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Artigo de método

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

12.9K vistas

⸱

DOI:

10.3791/51669

⸱

6 de agosto de 2014

 ,  , 
1Light Microscopy Core Facility, NHLBI/NIH, 2Hematology Branch, NHLBI/NIH

Neste artigo

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Resumo

Combinatória 5 proteínas fluorescentes marcação de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas permite in vivo de rastreamento via clonal confocal e microscopia de dois fótons, fornecendo insights sobre medula óssea hematopoiética arquitetura durante a regeneração. Este método permite o mapeamento destino não-invasivo de espectro codificados células hspCs derivados em tecidos intactos por longos períodos de tempo após o transplante.

Resumo

Nós desenvolvida e validada uma metodologia de marcação para rastreamento clonal de células tronco e progenitoras hematopoéticas (hspCs) com alta resolução espacial e temporal para estudar in vivo hematopoiese usando o transplante de medula óssea de camundongos modelo experimental fluorescente. Marcação usando lentivirais que codificam proteínas fluorescentes (FPS) combinatória genética permitem o mapeamento do destino da célula através de imagens de microscopia avançada. Vetores que codificam cinco PQ diferentes: Cerulean, EGFP, Vênus, tdTomato e mCherry foram utilizados para a transdução simultaneamente hspCs, criando uma paleta variada de cores de células marcadas. Imagem por microscopia confocal híbrido / two-photon permite a avaliação alta resolução simultânea de células marcadas com exclusividade e seus descendentes em conjunto com os componentes estruturais dos tecidos. Análise volumétrica ao longo de grandes áreas revelam que as células derivadas de HSPC espectralmente codificados podem ser detectados de forma não invasiva, em vários tecidos intactos, incluindo a medula óssea (BM), Por extensos períodos de tempo a seguir ao transplante. Estudos ao vivo combinando multiphoton taxa de vídeo e confocal de imagem time-lapse em 4D demonstrar a possibilidade de rastreamento de celular e dinâmica clonal de uma forma quantitativa.

Introdução

A produção de células sanguíneas, denominado hematopoiese, é mantida por uma pequena população de células estaminais e progenitoras hematopoéticas (hspCs). Estas células residir dentro da medula óssea (BM) em um nicho microambiental complexo que consiste em osteoblastos, células do estroma, tecido adiposo e estruturas vasculares, todos implicados no controlo da auto-renovação e diferenciação 1,2. Como intacta BM tem sido tradicionalmente inacessível para observações diretas, as interações entre HSPC e seu microambiente permanece em grande parte não caracterizada in vivo. Anteriormente, nós estabelecemos uma metodologia para visualizar a arquitetura 3D da BM intacto usando microscopia de fluorescência confocal e reflexão 3. Foram caracterizados expansão de hspCs EGFP-marcados na MC, mas o uso de apenas um único FP impedida análise de regeneração a um nível clonal. Muito recentemente, aproveitou a Lentivirus Gene Ontology (Lego) vetores expressando constitutivamente flproteínas uorescent (FPS) para marcar de forma eficiente as células 4,5. A co-transdução de HSPC com três ou cinco vectores gera uma paleta de cores diversas combinatórias, permitindo a localização de vários clones de HSPC individuais.

Marcado HSPC combinado com nova tecnologia de imagem permitido traçar homing indivíduo HSPC e enxerto na BM de ratos irradiados. Vetores Lego foram usadas para marcar HSPC com 3 ou 5 fps diferentes (de Cerulean, eGFP, Vênus, tdTomato e mCherry) e seguir o seu enxerto ao longo do tempo na BM por microscopia confocal e dois fótons, que permite a visualização nítida de ossos e outros estruturas de matriz, e a relação de clones HSPC de componentes do seu microambiente. HSPC foram purificados como a linhagem de células negativas de camundongos C57BL / 6 BM, transduzidas com vetores de Lego, e infundidas por injeção na veia da cauda em ratos congênitas ablated-mielo. Através do monitoramento de grandes volumes de tecido esterno BM visualizamos o enxerto intra-ósseo que ocorre no inícioBM regeneração. Grupos de células com espectros cor diversificada, parece, inicialmente, em estreita proximidade com o osso e progrediu centralmente ao longo do tempo. Curiosamente, após mais de 3 semanas, a medula consistiu de aglomerados clonais macroscópicas, sugerindo propagação da hematopoiese derivado de hspCs individuais contiguamente na medula, em vez de difusão generalizada de hspCs através da corrente sanguínea. Havia menos diversidade de cores em pontos de tempo de atraso, sugerindo dificuldade na transdução de longo prazo repovoar células com múltiplos vetores.

Além disso, hspCs aglomerados formados no baço, um órgão também responsável para a hematopoiese em ratinhos. Células individuais derivadas de HPSC poderia ser resolvido no timo, nódulos linfáticos, baço, fígado, pulmão, coração, pele, músculo esquelético, tecido adiposo, e renal bem. As imagens em 3D pode ser avaliada qualitativamente e quantitativamente a apreciar a distribuição de células com perturbações mínimas dos tecidos. Por fim, ilustramosd a viabilidade de estudos dinâmicos ao vivo em 4D, combinando multiphoton digitalização ressonante e confocal de imagem time-lapse. Esta metodologia permite que não-invasivo de alta resolução, multidimensional célula-destino traçado do espectro marcados populações de células em sua arquitetura intacta 3D, fornecendo uma ferramenta poderosa no estudo da regeneração de tecidos e patologia.

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Protocolo

Todos os animais foram alojados e tratados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde, e matriculou-se em um protocolo de cuidado e uso NHLBI animal Comitê-aprovado. Feminino B6.SJL-Ptprc (d) pep3 (b) / BoyJ (B6.SJL) e C57BL / 6, machos, 6-12 semanas de idade, foram utilizados como dador e receptor, respectivamente.

Uma lista de materiais, reagentes, e o equipamento é fornecido na Tabela 1.

1. Lego Transdução de Rato hspCs e Transplante de Medula Óssea

Realizar procedimentos descritos abaixo, em um nível de biossegurança certificada 2 (BSL-2) gabinete (cultura de tecidos Hood).

  1. Produção de Lego Vetores Encoding 5fps
    1. Use o lentiviral "Gene Ontology" (Lego) plasmídeos vetor, cada codifica uma FP diferente de um promotor forte SFFV constitutiva, incluindo Lego-Cer2 (Cerulean), Lego-G2 (EGFP), Lego-V2 (Vênus), a Lego-T2 (tdTomato), e lego-C2 (mCherry) gentilmente cedido pelo Dr. Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburgo, Alemanha); agora também disponível a partir Addgene 5-7.
    2. Para produzir vetores de Lego, sementes de 5 x 10 6 células 293T em placas de 10 cm (use 12 pratos para cada vector) 24 horas antes da transfecção em 8 ml de mídia I10 (IMDM suplementado com 10% SFB e glutamina / penicilina / estreptomicina).
    3. Transfecção das células com fosfato de cálcio, utilizando recomendações kit CAPHOS ligeiramente modificados:
      1. Para cada placa de mistura de 15 mg vetor Lego, 12 mg pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 mg PREV-TAT, e 1 mg plasmídeos pMD2.G-VSV-G em presença de 50 mL de 2,5 M CaCl2, e adicione água para obter um volume total de 500 ul.
      2. Plasmídeos de ADN precipitado com 500 ul de 2x HeBS (HEPES-tamponado salino) e incubar durante 20 min à temperatura ambiente antes de se adicionar a cada placa de células 293T.
      3. Incubar as células para6 h num 37 ° C 5% de CO 2 incubadora; remover a mídia e adicionar fresco cultura da mídia pós 6 hr transfecção.
    4. Recolher os sobrenadantes da cultura contendo partículas lentivirais de cada placa, por dia, durante 3 dias. Cada coleção sobrenadante dia seguinte adicionar mídia I10 fresco para cada placa.
      1. Filtrar através de poros de 0,22 um, piscina e concentrar os sobrenadantes por ultracentrifugação num rotor SW28 durante 2 horas a 71.900 xg e 4 ° C.
      2. Ressuspender o sobrenadante em 1 ml de meio StemSpan. Alíquota os estoques lentiv�icos em 200 mL e armazenar a -80 ° C.
  2. Titulação de Lentivirus
    Determinar o título de partículas vetor Lego em sobrenadantes coletados via quantificação de transdução de unidades / ml, utilizando células NIH3T3. Os títulos de permitir o cálculo do volume de cada sobrenadante vector necessária para resultar na desejada relativamente multiplicidade de infecção (MOI) de alvo experimentalcélulas.
    1. Placa de 5 x 10 4 NIH3T3 células por poço (placa de 12 poços) em 2 ml de meio I10 um dia antes da titulação.
    2. Preparar diluições em série de 5 vezes de sobrenadantes contendo vector em meios I10 suplementadas com sulfato de protamina (4 mg / ml é 1.000x).
    3. Remova a mídia das células, e substituir por 500 mL de diluições do sobrenadante contendo o equivalente a 2, 0,8, 0,32 e 0,128 l de vírus concentrado.
    4. Determinar o número (n) de células por poço presentes no momento da transdução, contando também um controlo.
    5. 6 horas após a transdução, adicionar 2 ml de meio de I10 e incubar durante 3 dias a 37 ° C, 5% de CO 2.
    6. Colher as células de cada poço utilizando tripsina-EDTA, e determinar a percentagem de células fluorescentes (FP%) através de citometria de fluxo.
    7. Calcula-se o título como a seguir, a média dos títulos obtidos para cada poço (diluição), resultando num FP% entre 1 e 50%: (título de partículas de vector / ml) = nx% FP / Volume de sobrenadante vetor (ml). Calcule a média dos títulos obtidos para cada diluição, se o FP% é entre 1 e 50%.
  3. Colecção celular Rato, purificação, transdução, e transplantação (mostrado esquematicamente na Figura 1A adaptado de Malide et al. 4).
    1. Sacrifício camundongos doadores por um procedimento aprovado. Colheita de medula óssea de membros anteriores e posteriores: dissecar úmeros, o fémur ea tíbia, completamente remover todos os músculos, ligamentos e excesso de tecido a partir de ossos, corte em todo o final de cada osso mais próximo possível para a articulação, e lave a medula óssea de o osso usando uma agulha G 27-0 em uma seringa contendo mídia I10.
    2. Agregar as células da medula óssea inteiras durante 10 minutos a 500 xg, a 4 ° C e lisar os glóbulos vermelhos duas vezes com 50 ml de tampão ACK. Suspenda as células em 10 ml de meio I10.
    3. Purificar (Lin @) células progenitoras linhagem negativa com o kit de exaustão de acordo com a linhagem MACS Protoco um kit modificadol:
      1. Utilizar 30 ul de microesferas anti-biotina em vez de 10 mL / 10 7 células; concluir as etapas de lavagem com media I2 (IMDM suplementado com 2% de SFB) em vez de tampão.
      2. Insira uma etapa de lavagem entre a incubação com Cocktail Biotina-Antibody ea incubação com anti-biotina MicroBeads; e equilibrar a coluna com I10 em vez de tampão.
    4. Cultura de células Lin @ de 48 horas, a uma densidade de partida de 5 x 10 5 células / ml em meio StemSpan suplementado com 10 ng / ml de IL-3 murina, 100 ng / ml de IL-11 de murino, de 100 ng / ml humano Flt-3 ligando, e 50 ng / factor de células estaminais de murino ml.
    5. Transferência de 1 a 4 x 10 5 células de 12 poços para as placas revestidas com RetroNectin e transdução com sobrenadantes LEGO, cada um com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 6-7 para alcançar 50% de eficiência de expressão para cada FP, na presença de StemSpan meios de comunicação e citocinas detalhado acima e 4 ug / ml de sulfato de protamina.
    6. Transduzir célulascom cada vector LEGO individualmente, conforme descrito no passo 1.3.5 e misturar as células a seguir a transdução (denominado mistura) ou co-transdução de células com todos os sobrenadantes 5 LEGO vector simultaneamente (denominados Co). Remover as células 24 horas depois, lave uma vez com meio StemSpan sem citocinas, e ressuspender-los em mídia StemSpan sem citocinas para o transplante, ou transferi-los para meio fresco com citocinas e cultura durante 96 horas adicionais antes de microscopia confocal e citometria de fluxo.
      1. Realizar o transplante de medula óssea através da infusão transduzidas Lin hspCs através de injecção na veia da cauda em 11 Gy em dose única receptores pré-irradiadas (6-18 horas antes do transplante) destinatários, em um volume de 100 mL, a uma dose de células por ratinho correspondendo a 1 células -4 x 10 5 Lin @ banhado originalmente para a transdução. Em cada experimento, o transplante um grupo inteiro de animais com a mesma população de células transduzidas de doadores BM.
      2. Para a caracterização in vitro de transduzidas HSPEs, a cultura das células para um adicional de 4-5 dias em StemSpan suplementado com citocinas e analisar por citometria de fluxo para a eficiência de transdução, e por microscopia para a diversidade de cores.
        1. Sacrifício camundongos individuais e recuperar tecidos e órgãos para a imagem latente, em vários pontos de tempo até 120 dias pós-transplante.
          1. Spray com etanol a pele do rato e inciso da pele no lado ventral evitar a disseminação de cabelo.
          2. Dissecar e de consumo de acordo com os procedimentos padrão do baço, nódulos linfáticos poplíteos, pulmão, coração, pele, tecido adiposo, o músculo esquelético, rim, fígado, bem como a cabeça para o acesso a calvária.
          3. Como alternativa, use calvaria ou criar uma janela óssea para geração de imagens ao vivo várias vezes ao longo do tempo 2,8,9 ou imagem órgãos superficiais, como os gânglios linfáticos da pele e no animal vivo.
        2. Coloque órgãos individuais em 35 milímetros placas de cultura de número 0 tampa de vidro em 50-10056; l PBS para imagens-los intactos, sem corte, fixação ou processamento adicional, tal como descrito no passo 2.5.
        3. Para imagem volumétrica, manter os órgãos em em PBS frio até o uso. Para imagens de lapso de tempo proceder de imediato a imagens de órgãos em DMEM, 10% FBS contendo HEPES 20 mM a 37 ° C

2. confocal e de dois fótons Microscopia e Análise de Imagem

  1. Realizar imagem usando um microscópio confocal cinco canais e multiphoton sistema Leica SP5 equipado com multi-linha Argon, diodo 561 nm, 594 nm HeNe e HeNe 633 nm lasers visíveis. Use no modo 2-fótons, um femtosegundo pulsada laser de Ti: Safira (Ti-Sa), ajustável para excitação de 680 a 1080 nm com correção de dispersão. Utilização em experiências envolvendo vermelho-deslocado PQ (tdTomato e mCherry), um oscilador paramétrico óptico (OPO) do laser para alargar a gama de comprimentos de onda de saída, tanto quanto 1,030-1,300 nm, sequencialmente ou em simultâneo com o tele Ti-Sa a laser.
  2. Imagem de vários tecidos, utilizando um HCX-IRAPO-L 25X / 0,95 NA objectiva de imersão de água (WD = 2,5 mm), um-PLAPO-CS HC 20X / 0,70 NA objectivo seco (WD = 0,6 mm), ou HC-PL-IRAPO 40X /1.1 NA objetiva de imersão em água (WD = 0,6 mm).
  3. Obter espectros de fluorescência confocal coleta de pilhas lambda (xyλ) da luz emitida em 5 nm-bandas do espectro visível a partir de células da BM transduzidas com um único vetor FP Lego, bem como do controle, não-transplantado BM.
    1. Processo de imagens com o software v2.4.1 Leica LAS-AF para criar todos os espectros de referência da PQ 5, bem como de autofluorescência (Figura 2A). Usando os espectros FP individual e a diferença no brilho de fluorescência (expressos como% de EGFP) de Cerúlea (79%), Vénus (156%), tdTomato (283%) e mCherry (47%), situado a 5 canais de imagem sequenciais do seguinte modo: Cerulean (458 / 468-482 nm), EGFP (488 / 496-514 nm), Venus (514 / 523-558 nm), tdTomato (561 / 579-597 nm), e mCherry (594 / 618-670 nm) ( Figura 2B).
    2. Validar a rigorosa separação PQ, como células transduzidas com cada indivíduo FP são visíveis apenas no canal correspondente e ausente do resto (Figura 2C). Além disso, esta abordagem multi-canal definido cria uma única 5-canais "ColorPrint" que permite a análise de cor e posterior acompanhamento clonal e tem a vantagem de reduzir tempos de aquisição em relação a imagem espectral.
  4. Emissão de fluorescência separado, no modo 2-fótons, de elevada eficiência espelhos costume dicróicas e recolher com quatro canais detector não-descanned (NDD) da seguinte forma: um espelho dicróico em 568 nm seguido por um espelho dicróico em 465 nm, seguido por a 452/45 nm filtro de emissão para SHG ou autofluorescência e Cerulean, um filtro 525/40 nm de emissão para EGFP ou Vênus, e um espelho dicróico 648 nm e 620/60 nm filtro de emissão para tdTomato ou mCherry.
    1. Revelar informações estruturais por microscopia de dois fótons iimaging contraste ntrinsic (como descrito acima) de autofluorescência tecido de elastina, NADH, (animado em 780 nm), e segundo harmônico sinal gerado (SHG) do osso e colágeno fibrilar (animado em 920 nm ou 860 nm coletados em um back-espalhados direção) 10,11.
  5. Para visualização volumétrica 3D, recolher série de imagens xyz (tipicamente 1 x 1 x 4 mm 3 de tamanho de voxel) ao longo do eixo z, a intervalos de 5 mm ao longo de um intervalo de profundidades (150-300 um) por toda a medula óssea e outros tecidos, sobre grandes regiões, utilizando a função telha do software para gerar automaticamente volumes que compõem todo um costuradas fossas esterno, aproximadamente 2,5 x 1,2 milímetros 2 (xy) e 300 um (z) (Figuras 2D-2E) e Filme 1.
    1. Imagem calota craniana medula diretamente através do crânio, sem o corte 2, 8.
    2. Seção esterno ao longo do plano sagital (bisection) e depoistransversalmente na articulação entre a imagem 2 esternal fossa e através do corte cara 3,4,12 (Resumo na Figura 1B adaptado de Takaku et ai 3).
  6. Para 4D lapso de tempo, colocar recentemente excisada poplítea nó de linfa, baço, pulmão, ou amostras de ossos de calvária sem cortes para pratos de 35 mm de cultura de número 0 lamela, em 50-100 ul de DMEM, FBS a 10% contendo 20 mM de HEPES a 37 ° C e usar dois fótons Ti-Sa excitação (860 nm), combinada com a excitação confocal (458 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, 594 nm) e Leica scanner de ressonância (8000 Hz / s), tendo z-stacks (~ 80 mm) em intervalos de 20 seg durante até 1 hora.
    1. Por três cores de uso de imagem 2P simultânea Ti-Sa sintonizado em 860 nm simultaneamente com o laser OPO (sintonizado em 1.130 nm para tdTomato; ou 1.140 nm mCherry) (Filme 2).
  7. Reconstrução e análise dos volumes 3D e sequências de tempo 4D
    1. Use Imaris x64 softwsão a versão 7.6, ou pacotes de software alternativas para transformar os azulejos-stacks de imagens RAW para prestados volume (3D) de dados de células fluorescentes dentro da medula óssea e tecidos diferentes e exportá-los como filmes 3D-rotação, como descrito anteriormente 3,4 (Filme 1) passo-a-passo exemplo:
      1. Em Imaris, abra a imagem z-stack; Selecione "Ultrapasse" para exibir a visualização volume 3D.
      2. Use "navegar" para aumentar o volume em torno de 360 ​​°.
      3. Selecione "Animação" para criar uma animação; usar quadros-chave para adicionar vistas selecionadas, zoom, rotações de volume; Visualizar o filme, edite como necessário e salvar o arquivo em um formato de filme desejada (ex: avi, mov).
    2. Para a avaliação quantitativa das células e clone de freqüência 3D, posições, tamanhos e distribuição, outro processo de z-stacks, utilizando os módulos Imaris XT que integram aplicações MATLAB realizando distância de mediçãourements (usando um algoritmo de transformação distância) e clusters de análise, como descrito anteriormente 3,4. Transforme as seqüências de pilhas de imagens ao longo do tempo em quatro dimensões (4D) filmes prestados no volume com software x64 Imaris e usar local e análise de superfície para rastreamento semi-automático de motilidade celular em três dimensões utilizando algoritmos de movimento auto-regressivos.
    3. Realizar análise multiespectral de células da seguinte forma: extrair o multi-color pontos marcados, adicionando todos os 5 canais através de canal aritmética dos Imaris XT em um novo canal; determinar, para todos os pontos (células), a intensidade de fluorescência média em cada um dos canais do componente 5. Exportar os valores em software Excel para plotar gráficos que indicam o "ColorPrint" único ou seja, a relação% de cada FP em cela individual (Figura 2E gráfico). Corrija o conjunto de dados para a deriva de tecidos, e calcular a velocidade da célula e deslocamento ao longo do tempo, os comprimentos de pista, caminhos e distâncias; valores de exportação em Excel software para traçar gráficos. Montar figuras compostas com software Adobe Photoshop CSS 5.

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Resultados

Whole-mount 3D confocal / 2 fótons reconstruções de microscopia do curso esternal tempo de medula óssea revelou o enxerto e expansão de transplantados co-5fps em um padrão com características marcantes: clones apareceram claramente delineados, de forma homogênea marcado com ampla paleta de cores inicialmente e progresso ao longo do tempo para conter preferencialmente células de uma grande parte da cor. Configuração microscopia confocal e exemplos representativos de imagem 5ips-HSPC marcado na medula óssea do esterno est...

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Discussão

Descrevemos aqui os detalhes de uma metodologia poderosa recentemente concebido para rastreamento de células clonal, combinando a grande diversidade gerada pela marcação com vetores Lego-codificação 5PQ e de imagem com confocal tandem e microscopia dois fótons para alcançar volumétrica e imagens dinâmicas em tecidos vivos combinatória. Isto estendeu o uso de cores baseada em FP marcação gravando confocal identidade espectral em 5 "distintas" canais de 8-bits. Assim, a proporção relativa de Cerulean, EGFP, Vênu...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue dos Institutos Nacionais de Saúde. Agradecemos a Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) por fornecer os cinco plasmídeos vetoriais LeGO; Christian A. Combs e Neal S. Young (NHLBI, NIH) pelas discussões, apoio e incentivo ao longo deste estudo, e Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) pela assistência com injeções nas veias da cauda.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Produção de vírus
LeGO-Cer2Addgene27338Expressão de Cerulean
LeGO-G2Addgene25917Expressão de eGFP
LeGO-V2Addgene27340Expressão de Vênus
LeGO-T2Addgene27342Expressão de tdTomato
LeGO-C2Addgene27339Expressão do
Kit de Transfecção de Fosfato de CálcioSigmaCAPHOS-1KT
Placa de cultura de tecidosBD Falcon353003
IMDMGibco, Life Technology12440-053
Soro Fetal Bovino Inativadopor Calor SigmaF4135-500ML
Caneta Strep GlutaminaGibco, Life Tecnologia10378-016
Tubos de CentrífugaBeckman Coulter326823
SW28 UltracentrífugaBeckman CoulterL60
Millex Unidade de Filtro Acionado por Seringa (0.22 µ m)MilliporeSLGS033SS
Coleta, purificação, transdução e transplante de células de camundongo
ACK tampão de liseQuality Biologicals Inc.118-156-101
(mouse)Miltenyi Biotec Inc. USA130-090-858
LS colunas + tubosMiltenyi Biotec Inc. USA130-041-306
Filtros de Pré-Separação (30 µ m)Miltenyi Biotec Inc. EUA130-041-407
StemSpan SFEM meio sem soro para cultura e expansão de células hematopoiéticas (500 ml)StemCell Technologies Inc 9650
Murine IL-11 CFR & D Systems Inc418-ML-025/CF100 µ g/ml é 1.000x
SCF murino recombinanteRDI Divisão da Fitzgerald Industries Intl RDI-2503100 µ g/ml é 2.000x
IL-3 murina recombinanteR & D Systems Inc403-ML-05020 µ g/ml é 2.000x
FLT-3 LiganteMiltenyi Biotec Inc. EUA130-096-480100 µ g/ml é 1.000x
placas de 12 poços, CostarCorning Inc.3527
RetronectinaTakara Bio IncT100A/BRessuspender em 50 µ g/ml
Sulfato de ProtaminaSigmaP-40204 µ g/ml é 1.000x
Microscopia confocal e de dois fótons
DMEMLonza12-614F
1 M HepesCellgro, Mediatech Inc.25-060-CI
Prato de cultura com fundo de vidro P35G-0-20-CMatTek CorporationP35G-0-20-C
Prato de cultura com fundo de vidro P35G-0-14-CMatTek CorporationP35G-0-14-C
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Vidro de borosilicato; 4 poçosThermo Scientific155383
Coverwashs 22 mm No 2Thomas Scientific6662-Q55
Leica TCS SP5 AOBS microscópio confocal e multifotônico de cinco canaisLeica Microsystems
Chameleon Vision II -TiSaph alcance do laser 680-1.080 nmCoherent
Chameleon Alcance compacto do laser OPO 1.030-1.350 nmCoerente
HCX-IRAPO-L 25X/0,95 NA objetiva de imersão em água (WD=2,5 mm)Leica Microsystems
Objetiva seca HC-PLAPO-CS 20X/0,70 NA (WD=0,6 mm)Leica Microsystems
HC-PL-IRAPO 40X/1,1 NA (WD=0,6 mm)Leica Microsystems
Imaris versão 7.6Bitplane
mCherry Kit de Depleção de Células Lineage Objetiva de imersão em água Software

Referências

  1. Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
  2. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
  3. Takaku, T., et al. Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy. Blood. 116, e41-e55 (2010).
  4. Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy. Blood. 120, e105-e116 (2012).
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  6. Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral 'gene ontology' (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16, 698-706 (2008).
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Reimpressões e permissões

Errata


Formal Correction: Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.

This was corrected in the discussion from:

This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

to:

This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

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C lulas Progenitoras Hematopoi ticasMarca o com Prote na FluorescenteMicroscopia ConfocalMicroscopia de Dois F tonsTransplante de Medula sseaTransdu o por Vetor LentiviralAn lise de Rastreamento ClonalImagem MulticorTime lapse 4DDesmistura Espectral
In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica
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