Concentre Formação: Um Ensaio Celular para Determinar o Potencial oncogénica de um Gene

Resumo

O ensaio de formao de foco fornece um método simples para avaliar o potencial de transformação de um oncogene candidato.

Resumo

A transformação maligna das células está tipicamente associada ao aumento da proliferação, perda da inibição de contato, aquisição de potencial de crescimento independente de ancoragem e capacidade de formar tumores em animais experimentais¹. Nas células NIH 3T3, a via de transdução de sinal Ras é conhecida por desencadear muitos desses eventos, o que é conhecido como transformação Ras. A introdução de um gene superexpresso em células NIH 3T3 pode promover transformação morfológica e perda de inibição de contato, o que pode ajudar a determinar o potencial oncogênico desse gene de interesse. Um ensaio que fornece um método direto para avaliar um aspecto do potencial transformador de um oncogene é o Ensaio de Formação de Foco (FFA)². Quando as células NIH 3T3 se dividem normalmente em cultura, elas o fazem até atingirem uma monocamada confluente. No entanto, na presença de um oncogene superexpresso, essas células podem começar a crescer em focos¹ densos e multicamadas que podem ser visualizados e quantificados por cristal violeta ou coloração Hema 3. Neste artigo, descrevemos o protocolo FFA com transdução retroviral do gene de interesse em células NIH 3T3 e como quantificar o número de focos por meio de coloração. A transdução retroviral oferece um método mais eficiente de entrega de genes do que a transfecção, e o uso de um retrovírus murino ecotrópico fornece um controle de biossegurança ao trabalhar com potenciais oncogenes humanos.

Introdução

As células tumorais podem ser distinguidos dos seus homólogos normais por uma ampla gama de alterações, a partir de padrões de expressão de genes para epigenomics a alterações morfológicas e proliferativas. Entre estes últimos, redução da dependência do soro, a perda de contacto (densidade) de inibição, a aquisição de proliferação independente de ancoragem e, em última análise, a capacidade de formar tumores quando injectadas em animais são indicadores úteis, mensuráveis ​​de transformação maligna ^3. Vários in vitro e em ensaios in vivo têm sido desenvolvidos para a transformação celular. Os ensaios in vitro por objectivo a identificação e medindo alterações na morfologia da cultura (ensaio de formação de foco), dinâmica de cultura (taxa de crescimento, a densidade de saturação) e o factor de crescimento (crescimento em soro reduzido) ou ancoradouro (crescimento em agar mole) requisitos. O padrão de ouro para a determinação do carácter maligno de um tipo de célula permanece a formação de tumores (xenoenxertos) em animais experimentais. No entanto, tele custa e comprimento de estudos in vivo nem sempre fazê-los justificável como uma primeira etapa de validação ou screening de oncogenes candidatos. Embora nenhum ensaio in vitro fornece uma avaliação definitiva do potencial oncogénico de um gene, que não fornecem informações sobre potencial oncogénico que pode afinar futuro em estudos in vivo. Um dos sistemas mais utilizados para a avaliação do potencial oncogênico in vitro é o foco Formação Ensaio ^2. Esta abordagem baseia-se na utilização de NIH 3T3 de fibroblastos de rato, uma linha de células não transformadas que mostram forte inibição de contacto. A sobre-expressão de um oncogene resulta em perda do crescimento dependente de densidade; As células transformadas podem então crescer em múltiplas camadas, formando "focos", facilmente visualizado contra a monocamada de células não transformadas fundo. O Ensaio de formação de focos, em seguida, mede a capacidade de um oncogene candidato para induzir a transformação maligna, como evidenciado pela perda de contacto Inibiç como um fenótipo mensurável. O FFA tem sido utilizado para avaliar a sobre-expressão por transformação de proteína-quinases (por exemplo, Src ^{4, 5} BRAF), factores de transcrição (por exemplo, N-myc ⁶⁾ receptores, L-acoplados à proteína (por exemplo, P2RY8 ⁷⁾ e GTPases (p.ex. , Ras ^1), entre outros. A relativa facilidade deste ensaio faz-se uma boa escolha que vai proporcionar uma resposta rápida e visualmente claro para se sobre-expressão do gene é suficiente para transformar células de fibroblastos NIH 3T3 de rato in vitro.

O FFA descrito neste protocolo utiliza a linha celular de empacotamento Plat-E ^8, o qual fornece as proteínas virais de empacotamento, e o vector retroviral pBABEpuro ⁹ (Addgene plasmídeo 1764) para a produção de retrovírus. Após transfecção com a construção pBABEpuro contendo o gene de interesse, a linha celular Plat-E vai produzir retrovírus ecotrópico que pode ser utilizado para infectar as células NIH 3T3. Tseu método de entrega gene viral é mais eficiente do que os métodos de transfecção química tradicionais e oferece uma maneira de expressar de forma sustentável o gene ^10. Uma vez incorporado no genoma das células NIH 3T3, a sobre-expressão do gene de interesse é impulsionado pelo repetições terminais longas virais (LTR) ^11. Esta expressão constante pode ser usado para determinar se o gene de interesse tem actividade oncogénica, tal como medido pela formação de focos, sobre as células NIH 3T3.

Protocolo

1. Fazer os vetores virais

As sequências de codificação para o gene de interesse, bem como os controlos positivos e negativos, são inseridos em pBABEpuro por métodos tradicionais de clonagem (amplificação por PCR, digestão de restrição e de ligação). Existem quatro locais de restrição no vector em que o DNA pode ser inserido: BamHI, SnaBI, EcoRI e Sall.

1. Prepare plasmídeo DNA transfecção-grade a partir de células competentes, segundo o kit plasmídeo midi QIAGEN.
2. Medir a concentração de DNA usando um espectrofotômetro NanoDrop2000.

2. Retrovirus Produção

A linha celular de empacotamento Plat-E vai ser utilizado para produzir retrovírus ecotrópico que permitirá obter o ADNc de interesse a células NIH 3T3.

1. Estabelecer Plat-E culturas de células congeladas
   1. Rapidamente descongelar células Plat-E de um ° C banho de água 37 e transferir para um tubo de 15 ml. Lentamente, adicionar 9 ml de meio de Plat-E (DuMeio Eagle Modificado de lbecco (DMEM) + 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) + penicilina e estreptomicina).
   2. Centrifugar o tubo em 180 x g durante 5 min e desprezar o sobrenadante.
   3. Re-suspender as células com 10 ml de Plat-E e meio de transferência para uma placa de cultura de 10 centímetros.
   4. Incubar as células em uma temperatura de 37 ° C, 5% de _CO2 até que eles são de 80-90% confluentes (cerca de 2 dias).
2. Splitting celular
   1. Aspirar o meio e lave as células uma vez com PBS.
   2. Adicionar 2 ml de 0,05% de tripsina-EDTA e incubar durante 1 minuto à temperatura ambiente.
   3. Retire as células por finger tapping, adicione 10 ml de meio Plat-E, e transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml.
   4. Centrifugar o tubo em 180 x g durante 5 min e desprezar o sobrenadante.
   5. Ressuspender as células com 10 ml de meio Plat-E e semear-los em novas placas a 1: 4-1: 6 diluições.
3. Plat-E Sementeira e Transfection
   1. Semente de 2 x 10 ⁶células por 10 cm prato de cultura, utilizando meio de Plat-E sem quaisquer antibióticos.
   2. Incubar as células S / N em uma temperatura de 37 ° C, 5% de _CO2.
   3. No dia seguinte, transferir 300 ul de Opti-MEM em 1,5 ml de tubo de microcentrífuga.
   4. Adicionar 27 ul de polietilenimina (PEI), um reagente de transfecção de baixo custo ^12, o tubo preparado com Opti-MEM. Misturar suavemente batendo por dedo e incubar durante 5 min à TA.
   5. Adicionar 9 ug de ADN plasmídeo de transfecção de grau para o tubo de Opti-MEM / PEI, misturar suavemente em vórtex e incubar durante 15 min à temperatura ambiente.
   6. Adicionar o ADN / PEI gota a gota complexo no prato Plat-E, e incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO _2.
   7. No dia seguinte, aspirar o meio contendo o reagente de transfecção e adicione 10 ml de meio Plat-E fresco (sem antibióticos).
   8. Retorne as células para a incubadora.

3. As células NIH 3T3 e Infecção

1. Estabelecer NIHCultures 3T3 e propagação
   1. Rapidamente descongelar células NIH 3T3 numa ° C num banho de água a 37 e transferir para um tubo de 15 ml. Adiciona-se lentamente 9 ml de meio de NIH 3T3 (DMEM + 10% FBS).
   2. Centrifugar o tubo em 180 x g durante 5 min e desprezar o sobrenadante.
   3. Ressuspender as células com 10 ml de NIH 3T3 médio e transferir para um 10 centímetros prato de cultura.
   4. Incubar as células em uma temperatura de 37 ° C, 5% de _CO2. É muito importante que as células NIH 3T3 são sempre mantidas underconfluent (50-60%), tal como a frequência de transformação espontânea (e, por conseguinte, níveis basais de formação de focos) aumenta uma vez que uma cultura atinge a confluência.
   5. Semente de 3 x 10 ⁵ células por placa de 10 cm e incubar O / N para a infecção, no dia seguinte.
2. Infecção
   1. Colher o sobrenadante retroviral do prato Plat-E usando uma seringa descartável de 10 ml, filtração através de um filtro de membrana de nylon de 0,45 um de tamanho de poro, e transferindo-o para um 15 mltubo.
   2. Adicionar 10 ml de meio Plat-E fresco às células (sem antibióticos), e devolvê-las para a incubadora.
   3. Aspirar o meio do prato de células NIH 3T3 de estarem infectados, e adicione 5 ml de meio de NIH 3T3 regular e 5 ml de sobrenadante filtrado que contém o vírus.
   4. Adicionar ao prato polibreno a uma concentração de 6 ug / ml.
   5. Incubar as células S / N a 37 ° C, 5% de CO _2.
   6. No dia seguinte, repita os passos 3.2.1 - 3.2.5 para uma segunda rodada de infecção.
   7. Substituir o meio contendo vírus NIH 3T3 com meio regular.
   8. Permitir que as células NIH-3T3 para crescer durante 2-3 semanas, substituindo o meio, conforme necessário. Verifique a expressão da proteína de interesse por electroforese e imunotransferência de proteína convencional em lisados ​​de células inteiras a partir de placas réplica.

4. Coloração e Quantificação

1. Violeta Cristal Coloração
   1. Aspirar o meio de NIH 3T3 e colocar os pratosem gelo.
   2. Lavam-se as placas duas vezes com PBS gelado.
   3. Fixar as células com metanol gelado durante 10 min.
   4. Remover os pratos de gelo, aspirar o metanol, e adicionar 3 ml de solução de violeta cristal 0,5% feitos em 25% de metanol (RT).
   5. Incubar as placas durante 5 min à TA.
   6. Aspirar a solução de cristal violeta e lavar cuidadosamente o prato com Milli-Q _H2O até sem cor sai na lavagem.
   7. Permitir que os pratos para secar O / N em uma bancada (descoberto).
2. Focos Quantificação
   1. Uma vez que os pratos estão secos, use uma régua para medir as coleções de cor escura de células na placa. Contar apenas aqueles que são maiores do que 5 mm de diâmetro, como "focos". Anote o número de focos e calcular médias e a importância em comparação com os controles.

Resultados

MXD3 é um fator fundamental zipper hélice-alça-hélice leucina (bHLHZ) de transcrição que é um membro da MYC / MAX / network MAD. Ele é um membro da família atípica MAD ^13-15, e tem sido referida como estando envolvida na carcinogénese ^16,17. Quando comparado com pBABEpuro (controlo negativo) e MYC (controlo positivo), os pratos de NIH 3T3 que sobre-expressas foi MXD3 tinham significativamente menos focos (Figura 1A). Os dados na Figura 1B foram recolhidos a partir ...

Discussão

A FFA fornece um método rápido e fácil de avaliar a transformação maligna in vitro. É passível de exibição de um número relativamente grande de genes candidatos e seus requisitos técnicos modestos torná-lo rentável. Além disso, dois ou mais genes pode ser co-expressa (por vezes referido como um ensaio de "cooperação") para avaliar o potencial tumorigénico de combinação. As vantagens deste ensaio contar com a sua técnica simples, a sua facilidade de quantificação e a sua relativamente curto tempo de ro...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
pBABE-puro vetor	Addgene	Plasmid 1764	vetor de clonagem
Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic	Cell Biolabs, Inc.	Linha celular RV-101	para produção viral
NIH 3T3 Linha celular murina	Sigma-Aldrich	93061524	linha celular para ensaio de formação de foco
Seringa de ponta BD Luer-Lok de 10 ml	BD Biosciences	309604	reagente de produção viral
0,45 μ m Filtro de Seringa Puradisc	Reagente de produção viral	da Whatman	6750-2504Polysciences
	, Inc.	23966-2	reagente de transfecção de células
Infecção de Polybrene / Reagente de transfecção	EMD Millipore	TR-1003-G	reagente de transfecção de células
Crystal Violet	Fisher Scientific	C581-25	reagente de coloração de células
Plasmid Plus Midi Kit	QIAGEN	12945	purificação de plasmídeos Placas
cultura de tecidos BD Falcon	Biosciences	353003	Suprimentos para cultura de células
Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)	Gibco	11995-065	meio de cultura celular
0,05% Tripsina-EDTA	Gibco	25300-054	suprimentos de cultura de células
Opti-MEM I Meio de Soro Reduzido	Gibco	31985-062	meio de cultura de células
Soro Fetal Bovino (FBS)	Gibco	16000-044	meio de cultura de células