de amostragem análoga do BM em ratos para a caracterização da composição celular e componentes da BM em todo longas experiências é também muito valioso. Este processo é útil para a caracterização de HSPC de sem sacrificar o rato, mas também para detectar a presença de tipos de células adicionais na BM nos casos em que o conteúdo do sangue periférico não po.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
PBS	PAA	H15-002
Albumina de soro bovino	PAA	K41-001
ACK tampão de lise	Caseiro		em 1 L. Ajuste o pH 7,2 ~ 7,4 e filtre estéril com 0,22 μ M filtro de vácuo.
8.3 g de cloreto de amônio	Fisher Scientific	A661-500
1 g de bicarbonato de potássio	Fisher Scientific	P184-500
200 μ l 0,5 M EDTA pH 8	Gibco	15575-038
RPMI 1640	PAA	E15-842
Seringa de tuberculina de 0,5 ml 27,5 G	Becton Dickinson	305620
Filtro de células estéreis 70 μ m	Fisher Scientific	22363548
Isoflurano, USP	Attane	NDC:66794-014-25
Agulha de ponta romba	Stemcell Technologies	28110
Agulha PrecisionGlide 23 G	Becton Dickinson	305193
Seringa de 3 ml Ponta Luer-Lok Becton	Dickinson	309657
Placa não tratada para cultura de tecidos, 6 Poços	Becton Dickinson	351146
12 x 75 mm tubos de 5 ml	Coloração Becton Dickinson	352054	FACS 12
x 75 mm tubos de 5 ml com tampa do filtro de células	Coloração Becton Dickinson	352235	FACS coloração
NK1.1 APC-Cy7	Biolegend	108723
CD11b APC-Cy7	Biolegend	101225
CD45R (B220) APC-Cy7	Biolegend	103223
CD3 APC-Cy7	Biolegend
Ly-6G e Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7	Biolegend	108423
Ter119 APC-Cy7	Biolegend	116223
CD19 APC-Cy7	Biolegend	302217
CD4 APC-Cy7	BioLegend	317417
CD117 (c-KIT) PE	BioLegend	105808
Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7	Biolegend
CD34 APC	Biolegend	128612
CD16 / 32 e450	eBioscience	48-0161-82
DAPI (4′, 6-Diamidino-2-fenilindol dicloridrato)	Sigma-Aldrich	32670
MethoCult GF M3434	STEMCELLTECHNOLOGIES	3434	Para cultura de metocelulose
Carprofeno	Crescent Chemical Empresa	C11045850	1 dose (5mg/kg)
Citômetro de fluxo, LSRFortessa	Becton Dickinson
Puralube vet pomada (pomada oftálmica de petrolato estéril)	Dechra-US	17033-211-38

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