O transplante de válvula pulmonar Usando um modelo do rato de Heterotópica Transplante de Coração

Resumo

De modo a compreender os mecanismos celulares e moleculares subjacentes neotissue formação e desenvolvimento de estenose em válvulas cardíacas de engenharia de tecidos, foi desenvolvido um modelo murino de transplante heterotópico de válvula cardíaca. A válvula cardíaca pulmonar foi transplantado para destinatário usando o coração técnica de transplante heterotópico.

Resumo

Engenharia de tecidos de válvulas cardíacas, válvulas especialmente descelularizados, estão começando a ganhar impulso no uso clínico de cirurgia reconstrutiva com resultados mistos. No entanto, os mecanismos celulares e moleculares do desenvolvimento neotissue, espessamento da válvula, e o desenvolvimento de estenose não são pesquisadas extensivamente. Para responder às perguntas acima, foi desenvolvido um modelo de transplante heterotópico murino coração válvula. A válvula cardíaca foi colhida a partir de um camundongo doador válvula e transplantadas para um doador de rato coração. O coração com uma nova válvula foi transplantado heterotopicamente a um rato destinatário. O coração transplantado mostrou o seu próprio batimento cardíaco, independente de batimentos cardíacos do destinatário. O fluxo de sangue foi quantificado usando um sistema de ultra-som de alta freqüência com Doppler pulsátil. O fluxo através da válvula pulmonar implantado mostrou a frente de fluxo com refluxo mínimo e pico de fluxo foi próximo a 100 mm / seg. Este modelo murino de transplante de válvula cardíaca é highly versátil, de modo que pode ser modificada e adaptada para fornecer diferentes ambientes hemodinâmicas e / ou pode ser usado com vários ratinhos transgénicos para estudar o desenvolvimento neotissue em uma válvula cardíaca de engenharia de tecidos.

Introdução

Defeitos cardiovasculares congênitos são uma das principais causas de mortalidade infantil no mundo ^1,2 ocidental. Entre eles, a estenose da válvula pulmonar e os defeitos da válvula aórtica bicúspide são uma forma que ocorre com freqüência ^3. Cirurgia de substituição da válvula cardíaca é uma escolha rotina de cirurgias reconstrutivas; no entanto, complicações, incluindo estenose e calcificação da válvula cardíaca, ea dependência ao longo da vida em anticoagulantes são uma fonte significativa de problemas de saúde crônica e morte ^4-7. Além disso, a falta de potencial crescimento requer cirurgias de revisão, que aumenta ainda mais a mortalidade dos pacientes jovens ^4,8,9.

Numa tentativa para desenvolver uma válvula cardíaca de substituição funcional com um potencial de crescimento, Shinoka et al. Células autólogas semeadas em uma válvula cardíaca sintética biodegradável ^8. A válvula sintético transformado em uma válvula cardíaca nativa como a estrutura com potenciômetro crescimentoai. Preliminares grandes estudos com animais demonstraram a viabilidade da utilização desta metodologia para criar uma válvula cardíaca funcional ^10. No entanto, estudos de implantação de longo prazo demonstraram pouca durabilidade devido ao espessamento progressivo da válvula neotissue resultando em estreitamento da válvula cardíaca. Trabalhe a partir de Sodian et al. Utilizada a metodologia Shinoka, mas finalmente substituiu a matriz PGA com um elastômero biodegradável, que deu as propriedades biomecânicas da válvula de engenharia de tecidos construir um perfil mais fisiológico ^9,11,12. No estudo in vivo, apesar do sucesso da implantação, um revestimento de células endoteliais confluentes não foi formado, o que poderia limitar o sucesso a longo prazo deste andaime ^12.

A fim de projetar racionalmente uma válvula cardíaca sintético de segunda geração melhorada, um modelo murino de transplante de válvula cardíaca foi criado para investigar os mecanismos celulares e moleculares underlyinformação g neotissue, espessamento da válvula, e o desenvolvimento de estenose. Modelos murinos oferecem uma vasta gama de reagentes moleculares, incluindo transgénicos, que não estão facilmente disponíveis em outras espécies ^7. Neste modelo de transplante de coração válvula, um vivo substituição da válvula cardíaca pulmonar ex singênico foi realizada pela primeira vez; e, em seguida, o coração, com a válvula de coração implantado foi implantado heterotopicamente no hospedeiro singeneico usando uma técnica de microcirurgia. Este modelo permite a substituição da válvula do coração sem a necessidade de circulação extracorpórea.

Neste trabalho, uma explicação detalhada de uma colheita de válvula cardíaca, preparações de coração doador, o transplante de válvula cardíaca e transplante cardíaco heterotópico é descrito. Os resultados mostraram uma pulsação contínua a partir do coração do doador, que era independente do batimento cardíaco destinatário. O fluxo de sangue através da válvula pulmonar implantado foi medida usando um sistema de ultra-som de alta freqüência com uma onda pulsada Fazerppler.

Protocolo

Nota: Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional Hospital Animal Care e Use do Nationwide Children.

1. Pulmonar Válvula Cardíaca Colheita de um doador de válvula do coração mouse

1. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia: 1x tesoura fina, micro fórceps 3x, pinças vasculares micro 2x, braçadeira 1x fórceps de aplicação, suporte da agulha micro 1x, tesoura primavera 1x, 1x afastador.
2. Um 6-8 semanas de idade fêmea C57BL / 6 de rato é usado como um doador de válvula cardíaca pulmonar. Remover o rato da sua gaiola e pesá-lo, em seguida, a eutanásia com um cocktail de cetamina / xilazina (cetamina 200 mg / kg e xilazina, 20 mg / kg, IP) sobredosagem.
3. Clipe da área do peito e coloque o mouse em uma posição de decúbito dorsal sobre uma almofada. Em seguida, fazer a toracotomia. Expor o coração, fazer um pequeno corte no átrio direito, e aspergir o ventrículo esquerdo com gelo salina fria.
4. Sem rodeios dissecção da artéria pulmonar (AP) a partir da ascensão de umorta. Cortar a válvula pulmonar (PV), juntamente com dois milímetros punho da artéria pulmonar. Elimine o resto do coração.
5. Armazenar o PV em heparina frio e solução salina (100 unidades / ml). Nota: O PV pode ser mantido na solução durante duas horas antes do transplante para o coração de dador.

2. Preparação coração doador

1. Um 6-8 semanas de idade fêmea C57BL / 6 de rato é usado como um doador de coração. Remover o rato da sua gaiola e pesá-lo, em seguida, a eutanásia com um cocktail de cetamina / xilazina (cetamina 200 mg / kg e xilazina, 20 mg / kg, IP) sobredosagem. Este é um procedimento terminal.
2. Clipe da área do peito e coloque o mouse em uma posição de decúbito dorsal sobre uma almofada. Em seguida, fazer a toracotomia. Sem rodeios separar o coração, veia cava inferior (VCI), veia cava superior (VCS), aorta ascendente, PA, e veia pulmonar. Perfundir da VCI com gelo frio salina estéril.
3. Ligadura da VCI, SVC, e veia pulmonar com seda 6-0 sutura em seguida, corte superior aoligaduras.
4. Corte a aorta e PA com 2 milímetros punho.
5. Recorte o PV e descartá-la.

3. Válvula de Transplante de Coração em um coração do doador

1. Imediatamente após o passo 2.5, coloque a válvula cardíaca a partir do passo 1.5 para o coração do doador e orientar a válvula cardíaca.
2. Fixe o PV com um ponto no lado direito da válvula usando 10-0 suturas monofilamento em agulhas cônicos e começar a sutura contínua com 5-6 stiches do outro lado do PV.
3. Depois de terminar o lado da frente, girar o coração na horizontal e começa a suturar o lado de trás do PV para o coração de dador.
4. Armazenar o coração em solução de heparina / solução salina estéril fria. Nota: O coração do dador podem ser mantidas na solução durante duas horas antes da implantação até o rato destinatário.

4. Heterotópico Transplante de Coração para um destinatário Rato

1. Um 6-8 semanas de idade fêmea C57BL / 6 de ratinho foi utilizado como um recipient. Remover o rato da sua gaiola e pesá-lo, depois anestesiados com um cocktail de cetamina / xilazina (cetamina 100 mg / kg de xilazina e 10 mg / kg). O cetoprofeno (5 mg / kg) é utilizado como pré-anestésica analgésico.
2. Depois de verificar o nível de sedação pela cauda beliscar, prenda o cabelo abdominal e torácica. Lubrifique os olhos com pomada oftálmica estéril, e coloque o mouse em uma posição de decúbito dorsal sobre uma almofada. Desinfetar o abdômen com Betadine e álcool pads. Em seguida, cubra o mouse com um campo estéril e expor apenas a área da incisão.
3. Faça uma laparotomia mediana incisão abaixo do xifóide até a região suprapúbica, e inserir um afastador auto de retenção. Enrole os intestinos em salina umedecido gaze. Sem rodeios definir a aorta infra-renal e veia cava.
4. Coloque duas suturas de seda 6-0 proximal e distal ao redor da aorta e veia cava inferior para conter a circulação sanguínea.
5. Coloque o coração do doador, no lado direito da aorta abdominal e cobri-lo com gau estérilze. Hidrate-lo com soro fisiológico.
6. Realizar uma Aortotomia na aorta abdominal com uma agulha G 30, e estender a abertura com uma tesoura para o tamanho da aorta do doador.
7. Realizar um fim-de lado anastomose usando estéreis suturas 10-0 monofilamento as agulhas cônicos. Fixar a aorta do dador com um ponto na extremidade proximal da abertura na aorta abdominal e iniciar a sutura contínua com 4-5 stiches a partir da extremidade distal da aorta abdominal.
8. Virar o coração para o lado esquerdo, cobri-lo com uma solução salina infundida gaze, e iniciar a sutura contínua com 4-5 stiches a partir da extremidade distal da aorta abdominal.
9. Fazer uma venotomia na VCI usando uma agulha G 30 e estender a abertura para o tamanho da artéria pulmonar do dador.
10. Realizar um fim a anastomose lado usando estéreis suturas 10-0 monofilamento as agulhas cônicos. Fixar o doador PA com um ponto na extremidade proximal da abertura na VCI e iniciar a sutura contínua com 4-5 de stichesa extremidade distal da veia cava inferior. Desta vez, por causa da aorta é na forma, certifique-se de sutura da parede esquerda da PA do dador está no interior da veia cava inferior.
11. Lave o lúmen da VCI com heparina e solução salina (100 unidades / ml). Fechar a parede direita do doador e do receptor PA IVC suturando-os continuamente para a extremidade distal.
12. Remover a ligadura distal e controlar a hemorragia através da aplicação de um agente hemostático estéril absorvível tópica. Quando a hemorragia parar completamente, retirar a sutura proximal e controlar a hemorragia da mesma maneira.
13. Retorne os intestinos e fechar a musculatura abdominal e pele em duas camadas usando uma sutura de monofilamento 6-0 poliamida preto.
14. Injetar 0,5 ml por via subcutânea de solução salina e coloque o rato em uma gaiola de recuperação em um bloco de aquecimento até que o mouse é totalmente móvel. Após a recuperação, o retorno do mouse para uma nova gaiola com roupa de cama de papel. Dar medicação para dor (Ibuprofeno, 30 mg / kg, a água potável) para 48 horas. Fazernão devolver um animal que passou por uma cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.

Resultados

A figura 1 ilustra o esquema do modelo de transplante de válvula cardíaca utilizando transplante cardíaco heterotópico. A válvula cardíaca foi colhida a partir de um doador e implantado em um coração de um segundo rato doador. Em seguida, o coração com a nova válvula cardíaca foi implantado no abdómen de um rato receptor. Figura 2 mostra uma ilustração do coração implantado no espaço abdominal (A), logo após o transplante de coração (B), e 5 minutos apó...

Discussão

A taxa de mortalidade do presente processo é de cerca de 20%, que foi principalmente causada por hemorragia no local da transplante de PV e anastomose sobre a aorta do doador para a aorta abdominal do destinatário. Na maioria dos casos, a taxa de mortalidade diminui significativamente 48 horas pós cirurgia. Os ratos de sobrevivência mostraram fortes batimentos cardíacos e do fluxo de sangue através do PV implantado. Todo o processo leva quatro horas para um cirurgião experiente micro. Levará cerca de 250 ratos para domi...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microscópio DPBS	Gibco	14190-144
Leica		M80
C57BL/6J (H-2b), Fêmea	Jackson Laboratories	664	8-12 semanas
Injeção de Cloridrato de Cetamina	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Solução Estéril de Xilazina	Akorn Inc.	NADA# 139-236
Cetoprofeno	Fort Dodge Saúde Animal	NDC 0856-4396-01
Ibuprofeno	Dose de precisão	NDC 68094-494-59
Heparina Sagente	de Sódio Farmacêuticos	NDC 25021-400
Solução salina (cloreto de sódio estéril a 0,9%)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
Injeção de cloreto de sódio a 0,9%	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
Pomada Oftálmica de Petrolato	Dechra Produtos Veterinários	NDC 17033-211-38
Almofadas de Preparação de Iodo	Triad Descartáveis, Inc.	NDC 50730-3201-1
Almofadas de preparação de álcool	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Aplicadores com ponta de algodão	Fisher Sientific	23-400-118
Tesoura fina	FST	14028-10
Micro-Adson Fórceps	FST	11018-12
Grampo Pinça de aplicação	FST	00072-14
S & T Vascular Clamp	FST	00396-01
Tesoura de Mola	FST	15008-08
Colibri Retractors	FST	17000-04
Dumont #5 Fórsei	FST	11251-20
Dumont #7 - Fórceps Fino	FST	11274-20
Dumont #5/45 Fórceps	FST	11251-35
Tish Porta-Agulhas/ Fórceps	Micrins	MI1540
Sutura de Monofilamento de Poliamida Preta, 10-0	AROSurgical Instruments Corporation	TI638402	Para suturar o enxerto
Sutura de Monofilamento de Poliamida Preta, 6-0	AROSurgical Instruments	SN-1956	Para musculatura e fechamento da pele
Esponjas não tecidas	McKesson Corp.	94442000
Hemostático absorvível	Ethicon	1961
Seringa de 1 ml	BD	309659
Seringa de 3 ml	BD	309657
Seringa de 10 ml	BD	309604
18 G 1 1/2 pol., Agulha	BD	305190
25 G 1 pol., Agulha	BD	305125
30 G 1 pol., Agulha	BD	305106
Recirculador de Água Quente	Gaymar	TP-700
Almofada de Aquecimento	Gaymar	TP-22G
Aparador	Wahl	9854-500
VEVO2100 Ultrassom de Alta Frequência	VisualSonics	http://www.visualsonics.com/vevo2100	O número de catálogo e o preço podem ser adquiridos com os representantes de vendas.
Gel de transmissão de ultrassom	Parker Laboratories, INC.	01-02
Sistema de Anestesia para Animais de Laboratório de Mesa	VetEquip, INC.
Isoflurano	Baxter	1001936060

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