Conta Agregação ensaios para a caracterização dos putativos Moléculas de Adesão Celular

Summary

Aqui apresentamos um método simples e rápido para caracterizar as propriedades adesivas intrínsecas de moléculas putativas de adesão celular. O ectodomínio secretado e marcado com epítopos de uma molécula de adesão celular é capturado do meio de cultura em grânulos funcionalizados pequenos e uniformes. Esses grânulos podem então ser usados imediatamente em ensaios simples de agregação de grânulos.

Abstract

A adesão célula-célula é fundamental para a vida multicelular e é mediada por uma série diversa de proteínas da superfície celular. No entanto, as interacções adesivas para muitas destas proteínas são mal compreendidos. Aqui apresenta-se um método simples e rápido para a caracterização das propriedades adesivas das moléculas de adesão de células homofílicas putativos. As células em cultura são HEK293 transfectadas com o plasmídeo de ADN que codifica uma secretado, o ectodomínio de epitopo marcado com uma proteína da superfície celular. Usando grânulos funcionalizados específicos para o marcador de epitopo, solúvel, da proteína de fusão segregado é capturado a partir do meio de cultura. Os grânulos revestidos podem, então, ser utilizada directamente em ensaios de agregação de grânulos ou em grânulo fluorescente triagem ensaios para testar quanto à adesão homofílica. Se desejado, a mutagénese pode ser usada para elucidar os ácidos aminados ou domínios específicos necessários para a aderência. Este ensaio requer apenas pequenas quantidades de proteínas expressas, não requer a produção de linhas celulares estáveis, e pode ser Accomplished em 4 dias.

Introduction

A adesão célula-célula é essencial para o desenvolvimento e a integridade dos organismos multicelulares e é mediada por uma série diversa de moléculas da superfície celular. Muitas dessas moléculas de adesão foram identificados e caracterizados, embora muitos continuam a ser descobertos. Vários métodos são utilizados para pesquisar as propriedades das moléculas de adesão celular (CAMs), incluindo ensaios de separação de células, ensaios de agregação de células ^1-8 e métodos biofísicos, tais como microscopia de força atómica e força espectroscopia superfície ^9-12.

A complexidade do mesmo simplificada em sistemas in vitro utilizando linhas celulares torna difícil determinar as propriedades adesivas de uma CAM putativo. Tipicamente, uma molécula é considerada uma CAM se que induz a agregação de células, quando transfectados para uma linha de células não adesivas. No entanto, é evidente que esta não é uma evidência directa de actividade adesiva. Por exemplo, facilitar a entrega da superfície celular ou a estabilidade de umCAM também resultaria em aumento da agregação de células ^1,13. Além disso, um verdadeiro CAM pode falhar para mediar a agregação de células, se a linha de células não possui outros co-factores necessários para a entrega de superfície celular ou de estabilização.

Para evitar essas complicações, ensaios mais diretas podem ser empregadas que são baseados na idéia de que as interações adesivas deve ser uma propriedade bioquímica intrínseca do domínio extracelular. Enquanto contas foram inicialmente utilizados para caracterizar Ng-CAM ^2, estes ensaios foram alargadas, a fim de investigar a adesão ^12,14,15 mediada por caderina. Usando fusão das fusões C-caderina-Fc ectodomínio, o laboratório Gumbiner mostrou que múltiplas repetições caderina contribuem para interacções homofílicas ^14. Usando ensaios de agregação de talão comparáveis, E-caderina e N-caderina de adesão foram também caracterizados ^12,15, como tem um número de protocadherins ^1,15-18 e isoformas Dscam de Drosophila ^19. Descrevemos aqui um ensaio relativamente simples e rápido para a caracterização da actividade adesiva de secretadas, ectodom�ios marcadas no epitopo de CAMs homofica putativos (Figura 1). Temos utilizado este ensaio, principalmente para caracterizar membros da superfamília caderina.

Protocol

1. celular Preparação (Dia -2 a 0)

1. Dividir células HEK293 1: 5, utilizando 0,05% de solução de tripsina-EDTA e incubar em Meio de Crescimento a 37 ° C com 5% de CO ₂ até os 60 - 80% confluentes (2-3 dias). Para cada condição, as células de cultura em 2 x 100 mm pratos.

2. transfecção celular (Dia 1)

1. Transfectar células HEK293 com o plasmídeo que codifica a Fc-fusão usando um reagente de transfecção, tais como Lipofectamina. Podem também ser utilizados métodos alternativos, que resultam em maior eficiência de transfecção comparável.
2. Voltar células transfectadas para incubadora por 24 horas.

3. celular Propagation (Dia 2)

1. Pré-aqueça o Meio de Crescimento, sem soro fetal de bovino (-FBS) a 37 ° C.
2. Lavar pratos 2x com 10 ml de Meio de Crescimento -FBS, e retornar as placas para a incubadora a 37 ° C durante 1 hora.
3. Lavar a culturas pratos mais uma vez com 10 ml de Meio de Crescimento -FBS, para um total de 3 lavagens.
4. INCUbate as células HEK293 transfectadas a 37 ° C por mais 48 horas sem FBS antes de coletar mídia.

4 Bead Aggregation (dia 4)

1. Para a coleta de mídia a partir de placas de cultura, transferir mídia de cada par de pratos para 50 ml tubos cônicos e rotação a 500 xg durante 5 min para sedimentar os restos celulares.
2. O meio filtrante de tubo de 50 ml em um filtro centrífugo usando uma seringa de 30 ml e 0,45 mm filtro de seringa.
3. Girar filtros centrífugos a 4.000 xg e 4 ° C até que o volume de meio de cultura concentrado é de cerca de 500 mL (aproximadamente 15 min). Repita até que todos os meios de cultura foi adicionado e concentrada.
4. Adicionar 1,5 uL de proteína G contas magnéticas para 1 ml de tampão de ligação arrefecido em gelo, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para cada amostra, em lugar de um íman e remover o tampão. Imediatamente adicionar o meio de cultura concentrado de proteína G esferas magnéticas.
5. Rodar os tubos a 4 ° C durante 2 horas.
6. Pltubos ace em um ímã e remover a mídia. Lavar rapidamente contas duas vezes com o frio do gelo 1 ml tampão de ligação e, em seguida ressuspender contas em 300 mL tampão de ligação.
7. Dividir contas ressuspenso em 2 tubos de 150 mL em cada tubo, e em seguida, adicione 1,5 mL de mM _CaCl2 ou 200 EDTA 200 mM para o "cálcio" e condições "não cálcio", respectivamente.
8. Transferir 100 uL de cada condição para uma depressão bem deslizar e recolher micrografias usando um microscópio de luz transmitida (Figura 2). Recolha de imagens a partir de 5 campos de visão de cada experiência em cada ponto de tempo desejado.

Análise de Dados 5.

1. Usando ImageJ, ou software de análise de imagem comparável, abra um dos cinco conjuntos de dados de imagem usando o Import / sequência de imagens ... no menu suspenso Arquivo. Estes irão ser aberto como uma pilha de imagens.
2. Na caixa de diálogo ... Imagem / Propriedades, altere o iunidades mago pixels e definir Pixel Largura e Altura Pixel é 1.0.
3. Converta as imagens para binário usando o / Threshold Ajuste ... comando no menu suspenso Imagem. Definir o limite de incluir pixels que contribuem para esferas ou agregados de contas, mas que exclui fundo e pequenas partículas. Aplicar a todas as imagens da pilha.
4. Na caixa de diálogo Medidas Set, marque as caixas área e Pilha Posição.
5. Executar análise Partículas ... menu suspenso na Análise. Isto vai gerar uma lista de partículas identificados, incluindo o seu tamanho (área) e a imagem em que foram identificadas.
6. Repetir este processo por que experimento e condição experimental.

Results

Um exemplo experiência é apresentado na Figura 2, que mostra a agregação de grânulo dependente de cálcio pelo ectodomínio de N-caderina fundido com Fc (NcadEC-Fc). Na ausência de cálcio, esferas exibem pouca ou nenhuma tendência para se agregar e não há aumento do tamanho do agregado, com o tempo (Figura 1A, C). Na presença de cálcio, contas revestidas com NcadEC-Fc mostra a agregação robusta, com tamanho de agregado crescente ao longo do tempo (Figura 1B, C). Esta expe...

Discussion

A adesão celular é um elemento essencial da vida multicelular e é mediada por uma ampla gama de proteínas de superfície da célula. Destes, as propriedades adesivas são detalhados compreendido por apenas uma proporção relativamente pequena. Aqui, nós descrevemos um protocolo simples, rápido para investigar a capacidade adesiva homofica de ectodom�ios secretadas fundido com um epítopo marcador conveniente. Esta abordagem tem um número de vantagens importantes. Em primeiro lugar, as linhas de células estáveis ​​não são n...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
plasmídeo pFc-N1	Addgene	A ser submetido
HEK293 células	American Type Culture Collection	CRL-1573
DMEM	Mediatech - Corning	10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F2442
100x Pen-Strep (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122
0,05% Tripsina-EDTA	Life Technologies	25300054
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668030
Dynabeads – Proteína G	Life Technologies	10003D
Soro Bovino Albumina	Sigma	A3294
Lâminas de Depressão	Microscopia Eletrônica Ciências	71878-06
Unidade de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-15 com membrana Ultracel-10	Millipore	UFC901024
0,45 mm	Sarstedt	83.1826
Dynamag-2 Magnet	Life Technologies	12321D
Fiji (ImageJ) Software de análise de imagem	http://fiji.sc/Fiji
Tabela de tampões/soluções
Mídia de crescimento	DMEM + 10% FBS + Filtro Pen-Strep	esterilizar e armazenar a 4 °C.
Mídia de crescimento - FBS	DMEM + Filtro Pen-Strep	esterilizar e armazenar a 4 °C.
Tampão de ligação	50 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,2% BSA	Vórtice até dissolver, manter no gelo.