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Artigo de método

Cultura primária de neurônios dopaminérgicos mouse

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⸱

DOI:

10.3791/51751

⸱

8 de setembro de 2014

 ,  , 
1CNRS, UMR-5203, Institut de Génomique Fonctionnelle, Montpellier, 2Inserm, U661, Montpellier, 3Universités de Montpellier

Neste artigo

Resumo

Os neurônios dopaminérgicos desempenham um papel regulador vital no cérebro. Sua perda está associada à doença de Parkinson. Neste vídeo, mostramos como gerar culturas primárias de neurônios dopaminérgicos centrais a partir de mesencéfalo embrionário de camundongo. Tais culturas são úteis para estudar a extrema vulnerabilidade desses neurônios a vários estresses.

Resumo

Neurónios dopaminérgicos representam menos de 1% do número total de neurónios no cérebro. Esta baixa quantidade de neurônios regula funções importantes do cérebro, como controle motor, motivação e memória de trabalho. Neurônios dopaminérgicos nigrostriatal degenerar seletivamente na doença de Parkinson (DP). Esta perda neuronal progressiva é inequivocamente associado aos motores sintomas da patologia (bradicinesia, tremor de repouso, rigidez muscular e). O principal agente responsável dos neurônios dopaminérgicos degeneração ainda é desconhecida. No entanto, esses neurônios parecem ser extremamente vulneráveis ​​em diversas condições. As culturas primárias constitui um dos modelos mais relevantes para investigar as propriedades e características de neurónios dopaminérgicos. Estas culturas podem ser submetidos a vários agentes estressores que imitam PD patologia e compostos neuroprotetores, a fim de parar ou abrandar a degeneração neuronal. Os inúmeros modelos de camundongos transgênicos do PD que foram generciados durante a última década aumentou ainda mais o interesse dos pesquisadores para as culturas de neurónios dopaminérgicos. Aqui, o protocolo de vídeo concentra-se na dissecação delicada de cérebros embrionárias de rato. Excisão precisa do mesencéfalo ventral é crucial para obter culturas neuronais suficientemente ricos em células dopaminérgicas para permitir estudos posteriores. Este protocolo pode ser realizado com camundongos transgênicos embrionárias e é adequado para imunofluorescência, PCR quantitativo, segundo quantificação mensageiro, ou avaliação morte / sobrevivência neuronal.

Introdução

A dopamina, um dos neurotransmissores cerebrais essenciais 1,2, é libertada principalmente por dopaminérgicos do mesencéfalo (AD) neurónios. A maioria dos neurónios DA residir na parte ventral do mesencéfalo 2-6. Esquematicamente, neurônios DA mesencéfalo podem ser divididos em três sistemas distintos de projeção anatômica e funcionalmente: mesostriatal, mesolímbico, e caminhos mesocorticais 2,5. A via nigroestriatal está envolvida no comportamento do motor, as vias mesolímbica desempenhar um papel importante no reforço, a motivação, aprendizagem e, ao passo que as vias dopaminérgicas que se projectam para o córtex pré-frontal estão implicados na cognição 2.

Neurônios DA estão envolvidos em diversas doenças neurológicas humanas, como a esquizofrenia, déficit de atenção, transtorno de hiperatividade, e doença de Parkinson (DP) de 2,4. A DP é caracterizada por uma degeneração progressiva e selectiva dos neurónios DA ligar substantia nigrapars compacta (SNC) para o estriado. A perda de Nigro-estriatal da neurônios resulta na depleção de dopamina no corpo estriado grave que é responsável de os sintomas motores da DP (bradicinesia, tremor de repouso, rigidez e) 7. A causa inicial da DP idiopática não foi estabelecida e os tratamentos atuais são apenas sintomático, com o objetivo de restaurar o nível de dopamina no corpo estriado. A droga mais prescrita é L-Dopa (Levodopa), o precursor natural da dopamina. Embora a administração de Levodopa compensa a perda de dopamina por um certo tempo, complicações motoras ocorrer após tratamentos de longa duração (discinesia e liga / desliga estados) 8,9.

Pesquisa sobre neurônios dopaminérgicos e PD está em progressão constante e estão sendo feitos intensos esforços para desenvolver tratamentos baseados em transplante de células, a terapia gênica, ou agentes neuroprotetores 10,11. No entanto, um grande problema permanece não elucidado: o que é a causa da extrema vulnerability de neurônios DA? Parte da resposta pode ser encontrada na actividade dos neurónios DA. A redução da atividade elétrica e da excitabilidade dos neurônios de DA parece aumentar sua propensão a se degenerar 12. No entanto, a complexidade do PD patogênese requer mais estudos para identificar os mecanismos envolvidos na degeneração de neurônios DA 13-15.

As culturas primárias são especialmente relevantes para estudar propriedades DA neurônio 16-19 e desafiar esses neurônios para várias tensões para avaliação de agentes neuroprotetores 20-24. Modelos de rato de cultura são os mais frequentemente utilizados, como a dissecação do mesencéfalo de embriões de rato é mais fácil, em comparação com o rato, e maiores quantidades de neurónios podem ser obtidos na ratazana. No entanto, a geração de modelos transgênicos da doença 25 aumentou consideravelmente o interesse da comunidade neurocientista para culturas primárias do rato 26-29. Embora a cultura da prepared de animais recém-nascidos podem ser utilizados, é preferível prepará-los a partir de embriões na fase de pós-mitótico (E13.5 mesencéfalo de neurónios), quando os neurónios mantiveram a sua capacidade de se diferenciar. O protocolo a seguir apresenta os neurónios do mesencéfalo isoladas em cultura primária a partir de embriões de rato (E13.5), as quais são as mais difíceis de preparar. Nomeadamente, é proporcionado um protocolo utilizando meio de cultura isento de soro para uma melhor reprodutibilidade. As duas etapas mais críticas na preparação cultura (dissecção e dissociação mecânica) será cuidadosamente detalhado no vídeo associado.

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Protocolo

Os ratos utilizados neste trabalho foram atendidas e tratadas de acordo com as diretrizes do Conselho da União Europeia (86/609 / UE) para o uso de animais de laboratório.

1 Preparação de soluções necessárias

  1. Soluções de Stock
    1. 10x de poli-L-ornitina (PLO) Solução: pesam-se 10 mg de bromidrato de PLO (peso molecular = 30,000-70,000) e dissolver em 70 ml de água estéril. Filtra-se a solução com uma seringa de filtro de 0,2 um, alíquota, e armazenar a -20 ° C.
    2. 30% Solução de Glucose: pesam-se 30 g de D (+) - glicose e dissolve-se em água estéril para um volume total de 100 ml. Filter, alíquota, e armazenar a 4 ° C.
    3. Meio de Eagle Modificado de 5x Dulbecco (DMEM) / Mistura nutriente F-12 de Ham: pesam-se 6 g de DMEM / Ham F-12 em pó e dissolve-se em água estéril para um volume total de 100 ml. Filter, alíquota, e armazenar a 4 ° C.
    4. 7,5% de Bicarbonato de Sódio (NaHCO3) Solutiem: pesam-se 7,5 g de NaHCO 3 e dissolve-se em água estéril para um volume total de 100 ml. Filter, alíquota, e armazenar a 4 ° C.
    5. Solução 1 M de HEPES: Pesar 23,8 g de HEPES e dissolvem-se em água estéril para um volume total de 100 ml. Filter, alíquota, e armazenar a 4 ° C.
    6. 70% (v / v) de etanol: Diluir 70 ml de etanol absoluto, com 30 ml de água estéril.
  2. Salina tamponada com fosfato com glicose e antibióticos (PBS-GAB): adicionar 10 ml de solução de glucose a 30% e 5 ml de solução de penicilina-estreptomicina a 500 ml de fosfato de Dulbecco tamponado salino. Armazenar a 4 ° C.
  3. De soro fetal bovino inactivado (ifbs): Descongelar soro bovino durante a noite a 4 ° C e inactiva a 56 ° C durante 30 min. Alíquota em 50 ml e armazenar a -20 ° C.
  4. Meio de Cultura: Em água estéril, misturar sucessivamente 40 mL de 5x DMEM / Ham F12-, 1 ml de HEPES 1 M, 2 ml de 200 mM de L-glutamina, 2 ml de penicilina-estreptomicina, 4 ml de 30% de glicose umaº 3 ml de 7,5% de NaHCO 3 para um volume final de 180 ml. Filtra-se e usar o mesmo dia.
  5. Hormônio Mix
    1. Preparar 180 ml de meio de cultura. Dissolve-se 200 mg de apo-transferrina neste meio.
    2. Pesar 50 mg de insulina e dissolver em 2 ml de 0,1 M de HCl. Adicionar lentamente 8 ml de água estéril, enquanto se mistura com cuidado. Dilui-se esta solução no meio de cultura.
    3. Pesar 19,3 mg de dicloridrato de putrescina e dissolver em 10 ml de água estéril. Adicionar a solução de 10 ml à mistura de hormona.
    4. Prepara-se uma solução de selenito de sódio 3 mM em água estéril e uma solução 2 mM de progesterona em etanol absoluto. Adicionar 20 mL de cada solução para o mix de hormônios.
    5. Filtrar a mistura hormonal, alíquota em 10 ml e armazenar a -20 ° C.

2 Preparação de Pratos e Instrumentos Cultura

  1. FBS revestimento das placas de cultura: O dia antes da dissecção, preparar 180 ml de meio de cultura. Adicionar 10 ml deifbs para 90 ml de meio de cultura. Adicionar 300 ul / poço de meio de cultura / 10% ifbs em pré-revestidas placas de 24 poços com poli-D-lisina. Incubar durante a noite a 37 ° C. Armazene a mídia restante (com e sem OIF) a 4 ° C.
  2. Esterilizar os instrumentos e pipetas Pasteur. Reúna os equipamentos listados na tabela de materiais, bem como uma capa de Classe II de fluxo laminar e uma incubadora de CO 2.

3. Dissection of Mouse Mesencéfalo

  1. Sacrifique um rato grávida E13.5 (de acordo com as diretrizes institucionais). Limpe o abdômen do mouse com etanol 70% e abrir a parede abdominal. Recolha os cornos uterinos, abri-los usando uma tesoura delicada, dissecar cada embrião dos cornos uterinos, e remover as membranas amnióticas. Coloque os embriões em uma placa de Petri 100 milímetros contendo PBS estéril-GAB e lavá-los por transferência em 3 sucessivos banhos idênticos usando uma pinça. Para dissecção, coloque os embriões por 3 em um 60 milímetros placa de Petri estéril.
  2. MovÊ O prato final Petri sob o microscópio estereoscópico. Não decapitar os embriões. Com uma tesoura Vannas, extirpar os cérebros.
    1. Cuidadosamente retire e descarte as regiões das letras e do rombencéfalo. Para o lado rostral, cortada perto do tálamo, para o corte lateral caudal na região do istmo, remover o colículo superior.
    2. Uma vez que o mesencéfalo ventral é isolado, retire cuidadosamente meninges usando uma pinça ultrafinas. Recolher os segmentos dissecados, sem as meninges, em um tubo estéril 13 ml cheio de PBS-GAB.
  3. Limpe o tubo contendo o mesencephala exaustivamente com etanol 70% e trazê-lo sob o capô.

A dissociação 4. celular

  1. Lavar mesencephala 3x com PBS estéril-GAB. Permitir fragmentos do cérebro para resolver entre cada lavagem e evitar a ruptura do tecido. Após a última lavagem, retirar cuidadosamente, tanto quanto possível solução e incubar segmentos cerebrais em 3 ml de tripsina / EDTA durante 15 minutos a 37 ° C numaIncubadora de CO 2.
  2. -Polonês fogo as pipetas de Pasteur para maximizar a sobrevivência dos neurónios como a extremidade de uma pipeta de vidro não polido é afiado e pode danificar as células, durante os passos de dissociação. Reduzir ligeiramente o diâmetro da extremidade (+ 0,5 mm) da pipeta de Pasteur, enquanto fogo polimento-lo.
  3. Remova cuidadosamente tanta solução / EDTA tripsina possível e adicionar 10 ml de meio de cultura / 10% OIF. Segmentos cerebrais Lavar 3x com meio de cultura / 10% OIF.
  4. Utilizando a pipeta de Pasteur polida ao fogo, começam a dissociação de mesencephala em 6 ml de meio de cultura / 10% ifbs. Triturar 10x (evitar bolhas de ar), deixe os pedaços para resolver, em seguida, recolher o meio em um novo tubo estéril 13 ml.
  5. Adicionar 6 ml de meio de cultura, repetir o passo anterior, uma vez e recolher o meio contendo células dissociadas no mesmo tubo de 13 ml.
  6. Centrifugar células a 160 g por 5 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em meio de cultura suplementado com10% de mistura de hormônio.

5. celular chapeamento

  1. Contar as células em suspensão numa célula de Malassez e ajustar o volume do meio a uma concentração de 600.000 células / ml. Cerca de 1,7 milhões de células podem ser obtidas a partir de um mesencéfalo do rato.
  2. Remover FBS contendo meio de revestimento de placas de 24 cavidades e adicionar a cada cavidade 1 ml da suspensão de células (600.000 células / poço, 2-4% das células TH +).
  3. Incubar a placa a 37 ° C e 5% de CO 2/95% ar. Nenhuma mudança de meio é necessário. Neurônios dopaminérgicos estão maduros depois de cerca de 5-7 dias in vitro (expressão consistente do transportador de dopamina). Manter as células em cultura até 15 dias sem substituição médio.

6. Imunofluorescência Protocolo

  1. A limpeza das Lamelas
    1. O dia antes da dissecação, adicionar 10 ml de HCl 1 M em uma placa de Petri. Colocar a superfície dos líquidos 12-15 lamelas de vidro e esperar 15 minutos.
    2. Afundar a tampaescorregar para o líquido e esperar 15 min.
    3. Remover HCl e lavar 3x com água.
    4. Lavam-se as lamelas com etanol puro rapidamente uma vez, em seguida, adicionar etanol puro para o prato e para aguardar 30 minutos.
    5. Sob o capô, remova lamelas limpas a partir de etanol e adicionar uma lamela por poço de 12 poços da placa de cultura de células usando uma pinça esterilizada.
    6. Lavar lamelas duas vezes com água estéril (1 ml / poço). Em seguida, lavá-los uma vez com PBS estéril.
  2. Revestimento das Lamelas
    1. Remover PBS e adicionar 500 uL / ​​poço de 2x PLO (diluído em PBS). Incuba-se durante 4 horas a 37 ° C na incubadora de CO 2.
    2. Remover a solução de PLO e lavar 3x com PBS estéril.
    3. Remover PBS e adicionar 500 uL / ​​poço de 20% ifbs / 1 g / ml de laminina. Incubar durante a noite a 37 ° C na incubadora de CO 2.
  3. Plaqueamento das células de Imunofluorescência
    1. Remover o meio de revestimento a partir de placas de 12 poços.
    2. Adicionar 900,000 células / cavidade em 2 ml de volume e crescer as células a 37 ° C na incubadora. As células podem ser mantidas em cultura 15 dias sem substituição médio.
  4. Imunocoloração
    1. Remover o meio de placas de 12 poços e lava-se com 500 ul / poço de DMEM pré-aquecido a 37 ° C.
    2. Adicione 500 ^ l / poço de DMEM pré-aquecido a 37 ° C, em seguida, adicionar cuidadosamente 160 ul / poço de 8% de paraformaldeído (PFA, 2% de concentração final) e incubar durante 10 min a 37 ° C.
    3. Remover PFA e lavar 3x com PBS / 0,1 M de glicina durante 10 min.
    4. Remover PBS, adicionam-se 300 ul / poço de PBS / 0,05% de Triton X-100/20% de soro de cabra e incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
    5. Remover o meio, adicionam-se 300 ul / poço de anticorpo primário diluído em PBS / 0,05% de Triton X-100/1% de soro de cabra e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente. Os anticorpos primários que podem ser utilizados para a detecção de neurónios dopaminérgicos e caracterização da cultura estão indicados na tabela Materiais. Mantenha1 bem sem anticorpo primário para avaliar a base dos diferentes anticorpos secundários.
    6. Remover o meio e lava-se 3x com PBS / 0,2% de gelatina durante 10 minutos.
    7. Remover o meio, adicionam-se 300 ul / poço de anticorpo secundário diluído em PBS / 0,05% de Triton X-100/1% de soro de cabra e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente, no escuro. Anticorpos secundários utilizados são indicados na tabela de Materiais.
    8. Remover o meio e lava-se 3x com PBS / 0,2% de gelatina durante 10 minutos.
    9. Remover o meio e lava-se 3x com PBS.
    10. Montar as lamelas do lado vidro desliza célula para baixo em uma gota de Vectashield. Mantenha as lâminas à temperatura ambiente durante a noite para deixar a montagem meio seco, em seguida, armazená-los, a 4 ° C.
    11. Adquirir imagens usando um microscópio confocal ou um microscópio de contraste de fase equipado para epifluorescência. Imagens representativas foram adquiridos com um microscópio confocal Leica SP2 UV.

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Resultados

Um fluxograma que ilustra os passos de cultura de mesencéfalo é mostrado na Figura 1. Resumidamente, após a recolha de embriões a partir de um rato E13.5 Swiss grávida, mesencéfalo ventral é dissecado a partir de todo o embrião. Os fragmentos isolados do cérebro são submetidos sucessivamente a digestão enzimática e dissociação mecânica. As células dissociadas foram sedimentadas por centrifugação, ressuspensas em meio de cultura e semeados em placas de 12 ou de 24 poços pré-revestidos. As células são man...

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Discussão

Este protocolo apresenta os procedimentos e reagentes necessários para a preparação de uma cultura primária de neurónios do mesencéfalo do rato embrionário e o procedimento para a detecção de imunofluorescência neurónios dopaminérgicos. As etapas críticas do processo são a dissecção dos embriões ea dissociação mecânica dos fragmentos cerebrais coletados. Instrumentos de dissecção de alta qualidade ajuda a dominar a técnica de dissecação. Neurónios DA constituem uma pequena percentagem do mesencéfalo. Assim, a recolha da...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Apoiado por doações do CNRS e do INSERM. PM agradece o apoio da Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC reconhece o apoio da Fondation de France.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Soro fetal bovinoLonza14-801F
DMEM 4,5 g/L glicose com L-glutaminaLonzaBE12-604F
0,05% Tripsina-EDTA (1x), vermelho de fenolLife Technologies25300-054
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml)Life Technologies15140122
L-glutamina, solução de 200 mMLife Technologies
Dulbecco' s Tamponamento de fosfato SalinoSigma-Aldrich D8537
Dulbecco' s Águia Modificada' s Mistura Média/Nutriente F-12 HamSigma-Aldrich D0547Laminina em Pó
- 1 mg/ml em NaCl Tampolado TrisSigma-Aldrich L2020
Hidrobrometo de poli-L-ornitinaSigma-Aldrich P3655
Insulina do pâncreas suínoSigma-Aldrich I5523
apo-Transferrina humanaSigma-Aldrich T1147
Dicloridrato de putrescinaSigma-Aldrich P5780
ProgesteronaSigma-Aldrich P8783
Selenito de sódioSigma-Aldrich S5261
HEPESSigma-Aldrich H4034 
GlicinaSigma-Aldrich G7126Solução de estoque 1 M em água
GelatinaSigma-Aldrich G9391Solução estoque 2% (p/v) em água
Triton X-100Sigma-Aldrich T8532
Paraformaldeído 16% em águaMicroscopia Eletrônica CiênciasRT 15710-S
Bicarbonato de sódio (NaHCO3)Merck Millipore106329
D(+)-Glicose, MonohidratadoMerck Millipore4074-2
Ácido clorídrico - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) TitripurMerck Millipore109057
Água estéril - Aqua B. BraunBraun
Reagente analítico NORMAPUR absoluto de etanolVWR20821.321
Placas de Petri estéreisVWR82050-566
Pipetas Pasteur de vidro liso - Wilhem Ulbrich GdbR.VWR612-2297
Câmara de contagem MalassezVWR631-0975
Filtro de seringa Acrodisc de soro com membrana de supor, estéril, GF/0.2 µ m, 37 mmPALL Ciências da vida4525
Tesoura cirúrgica - reta, afiada-afiada, 14,5 cm de comprimentoFerramentas de Belas Ciências14002-14Para abrir a parede abdominal
Tesoura - Reta, pontiaguda, delicada, 10 cm de comprimentoMORIA4877APara abrir a parede uterina
Fórceps - Maxilares curvos, usuais, serrilhados 1 mmMORIA2183Para manipular embriões
Tesoura Vannas - Curva, pontiaguda, lâminas de 7 mmMORIAMC50Para retirar o mesencéfalo
Fórceps Ultra Fino - Curvo, delicado, 13 cm de comprimentoMORIA9987Para remover meninges
BD BioCoat Poly-D-Lysine Placas Multipoços de 24 poçosBD Bioscience356414
Placa de cultura de células BD Falcon de 12 poços, fundo plano com tampaBD Bioscience353043
Lâminas de Microscópio SuperFrost, Bordas retificadas 90ºMENZEL-GLÄ SERAG00008032E
Vidro de cobertura de precisão espessura nº 1,5H circular 18 mm ØMARIENFELD117580
Anticorpo Policlonal de Proteína 2 Associada a Microtúbulos de Coelho (MAP2)Chemicon MilliporeAB56221/200
Anticorpo Monoclonal de Camundongo Anti-Glutamato Descarboxilase (GAD67), clone 1G10.2Chemicon MilliporeMAB54061/400
Anticorpo Monoclonal de Transportador de Dopamina de Rato (DAT), clone DAT-Nt Chemicon MilliporeMAB3691/500
camundongo monoclonal anti-5-HT1/8,000 - Presente generoso de Yves Charnay (Suíça, Yves.Charnay@hcuge.ch)
Soro de cabra, origem da Nova ZelândiaLife Technologies16210-064
Alexa Fluor 405 Anticorpo Anti-Coelho IgG (H+L) de cabraLife TechnologiesA-315561/200
Alexa Fluor 488 Anti-Rato de Cabra IgG (H+L) AnticorpoLife TechnologiesA-110011/1,000
Alexa Fluor 594 Anti-Rato de Cabra IgG (H+L) AnticorpoLife TechnologiesA-110071/1,000
VECTASHIELD HardSet Montagem MédiaEstereomicroscópio Vector LaboratoriesH-1400
Microscopia Carl ZeissStemi-2000C
Queimador de Bunsen FIREBOYVWR451-0136
25030123Anticorpo de

Referências

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