Combinatória 5 proteínas fluorescentes marcação de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas permite in vivo de rastreamento via clonal confocal e microscopia de dois fótons, fornecendo insights sobre medula óssea hematopoiética arquitetura durante a regeneração. Este método permite o mapeamento destino não-invasivo de espectro codificados células hspCs derivados em tecidos intactos por longos períodos de tempo após o transplante.
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Artigo de método
In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica
Neste artigo
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Resumo
Resumo
Nós desenvolvida e validada uma metodologia de marcação para rastreamento clonal de células tronco e progenitoras hematopoéticas (hspCs) com alta resolução espacial e temporal para estudar in vivo hematopoiese usando o transplante de medula óssea de camundongos modelo experimental fluorescente. Marcação usando lentivirais que codificam proteínas fluorescentes (FPS) combinatória genética permitem o mapeamento do destino da célula através de imagens de microscopia avançada. Vetores que codificam cinco PQ diferentes: Cerulean, EGFP, Vênus, tdTomato e mCherry foram utilizados para a transdução simultaneamente hspCs, criando uma paleta variada de cores de células marcadas. Imagem por microscopia confocal híbrido / two-photon permite a avaliação alta resolução simultânea de células marcadas com exclusividade e seus descendentes em conjunto com os componentes estruturais dos tecidos. Análise volumétrica ao longo de grandes áreas revelam que as células derivadas de HSPC espectralmente codificados podem ser detectados de forma não invasiva, em vários tecidos intactos, incluindo a medula óssea (BM), Por extensos períodos de tempo a seguir ao transplante. Estudos ao vivo combinando multiphoton taxa de vídeo e confocal de imagem time-lapse em 4D demonstrar a possibilidade de rastreamento de celular e dinâmica clonal de uma forma quantitativa.
Introdução
A produção de células sanguíneas, denominado hematopoiese, é mantida por uma pequena população de células estaminais e progenitoras hematopoéticas (hspCs). Estas células residir dentro da medula óssea (BM) em um nicho microambiental complexo que consiste em osteoblastos, células do estroma, tecido adiposo e estruturas vasculares, todos implicados no controlo da auto-renovação e diferenciação 1,2. Como intacta BM tem sido tradicionalmente inacessível para observações diretas, as interações entre HSPC e seu microambiente permanece em grande parte não caracterizada in vivo. Anteriormente, nós estabelecemos uma metodologia para visualizar a arquitetur....
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Protocolo
Todos os animais foram alojados e tratados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde, e matriculou-se em um protocolo de cuidado e uso NHLBI animal Comitê-aprovado. Feminino B6.SJL-Ptprc (d) pep3 (b) / BoyJ (B6.SJL) e C57BL / 6, machos, 6-12 semanas de idade, foram utilizados como dador e receptor, respectivamente.
Uma lista de materiais, reagentes, e o equipamento é fornecido na Tabela 1.
1. Lego Transdução de Rato hspCs e Transplante de Medula Óssea
Realizar procedimentos descritos abaixo, em um nível de bios....
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Resultados
Whole-mount 3D confocal / 2 fótons reconstruções de microscopia do curso esternal tempo de medula óssea revelou o enxerto e expansão de transplantados co-5fps em um padrão com características marcantes: clones apareceram claramente delineados, de forma homogênea marcado com ampla paleta de cores inicialmente e progresso ao longo do tempo para conter preferencialmente células de uma grande parte da cor. Configuração microscopia confocal e exemplos representativos de imagem 5ips-HSPC marcado na medula óssea do esterno est.......
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Discussão
Descrevemos aqui os detalhes de uma metodologia poderosa recentemente concebido para rastreamento de células clonal, combinando a grande diversidade gerada pela marcação com vetores Lego-codificação 5PQ e de imagem com confocal tandem e microscopia dois fótons para alcançar volumétrica e imagens dinâmicas em tecidos vivos combinatória. Isto estendeu o uso de cores baseada em FP marcação gravando confocal identidade espectral em 5 "distintas" canais de 8-bits. Assim, a proporção relativa de Cerulean, EGFP, Vênu.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue dos Institutos Nacionais de Saúde. Agradecemos a Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) por fornecer os cinco plasmídeos vetoriais LeGO; Christian A. Combs e Neal S. Young (NHLBI, NIH) pelas discussões, apoio e incentivo ao longo deste estudo, e Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) pela assistência com injeções nas veias da cauda.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Produção de vírus | |||
| LeGO-Cer2 | Addgene | 27338 | Expressão de Cerulean |
| LeGO-G2 | Addgene | 25917 | Expressão de eGFP |
| LeGO-V2 | Addgene | 27340 | Expressão de Vênus |
| LeGO-T2 | Addgene | 27342 | Expressão de tdTomato |
| LeGO-C2 | Addgene | 27339 | Expressão do |
| Kit de Transfecção de Fosfato de Cálcio | Sigma | CAPHOS-1KT | |
| Placa de cultura de tecidos | BD Falcon | 353003 | |
| IMDM | Gibco, Life Technology | 12440-053 | |
| Soro Fetal Bovino Inativado | por Calor Sigma | F4135-500ML | |
| Caneta Strep Glutamina | Gibco, Life Tecnologia | 10378-016 | |
| Tubos de Centrífuga | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW28 Ultracentrífuga | Beckman Coulter | L60 | |
| Millex Unidade de Filtro Acionado por Seringa (0.22 µ m) | Millipore | SLGS033SS | |
| Coleta, purificação, transdução e transplante de células de camundongo | |||
| ACK tampão de lise | Quality Biologicals Inc. | 118-156-101 | |
| (mouse) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-090-858 | |
| LS colunas + tubos | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-306 | |
| Filtros de Pré-Separação (30 µ m) | Miltenyi Biotec Inc. EUA | 130-041-407 | |
| StemSpan SFEM meio sem soro para cultura e expansão de células hematopoiéticas (500 ml) | StemCell Technologies Inc | 9650 | |
| Murine IL-11 CF | R & D Systems Inc | 418-ML-025/CF | 100 µ g/ml é 1.000x |
| SCF murino recombinante | RDI Divisão da Fitzgerald Industries Intl | RDI-2503 | 100 µ g/ml é 2.000x |
| IL-3 murina recombinante | R & D Systems Inc | 403-ML-050 | 20 µ g/ml é 2.000x |
| FLT-3 Ligante | Miltenyi Biotec Inc. EUA | 130-096-480 | 100 µ g/ml é 1.000x |
| placas de 12 poços, Costar | Corning Inc. | 3527 | |
| Retronectina | Takara Bio Inc | T100A/B | Ressuspender em 50 µ g/ml |
| Sulfato de Protamina | Sigma | P-4020 | 4 µ g/ml é 1.000x |
| Microscopia confocal e de dois fótons | |||
| DMEM | Lonza | 12-614F | |
| 1 M Hepes | Cellgro, Mediatech Inc. | 25-060-CI | |
| Prato de cultura com fundo de vidro P35G-0-20-C | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Prato de cultura com fundo de vidro P35G-0-14-C | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Vidro de borosilicato; 4 poços | Thermo Scientific | 155383 | |
| Coverwashs 22 mm No 2 | Thomas Scientific | 6662-Q55 | |
| Leica TCS SP5 AOBS microscópio confocal e multifotônico de cinco canais | Leica Microsystems | ||
| Chameleon Vision II -TiSaph alcance do laser 680-1.080 nm | Coherent | ||
| Chameleon Alcance compacto do laser OPO 1.030-1.350 nm | Coerente | ||
| HCX-IRAPO-L 25X/0,95 NA objetiva de imersão em água (WD=2,5 mm) | Leica Microsystems | ||
| Objetiva seca HC-PLAPO-CS 20X/0,70 NA (WD=0,6 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PL-IRAPO 40X/1,1 NA (WD=0,6 mm) | Leica Microsystems | ||
| Imaris versão 7.6 | Bitplane |
Referências
- Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
A correction was made to In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.
This was corrected in the discussion from:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
to:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
