Determinação de interacções proteína-ligante Usando Differential Scanning Fluorimetria

Resumo

A fluorimetria de varredura diferencial é um método amplamente utilizado para triagem de bibliotecas de pequenas moléculas para interações com proteínas. Aqui, apresentamos um método simples para estender essas análises para fornecer uma estimativa da constante de dissociação entre uma pequena molécula e seu parceiro proteico.

Resumo

Uma grande variedade de métodos estão disponíveis para a determinação da constante de dissociação entre uma proteína e as moléculas pequenas interagem. No entanto, a maioria destes requerem acesso a equipamento especializado, e muitas vezes exigem um grau de conhecimento para efetivamente estabelecer experimentos confiáveis ​​e analisar dados. Fluorimetria exploratória diferencial (DSF) está sendo usado cada vez mais como um método robusto para a triagem inicial de proteínas para interagir moléculas pequenas, tanto para a identificação de parceiros fisiológicas ou para a descoberta hit. Esta técnica tem a vantagem de que ele requer apenas uma máquina de PCR adequados para a PCR quantitativa, de modo adequado e instrumentação disponível na maioria das instituições; uma excelente gama de protocolos já estão disponíveis; e há fortes precedentes na literatura para múltiplos usos do método. Últimos trabalhos propôs vários meios de cálculo constantes de dissociação de dados QSD, mas estes são matematicamente exigente. Aqui, nós demtrar um método para estimar as constantes de dissociação a partir de uma quantidade moderada de dados experimentais DSF. Esses dados geralmente pode ser coletados e analisados ​​em um único dia. Demonstramos como diferentes modelos podem ser usados ​​para ajustar os dados coletados a partir de eventos de ligação simples, e onde os sítios de ligação ou ligação independente cooperativas estão presentes. Por fim, apresentamos um exemplo de análise de dados em um caso em que os modelos padrão não se aplicam. Estes métodos são ilustrados com os dados recolhidos em proteínas de controlo comercialmente disponíveis, e as duas proteínas do nosso programa de pesquisa. No geral, o nosso método fornece uma maneira simples para que os pesquisadores ganhar rapidamente uma visão mais aprofundada interações proteína-ligante utilizando DSF.

Introdução

Todas as proteínas vão ligar, com afinidades diferentes, para uma variada gama de outras moléculas de íons simples para outras grandes macromoléculas. Em muitos casos, as proteínas se ligam a pequenas parceiros da molécula, como parte da sua função normal (por exemplo, ligação de uma cinase de ATP). Outras interacções podem não estar relacionadas com a função, mas são úteis como ferramentas experimentalmente (por exemplo, moléculas pequenas que estabilizam proteínas para melhorar o sucesso de cristalização, ou ajudar a manter as proteínas em solução); enquanto que as moléculas pequenas que se ligam a locais activos e locais alostéricos das proteínas podem agir como inibidores e assim modular a actividade de enzimas.

Há uma grande variedade de técnicas que podem ser utilizadas para determinar a afinidade de proteínas de moléculas parceiras. Calorimetria isotérmica de titulação ¹ é amplamente visto como um "padrão-ouro", uma vez que fornece informações ricas sobre as reações, é o rótulo de livre, e tem oportunidades limitadas para umartifacts do experimento. No entanto, apesar das recentes melhorias na sensibilidade da instrumentação e automação de set-up experimental, ainda é relativamente caro em termos de exigências de proteína, tem no máximo um rendimento baixo e médio, e é mais adequado para interações com moderada a afinidades elevadas (10 nm a 100 M K _d) ^2. Outros rótulo métodos gratuitos, como ressonância de plasma de superfície ou bicamada interferometria ³ oferta débitos mais elevados, e ter conseguido a sensibilidade para detectar moléculas menores tão baixas quanto 100 Da. No entanto, os instrumentos de alto rendimento para estes métodos são relativamente caros, só se justificam em que haverá uma taxa de transferência contínua de projetos relevantes, e por isso é provável que sejam inacessíveis para muitos laboratórios acadêmicos.

Fluorimetria de varrimento diferencial (DSF ou thermofluor) foi descrita pela primeira vez em 2001 ⁴ como um método para a descoberta da droga. Neste metod, as proteínas são incubadas com um corante fluorescente (foram utilizados corantes inicialmente naftaleno-sulfónico), o qual altera a sua fluorescência após ligação para as regiões hidrófobas das proteínas. A amostra de proteína-corante é, em seguida, aquecida, e a fluorescência monitorizada como o calor aumenta. O desdobramento da proteína, e a exposição das partes hidrofóbicas da proteína, dá origem a um padrão característico da fluorescência como uma função de temperatura (Figura 1A). A experiência pode ser realizada em pequenos volumes em qualquer instrumento de PCR quantitativo comercial, e assim numa única experiência, um grande número de amostras podem ser testadas simultaneamente (normalmente 48, 96 ou 384 amostras, dependendo do modelo de instrumento). Experiências pode geralmente ser realizada em cerca de uma hora, dando a possibilidade de análise de alto rendimento das amostras ^5.

Outras melhorias na metodologia de ter visto a adoção de corantes com melhores propriedades espectrais ^6,7 , ferramentas genéricas para análise de dados, e sugeriu protocolos para a triagem inicial ^8,9. A gama de aplicações do método foi estendido, com um foco particular em estabelecer as condições ideais para a preparação e armazenamento de proteínas ^10, e na identificação de potenciais parceiros de ligação para ajudar a cristalização ^11. O relativamente elevado rendimento do método, de custo relativamente baixo teor em proteína (~ 2 g por reacção), e a aplicabilidade ao estudo de moléculas de ligação fracas fez DSF uma ferramenta valiosa para a concepção de fármacos com base fragmento, especialmente no contexto académico ^12-14.

Apesar da ampla aplicação da DSF para estudar as interações proteína-ligante, poucos estudos têm descrito a determinação de constantes de dissociação desses estudos. No entanto, estes tendem a produzir equações detalhados que descrevem o desdobramento da proteína, com muitos parâmetros que devem ser equipados com dados esparsos ou em alguns casos, ecalculados a ^7,15-17. Estes métodos são de particular relevância nos casos difíceis, tais como os compostos de ligação com força, ou proteínas que apresentam transições incomuns. No entanto, para muitos laboratórios, estas análises detalhadas são demasiado pesado para uso rotineiro. Propomos, portanto, tratamentos alternativos para diferentes cenários, e demonstrar como estes podem ser usados ​​para ajustar os dados resultantes de diferentes interações proteína-ligante. Nosso método utiliza o instrumento StepOne qPCR, para que o software de análise de dados sob medida está disponível; enquanto que esta aumenta a velocidade de análise de dados, os resultados de outros instrumentos podem ser processadas utilizando os métodos previamente publicados ^9, e a mesma análise a jusante pode ser realizada.

Protocolo

1 Determinação de um valor aproximado para a constante de dissociação (ou seja, dentro de uma ordem de grandeza)

1. Preparar a mistura detalhado na Tabela 1.
2. Prepare stocks do ligante de interesse na maior concentração disponível, e então em seis de dez diluições desta. Onde um K _d de aproximadamente é conhecida a partir dos dados anteriores, o objectivo de ter pelo menos duas concentrações acima e abaixo do K _d.
3. Aliquota de 18 ul da mistura em oito poços de uma placa em qPCR. Adicionar 2 mL de solvente para o primeiro poço. Adicionar 2 mL de cada membro da série de diluição de ligando (passo 1.2), bem cada um dos restantes sete poços.
4. Coloque um selo sobre a placa de qPCR. Para alcançar uma boa vedação da placa, colocar um aplicador de mão (ver tabelas de reagentes específicos) no centro da placa. Alisar o selo para um lado e repita na outra metade doda placa.
5. Centrifugar a placa a 500 x g durante dois minutos para remover as bolhas de ar.
6. Coloque a placa em um instrumento StepOne qPCR. Seleccione a opção "curva Melt", os filtros ROX, e escolher a velocidade rampa rápida (isto proporciona uma pausa de 2 min a 25 ° C, seguido de uma rampa de 99 ° C durante 40 minutos, e, em seguida, uma pausa de 2 min). Executar uma desnaturação térmica.
   NOTA: Os arquivos de script para a realização de uma corrida estão disponíveis online em http: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.
7. Na conclusão do instrumento de execução, clique no botão "Analisar" na tela. Salve o arquivo de resultado.
8. Abra o software Protein deslocamento térmico.
   1. Criar um novo estudo; na aba de propriedades, dar a este um nome, e na guia Condições, detalhar os ligantes.
   2. Mover para a aba Arquivos Experiment, e importar o arquivo salvo resultados (XXX.eds), e definir o conteúdo de cada poço (modelo files estão disponíveis a partir dos autores).
   3. Mude para a guia Análise, e pressione o botão "Analisar".
      NOTA: Isto irá analisar os resultados. É possível exportar os resultados para uma investigação mais aprofundada com o Excel usando a guia de exportação. Os resultados são exportados em um formato de guia delineada. É melhor abrir o arquivo exportado no Excel, e imediatamente salve em formato Excel.
9. Verificar que a proteína na presença de solvente sozinho dá um resultado semelhante ao mostrado na Figura 1A. Em seguida, examinar as temperaturas de fusão observados nos resultados no painel "replicar". Certifique-se de que isso mostra um claro aumento na temperatura de fusão com o aumento da concentração do ligante.
   NOTA: Idealmente, isto irá proporcionar uma temperatura máxima de fusão claro (assumindo que a proteína é completamente ligando ligado), e um K _d aproximado em que a temperatura de fusão está a meio caminho entre a proteína e sem ligandoo máximo.

2. Experimental Set-up para a determinação da constante de dissociação

1. Preparar a mistura detalhado na Tabela 2, tal como uma mistura de base.
2. Prepare a existências do ligando em quinze concentrações diferentes, que serão diluídas dez vezes na última experiência. O ideal é incluir as concentrações de pelo menos duas ordens de magnitude acima e abaixo da estimada K _d, e do centro de concentrações no estimada K _d. Concentre-se em sete dos pontos dentro de uma ordem de grandeza da estimativa K _d, com mais quatro pontos em ambos os lados deste; se existe uma escolha, incluir mais pontos em que os valores são saturantes.
   NOTA: Se necessário, é possível alterar as condições experimentais tais que as unidades são ligandos com o dobro da concentração experimental, onde a solubilidade do ligando é limitante.
3. Adicionar 120 mL do mestremisture até oito poços em um U-fundo placa de 96 poços, para atuar como um reservatório para distribuição conveniente da mistura principal. Use uma pipeta de 8 canais para dispensar 18 ul em uma coluna de uma placa de PCR. Repita durante mais cinco colunas, para dar um total de 48 poços cheios com um padrão de 6 x 8 na placa.
4. Adicione 20 l de os estoques ligante, ou solvente, para separar poços em um U-fundo placa de 96 poços. Usando uma pipeta de 8 canais, aspirado 2 l de oito ações ligantes diferentes (ou solvente). Adicionar estas para uma coluna da placa de PCR, que foi enchida com uma mistura mestre no passo 2.3. Repita o procedimento com os mesmos oito ligando / stocks de solventes para mais duas colunas. Aspirar 2 ul de oito existências ligando ou solventes remanescentes, e adicione-os a uma quarta coluna na placa. Repita esse procedimento para mais duas colunas. Isto vai dar amostras em triplicado para todos os 16 ligando e as amostras de solvente.
5. Coloque um selo sobre a placa de qPCR (ver passo 1.4).
6. Centrifugar a placa a 500 xg durantedois min.
7. Coloque a placa no instrumento qPCR. Executar uma desnaturação térmica usando os parâmetros especificados no passo 1.6.
8. Na conclusão do instrumento de execução, clique no botão "Analisar" na tela. Salve o arquivo de resultado.
9. Abra o software Protein deslocamento térmico. Criar um novo estudo; na aba de propriedades, dar a este um nome, e na guia Condições, detalhar os ligantes.
10. Mover para a aba Arquivos Experiment, e importar o arquivo salvo resultados (XXX.eds), e definir o conteúdo de cada poço.
    NOTA: arquivos de modelo estão disponíveis online em http: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.
11. Mude para a guia Análise, e pressione o botão "Analisar".
    1. Escolha a aba "réplicas" no menu do lado esquerdo da tela para mostrar os resultados como triplicatas. Avaliar a confiabilidade dos dados com base em quão apertado as triplicatas são. Should as triplicatas mostram uma reprodutibilidade, examinar os dados brutos de perto.
    2. Analisar os dados usando tanto o Boltzmann ou métodos derivativos para avaliar a temperatura de fusão. Selecione a opção "Replicar resultados" guia, e no "Replicar resultados enredo", alterne o "Plot por:" botão entre "Tm - Boltzmann" e "Tm - Derivado". Seleccione o método que dá a maior reprodutibilidade para a amostra. Exportar os resultados para uma investigação mais aprofundada com o Excel usando a guia de exportação.
       NOTA: Para obter exemplos que mostram várias transições, é quase sempre melhor usar o método derivativo no modo de fusão múltipla. Os resultados são exportados em um formato de guia delineada. É melhor abrir o arquivo exportado no Excel, e imediatamente salve em formato Excel.
    3. Repita a experiência, no mínimo, por duas vezes, incluindo a repetição de um dia separado, para assegurar a reprodutibilidade dos resultados. Caso a análise de dados (consulte a etapa 3 abaixo)indicam que o valor de K _d é significativamente diferente para o cálculo inicial, alterar as concentrações de ligando em conformidade (ver passo 2.2) para garantir uma boa gama de valores de cerca de K _d.

    3 Análise de dados para determinar a constante de dissociação sob desnaturação térmica

    1. Criar uma tabela no Excel da concentração de ligando e a temperatura de fusão.
    2. Abra o software GraphPad Prism, e criar uma mesa XY. Entre os dados, usando a coluna de X para as concentrações de ligando e a coluna de Y para a fusão de temperatura resulta.
       NOTA: um exemplo é mostrado Figura 1B. Um roteiro com as equações pré-carregados e instruções alternativas para a utilização do pacote estatístico SPSS, estão disponíveis online em http: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.
    3. Na guia Análise, selecione a opção para alterar o parâmetro de análises (Ctrl + T). Para entrar no modelo correto, selecione "New" e "Criar uma nova equação". Inserir a equação detalhado na Tabela 3 como "sítio de ligação do ligando Single".
       NOTA: Um exemplo dessas medidas é mostrado na Figura 1C. Quando se utiliza o script pré-carregado com equações, a equação pode ser dirigida relevante escolhido a partir da lista, em vez de inserido. Derivação desta equação é fornecida em um apêndice.
    4. Selecione as "regras de Valores Iniciais" caixa e digite regras para os valores iniciais, conforme detalhado na Tabela 3.
    5. Restringir o parâmetro P, como "constante igual a" e introduzir a concentração final de proteína (nas mesmas unidades que o ligando é dada em).
    6. Selecione OK para realizar a análise.
       NOTA: Um exemplo dessas medidas é mostrado na Figura 1D. O programa gráfico produz uma figura que mostra os dados e o ajuste para o modelo. Exemplos de tstas análises são apresentados nos dados representativos.

    4. Ajustando os dados para modelos cooperativos

    Para ajustar os dados para um modelo de cooperativa, ou escolher entre um modelo de cooperativa simples, ou um modelo onde duas constantes de dissociação separados são definidos. A primeira abordagem é o preferido no caso de uma cooperatividade negativa, ou como uma investigação inicial. No entanto, em princípio, é melhor nos casos de cooperatividade positiva para modelar dois dissociação diferentes constantes ^18. Neste caso, a modelagem pode continuar assumindo qualquer ligação sequencial de ligantes, ou ligação independente de ligantes.

    1. Siga os mesmos passos iniciais como no protocolo 3 No entanto, no passo 3.3, inserir uma das equações na Tabela 3 listado como "modelo cooperativo Simples", "ligação sequencial de dois ligantes", ou "Independent ligação de dois ligantes" ^18.
    2. Selecione as regras aplicáveis ​​para valores iniciaisassociada com cada uma destas equações na Tabela 3.
    3. Examinar o ajuste do modelo aos dados. Se os dados se encaixam mal, considere um outro modelo.
       NOTA: também é importante analisar cuidadosamente a montagem da temperatura de fusão de dados pelo software deslocamento térmico Protein (passo 2.9): às vezes é necessário alterar os parâmetros aqui para obter os melhores resultados. Outra consideração é se o intervalo de pontos de dados é o ideal, e se existem pontos anômalos: ou um conjunto limitado de dados de ambos os lados de K _d, ou um único ponto anômalo (especialmente nas concentrações mais altas ligante), pode afetar significativamente os resultados.
    4. Repita a experiência, no mínimo, por duas vezes (ver passo 2.12) para assegurar a reprodutibilidade.

    5. Ajustando os dados para curvas que mostram deslocamentos binários na temperatura de fusão

    Ocasionalmente, em vez de uma resposta graduada a ligando, as proteínas foramObservou-se adotar uma resposta binária, onde a amostra ligado é nitidamente separada da amostra não ligado. Um exemplo é fornecido nos resultados representativos (Figura 4). Neste caso, a montagem das temperaturas de fusão não irá proporcionar um bom ajuste para K _d.

    1. Exportar a saída de dados brutos do Protein software deslocamento térmico. Para cada ponto de temperatura, o cálculo da média de fluorescência para o ligando de zero, e as concentrações mais elevadas de ligandos. Tabular os resultados a partir de cada ponto de dados seguinte a estes.
       NOTA: O erro criado aqui é menor do que o erro nas temperaturas de fusão embutidos.
    2. Abra o pacote estatístico SPSS. Copie as temperaturas, os dois conjuntos de dados médios, e os dados de cada experimento para uma janela de dados em SPSS. Na aba variável, definir o conjunto de dados médio para não ligando como "baixo", eo conjunto de dados média para a maior concentração ligante como "alto".
    3. Baixe o arquivo de sintaxe disponívelon-line em http: // www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular . Selecione "Executar → Executar tudo".
    4. Copie a proporção resultados ligados a um novo livro do Excel, com as concentrações ligando relevante.
    5. Abra o software Graphpad, e criar uma mesa XY. Entre os dados, usando a coluna de X para as concentrações de ligando e a coluna de Y para a fusão de temperatura resulta. Na guia de análise, selecione "parâmetros de análise mudança". Para entrar no modelo correto, selecione "New" e "Criar uma nova equação". Introduza a equação dada na Tabela 3, listados como "análise de desvios em binários temperatura de fusão".
    6. Marque a caixa "regras para os valores iniciais", e inserir regras para valores iniciais detalhados na Tabela 3. Restringir o parâmetro P, como "constante igual a" e digite a concentração final de proteína (nas mesmas unidades que a ligand é dada em).
       NOTA: exemplos de concluir essas caixas para o protocolo na seção 3 são mostrados na Figura 1C, D.
    7. Se existe um bom ajuste, os resultados podem ser melhorados através da extrapolação do resultado esperado na concentração do ligando infinito. A partir do modelo da parte ligada a cada concentração de ligando, examinar o valor para o valor mais alto de concentração do ligando. Se esta é 0,99 ou maior, é improvável para melhorar os resultados uma análise mais aprofundada.
    8. Se a proporção é inferior a 0,99, uma etapa adicional é requerido para corrigir os efeitos da proteína não ligada na amostra mais elevada concentração de ligando. No passo 5.2, escrever a proporção de ligando ligado ao ponto de maior concentração de ligando (a partir do passo 5.7) em célula R2 (uma célula diferente, podem ser utilizados, e R2 apropriadamente substituído na equação na Tabela 3). Criar uma coluna extra após a média dos valores mais elevados de concentração de ligando. Nos abetoscélula T, copiar a equação listadas na Tabela 3 como "A extrapolação para o infinito concentração do ligando". Copie esta fórmula para as células restantes nesta coluna.
       NOTA: Este cálculo remove o efeito da proteína não ligada na concentração mais elevada de ligando. A diferença entre a proteína do ligando livre e a concentração mais elevada de ligando é multiplicado pelo inverso da percentagem ligada a uma concentração mais elevada de ligando para proporcionar a diferença esperada entre estados proteína totalmente ligadas e não ligadas, em cada ponto de temperatura. Esta diferença é adicionado ou subtraído do estado desagregado para dar a fluorescência esperado para a proteína totalmente ligando ligados.
    9. Substituir a coluna para a concentração máxima ligando na folha de dados SPSS com esta nova coluna, e repetir o ajuste de dados.
       NOTA: os passos 5,7-5,9 pode precisar ser repetido se o modelo sugere uma nova mudança significativa na proporção ligação nas concentrati máximas liganteem (se este for o caso, provavelmente seria ideal para repetir o experimento com um ponto de concentração de ligante superior incluído).
    10. Nos casos em que a proteína apresenta um comportamento cooperativo deslocamento binário e exibe, a equação sugerida no passo 5.5 devem ser substituídos com aqueles do passo 4.1. Os parâmetros "fundo" "Top" e deve ser substituído por 1 e 0, respectivamente.
    11. Repita a experiência, no mínimo, por duas vezes (ver passo 2.12) para assegurar a reprodutibilidade.

Resultados

Um teste de substrato excelente para este método é hexoquinase. Isto tem a vantagem de ser facilmente disponíveis comercialmente, e com dois substratos que são encontrados na maior parte dos laboratórios, e que proporcionam resultados claros e reprodutíveis no ensaio. Uma tela de concentração inicial (protocolo 1), usando hexocinase e glucose (Figura 2A), sugerindo que a probabilidade de K _d irá estar no intervalo 0,2-1,7 mM. Portanto, uma tela maior (Protocolo 2) foi realizada, usando as concentrações apresentadas na Tabela 4 Os resultados (Figura 2B) mostra um bom ajuste com a equação de ligação única ligando local (secção 3.3 Protocolo) [9], e deu um K _d de 1,2 ± 0,1 mM.

A transferase putativa heptose-guanil WcbM ^19,20 mostra uma forte transição térmica na ligação a GTP (Figura 3A). Uma tela inicial sugeriu que o K_d seria na gama de cerca de 100 uM. Portanto, uma tela cheia foi definido acima, usando as concentrações apresentadas na Tabela 5 montagem dos resultados à equação 3.3 mostrou um ajuste razoável ^(R2 de 0,981; Figura 3B). .Contudo, Existe uma diferença evidente entre os dados e o modelo, o que sugere que uma equação diferente é necessária. Busca do Databank Protein ²¹ com a sequência WcbM mostrou que os homólogos mais próximos para que as estruturas foram determinadas dímeros formulário. Os dados foram analisados ​​utilizando-se, portanto, as três equações para cooperativa, seqüencial e independente de ligação de dois ligantes (Protocolo 4). As estatísticas de ajuste para um modelo de cooperativa deu um valor de 0,998 R ² e desvio-padrão dos resíduos (Sy.x) de 0,215, enquanto que ambos os modelos de ligação seqüenciais e independentes deu um valor de 0,992 R ² e um Sy.x de 0,480 e 0,461 respectivamente. Isto sugere que o modelodando o melhor ajuste aos dados foi o modelo cooperativo: aqui, um K _½ de 230 ± 10 mM foi observada, com um valor de 0,52 ± n 0,02 (Figura 3C). Isto indicou uma cooperatividade negativa para a ligação. Note-se que um K _½ foi utilizada, neste caso, em vez de K _d, como as unidades de K _d seria o bastante insatisfatório ^0,52 uM.

O putativo PIB-6-desoxi-D-mano-β -heptopyranose 2-O -acetylase, WcbI ^22, mostra um resultado bastante invulgar na fluorimetria de varrimento diferencial. Na ausência de quaisquer ligantes, que mostra uma clara desnaturação e simples (Figura 4A). Coenzima A (CoA), foi identificado como um ligando de proteína utilizando este DSF, e a afinidade da proteína para este parceiro foi investigada tal como descrito no protocolo. Na presença de concentrações elevadas de CoA, um forte shift a uma temperatura mais elevada é observada, com uma mudança na temperatura de fusão de 15 ° C. No entanto, em concentrações intermédias, mais do que uma mudança para um monofásico de fusão a uma temperatura de fusão intermédia, WcbI mostrou uma fusão bifásico, com a proteína de fusão que aparecem quer na temperatura do ligando livre, ou a temperatura de fusão totalmente ligado (Figura 4A) . As proporções das duas espécies modificadas de uma forma dependente da dose, com concentrações crescentes de substrato aumentando a proporção de produto que fundiu a uma temperatura superior (Figura 4B). A análise direta destes dados foi um desafio: encaixe com a equação de Boltzmann deu encaixa muito pobres, enquanto que os métodos derivados destacou que dois eventos de fusão foram ocorrendo, mas não contribuiu para demonstrar a mudança com o aumento da concentração do ligante.

Uma abordagem menos convencional para a análise desses dados foi, portanto, adoptada (Protocolo 5). A fluorescência dResultados erivative sem ligando e com a concentração mais elevada de ligando foram tomados como representando essencialmente toda a proteína em que a temperatura de fusão mais baixa, ou a temperatura de fusão mais elevado estado. Os restantes dados derivados foram montados em cada ponto pela soma de uma parte de cada um destes dois estados, com a proporção resumiu a unidade (Figura 4C). Os dados obtidos foram, em seguida, equipado como anteriormente, para se obter um K _d aparente, utilizando-se as mesmas equações como antes. Este destacou que o "alto" ponto ligante é provável que seja apenas 95% ligando ligados. Os dados foram depois extrapolados para uma previsão do resultado para uma proteína ligada de 100%, e o ajuste dos dados repetido para se obter um K _d aparente de 58 ± 2 uM. Isto proporcionou uma excelente ajuste dos resultados experimentais para o modelo de ligação (Figura 4D).

fo: Content-width = "5 polegadas" src = "/ files / ftp_upload / 51809 / 51809fig1highres.jpg" width = "500" />
Figura 1 Exemplos de configuração da experiência e análise. (D) Exemplo da forma esperada de um perfil de desnaturação térmica (feita a partir de dados de levedura hexoquinase). A forma característica dos dados em bruto mostra um aumento progressivo na fluorescência a um máximo, seguido de um declínio raso (discutido em mais detalhe em ^9). Isto é acompanhado por um único pico na primeira derivada da fluorescência. (B) Exemplo de entrada de dados em Graphpad. Concentração de ligando é dada no eixo dos X, e as temperaturas de fusão observado no eixo Y. (C) Exemplo de definição equação em Graphpad. (D) Exemplos de fixar correctamente os valores iniciais de variáveis, e de fixar a concentração de proteína, para permitir a correta determinação da constante de dissociação.m / files / ftp_upload / 51809 / "target =" 51809fig1highres.jpg _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

. Figura 2 Interacção de hexoquinase com glicose medida por fluorimetria de varrimento diferencial (A) Uma experiência inicial testando uma ampla gama de concentrações de glicose sugere que o K _d é provável estar no intervalo de 0,2 -. 1,7 mM (B) Um detalhado experimental, testando 16 concentrações de glicose, permite a determinação do K _d aparente como 1,12 ± 0,05 mM. Os dados se adapta muito bem ao modelo de um único evento de ligação (com a parte inferior (T1) e superior (T2) temperaturas encaixe para 35,4 ± 0,2 º C e 49,3 ± 0,5 º C, respectivamente). Observe queesses dados foram coletados na presença de 10 mM de _MgCl2. Estas imagens foram preparadas utilizando GraphPad. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 Interação da WcbM com GTP revela uma anti-ligação cooperativa. (A) Uma experiência inicial testando uma ampla gama de concentrações de GTP sugere que o K _d é provável estar no intervalo de 200 -. 500 uM (B) Uma experiência detalhada, testando 16 concentrações de GTP, sugere um valor para o aparente K _d de 120 ± 20 pM. No entanto, quando uma escala logarítmica é utilizada para o eixo-x, existe uma significativa desprestígiopancy entre o modelo e os dados. (C) A análise dos mesmos dados com um modelo de cooperativa mostra um excelente ajuste aos dados, onde um modelo cooperativo simples é usado. Aqui, um K _½ de 230 ± 20 pM foi determinada, com o coeficiente de cooperatividade n = 0,52 ± 0,02 (com a parte inferior (T1) e de topo (T2), as temperaturas de montagem para 69,63 ± 0,06 º C e 79,9 ± 0,1 ° C, respectivamente). Como WcbM parece ser dimérico, isto implica que a enzima é perfeitamente anticooperative na sua ligação ao GTP. Estas imagens foram preparadas utilizando GraphPad. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 4 mostra um padrão WcbI fusão bifásicana presença do seu ligando coenzima A (CoA). (A) WcbI, na ausência de ligando (azul), mostra um padrão simples de fusão monofásico. Em altas concentrações de ligante (1 mm; linha verde), um padrão semelhante é observado. No entanto, a concentrações de ligando de intermediários. (60 uM; linha vermelha), dois picos distintos de fusão, o que corresponde aos estados livre e ligado por ligando-ligando são observados (B) A transição entre os dois conjuntos de picos é dependente da dose através da completa gama de concentrações. (C) Modelagem da fusão bifásico como uma soma de uma parte dos resultados ligantes livres e altos ligante dá um bom ajuste aos dados (linha roxa pontilhada, em comparação com linha vermelha). Este ajuste é melhorada por extrapolação o resultado observado para o ligando de alta concentração (em que o modelo indica ~ 95% de ocupação) para ocupação total (linha pontilhada azul). (D) Os dados obtidos para a proporção de WcbI ligado a CoA sho ws um ajuste excelente para um modelo de ligação simples, com um K _d de 58 ± 2 uM (estes dados representam os dados recolhidos em dois dias diferentes, com concentrações ligeiramente diferentes ligandos escolhidos para o segundo dia, com base no primeiro conjunto de resultados). Painéis. (A - C) foram preparadas usando o Excel eo painel (D) usando Graphpad Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1 Receita para experimentos iniciais.

Reagente	Volume no mix (ul)
Proteína	Para concentração final de 0,11 mg / mL
0,3
0,5 M de HEPES pH 7,0	3.7
NaCl 5 M	5.6
Água	Para 180 uL

; "> 5000X SYPRO Laranja

Este artigo descreve o "master mix" de proteína, reagente de detecção e buffer para um experimento de aferição inicial para fornecer uma estimativa de K _d, conforme descrito na seção de protocolo 1 Esta mistura tampão é adequada para proteínas genéricos. Quando os resultados anteriores sugerem outros buffers devem ser utilizados, devem ser substituídos. Se o material de proteína está presente numa concentração inferior (isto é, menos do que 0,3 mg / ml), pode ser necessário para reduzir a quantidade de tampão adicional adicionado para compensar tampão já presente na amostra de proteína.

Tabela 2 Receita para determinação de K _d.

Reagente	Volume no mix (ul)
Proteína	Para concentração final de 0,11 mg / mL
5,000x SYPRO Laranja	1,78
0,5 M de HEPES pH 7,0	22.2
NaCl 5 M	33.3
Água	Para 180 uL

Este artigo descreve o "master mix" de proteína, reagente de detecção, e bpode ser prejudicado por uma determinação completa de K _d para uma amostra de proteína, tal como descrito na secção 2 Este protocolo de mistura tampão é apropriado para proteínas genéricos. Quando os resultados anteriores sugerem outros buffers devem ser utilizados, devem ser substituídos. Se o material de proteína está presente numa concentração inferior (isto é, menos do que 0,3 mg / ml), pode ser necessário para reduzir a quantidade de tampão adicional adicionado para compensar tampão já presente na amostra de proteína.

Quadro 3. Equações e parâmetros para análise de dados.

_d

Passo em protocolo experimental	Equação necessário	Parâmetros necessários	Descrição das variáveis ​​e parâmetros
3.3
Um único sítio de ligação do ligando	Y = inferior + ((Top-Bottom) * (1 - ((PK-X d + sqrt (((P + X + K d) ^ 2) - (4 * P * X))) / (2 * P ))))		P: a concentração de proteína. Kd: constante de dissociação. P e Kd são dadas nas mesmas unidades que foram utilizados para as concentrações de ligando. Superior, Inferior: temperaturas de fusão na concentração de ligante infinita e nenhuma concentração ligando respectivamente.
3.4		Inferior = * YMIN	YMIN: Valor mínimo de Y (a mais baixa proteína experimental Tm, neste caso)
		Top = * YMAX
		K d = * X em ymid	Ymid: valor de Y, que corresponde à média de YMIN eymax. X é o valor correspondente X (aqui, a concentração do ligando relevante)
		P = (valor inicial, para estar em forma)
4.1
Modelo cooperativo Simples	Y = inferior + ((Top-Bottom) * (((X / Kd) ^ n) / (1 + ((X / Kd) ^ n))))		n: Hcoeficiente doente. Este descreve a cooperatividade, ou outras propriedades bioquímicas, da proteína, e não é, necessariamente, uma estimativa do número de sítios de ligação de ligandos na proteína. Um coeficiente de Hill de uma não representa cooperatividade; valores inferiores a um indicam a cooperatividade negativa, e os valores superiores a uma cooperatividade positiva.
		Inferior = * YMIN
		Top = * YMAX
		K d = * X em ymid
		P = (valor inicial, para estar em forma )
		n = (valor inicial, para estar em forma)
Sequential ligação de dois ligantes	Y = inferior + ((Top-Bottom) * ((x ^ 2) / (K d * K2)) / (1 ​​+ (X / K d) + ((x ^ 2) / (K d * K2))) )		K2: constante de dissociação para o segundo evento de ligação.
		Inferior = * YMIN
		Top = * YMAX
		K2 = * X em ymid
		P = (valor inicial, para estar em forma)
Independente de ligação de dois ligandos	Y = inferior + ((Top-Bottom) * ((x ^ 2) / (K d * K2)) / (1 ​​+ (2 * X / K d) + ((x ^ 2) / (K d K2 *) )))
		Inferior = * YMIN
		K d = * X em ymid
		K2 = * X em ymid
		P = (valor inicial, para estar em forma)
5.5
Análise de turnos binários na temperatura de fusão	Y = 1 - ((PK d-X + sqrt (((P + X + K d) ^ 2) - (4 * P * X))) / (2 * P))
		Inferior = * YMIN
		Top = * YMAX
		K d = * X em ymid
		P = (valor inicial, para estar em forma)
5.8
Extrapolação de concentração do ligando infinito	(C2 - ((1 $ R $ 2) * B2)) / $ R $ 2		B2: célula que contém o resultado sem ligando. C2: célula contendo a sequência com o máximo de ligando. $ R $ 2: célula que contém a proporção obrigado a concentração máxima ligante.

YMAX: valor máximo de Y (a mais alta proteína experimental Tm) dth: 123px; "> K = * X em ymid h: 123px; "> Top = * YMAX 23px; ">

Passos 3, 4 e 5 requerem a adição de equações detalhadas para o software de análise e definição precisa de parâmetros para análise de dados inicial. As equações para cada etapa relevante é mostrado, com as seleções corretas dos parâmetros. Uma explicação sobre o significado de variáveis ​​e parâmetros são fornecidas para referência.

Tabela 4 Concentrações de triagem de interação da hexoquinase com glicose.

Ponto de amostragem	Ligante (Glucose) concentração (mM)
1	0
2	0,001
3	0.005
4	0,01
5	0,03
6	0,1
7	0,3
8	0,4
9	0,7
10	1.1
11	2.1
12	3.7
13	5.3
14	7
15	9
16	11

Hexoquinase do brotamento de levedura Saccharomyces cerevisiae foi adicionada à mistura principal conforme descrito no protocolo, suplementado com 10 mM de MgCl ₂ como o magnésio é um co-factor conhecido. A estimativa inicial do K _d era entre 0,5 e 2 mm. Os experimentos foram montados para fornecer as concentrações finais indicadas de glicose.

Tabela 5 Concentrações de triagem de interação de WcbM com o PIB.

Ponto de amostragem	Ligando (GTP) concentração (uM)
1	0
2	0,5
3	1
4	5
5	10
6	25
7	50
8	100
9	250
10
11	1000
12	2500
13	5000
14	7500
15	10.000
16	20.000

"0" cellspacing = "0"> 8px; "> 500

WcbM de Burkholderia pseudomallei foi adicionada à mistura principal, como descrito no protocolo. A estimativa inicial do K _d foi de cerca de 100 M. Os experimentos foram montados para fornecer as concentrações finais indicadas do GTP, com o objetivo de cobrir pelo menos duas ordens de magnitude acima e abaixo de K _d.

Discussão

Fluorimetria diferencial de varredura demonstrou seu poder como um método robusto e versátil para a caracterização de proteínas e identificação de potenciais ligantes protéicos. Os sucessos bem documentados em acelerar a estabilização da proteína, descoberta de drogas (especialmente em laboratórios menos financiados) e cristalização ^10,23-25 ​​tornaram um método atraente para a triagem inicial de compostos. Compostos adicionados às proteínas mostram um claro aumento dependente da dose na temperatura de fusão aparente ^{de 7,9.} No entanto, tem havido algumas tentativas para utilizar os resultados destas experiências para determinar as constantes de ligação aparentes para ajudar na classificação compostos quanto à sua afinidade. Aqui, nós apresentamos um método para a determinação sistematicamente uma constante de dissociação aparente de proteínas na presença de um ligando.

Os resultados aqui apresentados demonstram que a DSF pode rapidamente e de forma robusta fornecer estimativas da constante de dissociação parauma combinação de proteína-ligando. Os dados observados podem ser manipulados com instrumentos disponíveis comercialmente para fornecer uma rápida determinação de K _d, sem a necessidade de fazer hipóteses sobre o valor provável de parâmetros. O método tem uma vantagem significativa sobre alguns métodos comparáveis ​​de ser parcimoniosa em proteínas e tempo requerido. O experimento descrito aqui vai consumir 0,13 mg de proteína por experiência (aproximadamente 0,4 mg por experiências repetidas em triplicata). Isso se compara favoravelmente com a calorimetria de titulação isotérmica (ITC), onde uma única experiência com uma média de 40 kDa vai consumir uma quantidade similar. O conjunto completo de experimentos necessários para este protocolo iria consumir em torno de 4 horas, incluindo a preparação, para um único conjunto de experimentos. Mais uma vez, esta é provavelmente a ser consideravelmente mais rápida do que os métodos tais como ITC ou ressonância de plasma de superfície, enquanto que muitas vezes requerem optimização poderoso considerável para atingir melhores dados.

Os nossos resultados demonstram que continua a existir uma exigência de examinar cuidadosamente os dados brutos, o ajuste destes dados para determinar a temperatura de fusão, e o ajuste dos dados de temperatura de fusão para determinar a constante de dissociação. O primeiro desafio é a forma dos dados brutos produzidos na proteína de fusão. Em alguns casos, a forma pode não aproximados ao observado na Figura 1A. Problemas comuns incluem mudanças de temperaturas baixas na ligação do ligando, alta fluorescência de fundo e várias transições incomuns de temperatura. Deslocamentos de baixa temperatura são vistas em ligação um número de ligandos. Por este método, o parâmetro mais crítico é o erro na medição de T _m, em comparação com a mudança de temperatura. Os dados geralmente pode ser equipado razoavelmente bem quando o desvio padrão das medições em triplicata não excedam 10% do deslocamento da temperatura de fusão entre a proteína não ligada e totalmente vinculado. Nossa experiência é que quando essa temperaturadeslocamentos ratura são apenas 2 ° C, isto pode ser suficiente para o ajuste dos dados, se os pontos de dados individuais são altamente precisos. Uma segunda questão é incomum em forma de curvas. Estas muitas vezes diferem entre a proteína livre e as formas de ligando ligado, como a ligação do ligando afecta modos desdobramento da proteína. Nestes casos, o utilizador tem de determinar se os dados podem ser usados ​​com a devida consideração dos modelos para ser utilizado para a determinação da temperatura de fusão e a constante de dissociação. Um outro problema comum é que a adição de um co-factor para a proteína (por exemplo, MgCl _2, no nosso exemplo com hexocinase) é necessário para obter os dados mais fiável. Nossa experiência tem demonstrado que uma análise cuidadosa de todos os fatores prováveis ​​no experimento na fase de fazer leituras iniciais é essencial para a obtenção dos melhores resultados. Além disso, os tratamentos teóricos alternativos pode revelar características destes dados ^15,17. Finalmente, não é incomum para algumas proteínas que contain nativamente exposta regiões hidrofóbicas para mostrar alta fluorescência de fundo. Há um certo número de soluções para estes problemas, que têm sido extensivamente avaliação outras posições ^6,9.

Em particular, o utilizador deve-se considerar a possibilidade de utilizar o Boltzmann modelos ou derivados (por exemplo, Figura 4), ​​e no caso de utilização de derivados, se derrete múltiplas devem ser modeladas. Os dois métodos de modelação do desdobramento térmico diferem na medida em que o método de Boltzmann ajusta os dados experimentais com a equação de Boltzmann, assumindo um formato regular para a sigmoidal curva desdobramento. Em contraste, o método derivado leva a primeira derivada dos dados experimentais em cada ponto (painel inferior da Figura 1A), e considera que a temperatura de fusão ser o ponto mais elevado da primeira derivada. O método geralmente derivado retorna uma temperatura de fusão mais elevada de cerca de 2-3 ° C. A maioria das proteínas irá retornar uma mais consistenteresultado (isto é, o erro padrão da temperatura de fusão para as experiências em triplicado é inferior) por um dos dois métodos. Isto é geralmente intimamente relacionada com a forma exacta da proteína se desdobrar curva, e que é necessário para determinar empiricamente o melhor método, em cada caso. Quando o modelo derivado é utilizado, é também importante considerar vários eventos de fusão. Alguns dados mostram claramente evidência para múltiplas transições, e, nestes casos, os resultados tendem a ser mais fáceis de interpretar se estes eventos de fusão múltiplos são modelados. No contexto do presente protocolo, que é muitas vezes o caso de que a adição do ligando pode provocar uma proteína para passar de ter múltiplas transições de fusão para uma única transição (por exemplo, por meio da estabilização do mais frágil termicamente subdomínio), ou vice-versa. Teríamos, portanto, defendem que os dados brutos são examinadas em conjunto, antes de considerar qual abordagem será melhor para usar.

Seguindo o modelling das temperaturas de fusão individuais, outros problemas podem surgir na montagem destes para os modelos apresentados na seção de protocolo. É imperativo examinar cuidadosamente o ajuste à equação constante de dissociação usando uma escala logarítmica, como esta análise frequentemente destaca discrepâncias entre os dados observados eo modelo (e .g., Figura 3). Embora os resultados obtidos são geralmente robusto, o cuidado na interpretação oferece a oportunidade de extrair os melhores resultados, e a maior significado, a partir dos dados.

A questão específica levantada por esses dados é a interpretação que deve ser colocado em proteínas que mostram cooperatividade, ou vários eventos de ligação, na DSF. Temos, até o momento, apenas observou esse fenômeno em proteínas que são esperados para ter vários eventos de ligação específicos (por exemplo, WcbM, uma proteína cuja homólogo melhor é uma mult�ero ^26, e que atua como um mult�ero em cromatografia de exclusão de tamanho [de dados nãomostrados]). Não é de modo nenhum claro que a cooperatividade negativa observada na DSF desnaturação da enzima indica que, em última análise mostram cooperatividade negativa: em vez disso, esta pode ser uma indicação de que o complexo de ligação tem de ser explorado mais exaustivamente utilizando uma gama mais larga de métodos. Isto sugere a nós, no entanto, que mais extensos estudos de tais proteínas são susceptíveis de identificar efeitos interessantes.

Os valores indicados para a constante de dissociação utilizando este método são, em geral da mesma ordem que aquelas fornecidas por outros métodos, tais como calorimetria de titulação isotérmica e de ressonância de plasmon de superfície. No entanto, os valores absolutos observados são frequentemente mais elevados do que os observados usando esses métodos. Isto é, pelo menos em parte uma consequência do facto de a constante de dissociação é observada na temperatura de fusão com a proteína do ligando. Este K _d é geralmente maior do que a temperaturas fisiológicas. O dissociation constante está relacionada com a temperatura da reacção pelas equações:

[1]

[2]

(Em que c é a concentração ^θ referência padrão, Δ _r G é a variação de energia livre de Gibbs da reacção, R é a constante dos gases molar, Δ H é a variação de entalpia na reacção, e Δ S é a variação de entropia na reacção .)

As reacções com as constantes de dissociação na gama mensurável de este método terá geralmente um negativo Δ _r L, e de modo que o efeito de um aumento na temperatura na equação [1] será o aumento da constante de dissociação. Ambos os termos Δ H e Δ S que constituem a energia livre de Gibbs (equação [2]) são temperaturdependente e ^27, e o efeito sobre a constante de dissociação dependerá da amplitude e sinal de estas dependências de temperatura, e será, necessariamente, dependente interacção. Por conseguinte, não é inesperado que as constantes de dissociação determinadas por este método são, por vezes, maior do que os valores determinados por métodos que operam à temperatura ambiente. A dependência da temperatura é, evidentemente, também a ressalva de muitos outros métodos, os quais tendem a fornecer a constante de dissociação em temperaturas mais baixas do que a temperatura fisiológica.

Outra ressalva do método DSF é que é um método marcado, ao contrário de ITC. O marcador fluorescente utilizado (SYPRO Laranja) é hidrofóbico, e portanto em alguns casos, pode competir com a ligação de ligandos a proteínas hidrofóbicas. Por conseguinte, é provável que, em alguns casos, a constante de dissociação obtida vai ser artificialmente elevado devido à competição com o rótulo. No entanto, para a comparação de diferentes ligandos, (o principal usoDSF), as diferenças não são susceptíveis de ser suficientemente significativa para afetar a classificação de compostos por afinidade.

Uma potencial desvantagem deste método é o limite de detecção que pode ser alcançado. Em princípio, não deverá ser possível medir com precisão a um valor de K _d que é inferior a 50% da concentração de proteína, e até mesmo os valores nesta gama são susceptíveis de ser de precisão duvidosa. Embora o limite de detecção a esta extremidade do intervalo pode ser alargado por uma pequena redução da concentração de proteína e de corantes, a sensibilidade do instrumento vai evitar mais redução na concentração de proteína. Do mesmo modo, a extremidade superior da sensibilidade serão determinadas pela solubilidade do ligando. Para obter uma estimativa matematicamente robusto para o K _d, é a mais importante para a obtenção de dados com 90% da proteína presente sob a forma ligada ao ligando, que requer concentrações de ligando a ser aproximadaly dez vezes K _d (assumindo que não há cooperatividade). O limite de detecção, portanto, de ser necessariamente um décimo da solubilidade do ligando no tampão relevante. Isto significa que os limites de detecção do método irá tipicamente variar entre 1 uM e entre 1 e 100 mM, dependendo da proteína e do ligando.

Em conclusão, a fluorimetria de varrimento diferencial é uma técnica versátil aplicável a uma ampla gama de proteínas. Usando os métodos aqui apresentados, é possível determinar rapidamente e de forma barata a afinidade de uma proteína para diferentes ligandos. Isto tem um grande potencial de aplicação em purificação de proteínas e de estabilização, a esclarecer a função ou especificidade de enzimas de metagenomes, e na descoberta de medicamentos, especialmente em pequenos laboratórios.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
O instrumento de PCR em tempo real StepOne	Life Technologies	4376357	DSF pode ser realizado com muitos outros instrumentos. O instrumento StepOne possui um software muito conveniente para análise de dados.
Software de mudança térmica de proteína v1.0	Life Technologies	4466037
MicroAmp Placas ópticas rápidas de 48 poços	Fita	4375816
Technologies	Life Technologies	4375323	Bio-rad part no. 223-9444 é um fornecedor alternativo
Placas de 96 poços com fundo em U	Fisher	11521943
SYPRO Orange	Life Technologies	S6650	Para um fornecedor de menor volume, use o número de peça Sigma S5692
SPSS statistics versão 20	IBM		Outros pacotes de estatísticas fornecerão funcionalidade semelhante
GraphPad Prism 6.02	GraphPad		Outros pacotes de estatísticas fornecerão funcionalidade semelhante
Aplicador manual (PA1)	3M	75-3454-4264-6
Hexoquinase de Saccharomyces cerevisiae	Sigma-Aldrich	H5000
Glucose	Fisher	10141520