Injection Viral intracerebroventricular do Neonatal do rato do cérebro para a transdução neuronal persistente e generalizada

Resumo

Aqui demonstramos uma técnica para transdução neuronal generalizada por injeção intraventricular de vírus adeno-associado no cérebro de camundongo neonatal. Este método fornece uma maneira rápida e fácil de obter a expressão vitalícia de transgenes entregues por vírus.

Resumo

Com o ritmo de avanço científico acelerando rapidamente, são necessários novos métodos para a neurociência experimental de forma rápida e facilmente manipular a expressão genética no cérebro do rato. Aqui nós descrevemos uma técnica introduzida por Passini e Wolfe para entrega intracraniana direta de transgenes viralmente codificadas no cérebro neonatal mouse. Em sua forma mais básica, o procedimento requer apenas um balde de gelo e uma seringa microlitro. No entanto, o protocolo pode também ser adaptado para utilização com quadros estereotáxicas para melhorar a consistência dos investigadores novas para a técnica. O método baseia-se na capacidade do vírus adeno-associado (AAV) para mover-se livremente a partir dos ventrículos cerebrais para o parênquima cerebral, enquanto o revestimento ainda está ependimária imaturos durante a primeira hora após o parto 12-24. Injeção intraventricular de AAV nesta idade resulta na transdução generalizada de neurônios em todo o cérebro. Expressão começa dentro de dias de injeção e persiste durante a lifetime do animal. Título viral pode ser ajustado para controlar a densidade de neurónios transduzidas, enquanto a co-expressão de uma proteína fluorescente proporciona um rótulo vital das células transduzidas. Com a crescente disponibilidade de instalações nucleares virais para fornecer reagentes tanto off-the-shelf, pré-embalados e preparação personalizado viral, esta abordagem oferece um método oportuna para manipular a expressão genética no cérebro do rato que é rápido, fácil, e muito menos dispendioso de engenharia de células germinativas tradicional.

Introdução

Os métodos tradicionais para modificar a expressão do gene neural exigem demoradas e dispendiosas manipulações da linha germinativa. Alternativa de novo se aproxima, como em eletroporação utero ou injeção lentiviral estereotáxica dar resultados mais rápidos e menos caros, mas têm a desvantagem de necessitar de intervenção cirúrgica complexa ^1-3. Além disso, a expressão do transgene tem um intervalo espacial limitada a estes métodos. Aqui, nós descrevemos um método rápido, fácil e económico para a manipulação neuronal difundido através de injecção intraventricular de vírus adeno-associado (AAV) para o cérebro do rato neonatal. O método foi descrito pela primeira vez por John Wolfe e Marco Passini em 2001, onde eles sugeriram pequeno tamanho de partícula de AAV permitiu-se difundir no fluido cérebro-espinal, uma vez que passa a partir dos ventrículos laterais através da barreira ependimal imaturos e para o parênquima cerebral ^{4, 5.} Injecção intraventricular de AAV no interior do frimeira 24 h depois do nascimento rendimentos de transdução virai generalizada de subconjuntos neurais que abrangem todas as regiões do cérebro, a partir dos bolbos olfactivos até o tronco cerebral ^6,7. Transgenes Virally-entregues são expressos e ativo dentro de dias de injeção e persistir por até um ano após a transdução. Assim, esta manipulação versátil permite estudos vão desde o desenvolvimento pós-natal precoce do cérebro com o envelhecimento e degeneração no adulto.

Ao adaptar a técnica às nossas necessidades específicas experimental, temos focado principalmente na AAV8 sorotipo porque ele é o mais eficiente na transdução de neurônios ^6. Nós mostramos que o título viral pode ser diluído para controlar a densidade de neurónios transduzidas para consequências intrínsecas às células de teste experiências de manipulação genética. Além disso, demonstra-se que dois vírus pode ser co-injectado para produzir os padrões de expressão que favorecem a conjuntos distintos ou de sobreposição de neurónios, dependendo dos serotipos escolhidos paraempacotamento viral. O nosso trabalho expande a versatilidade desta técnica para utilização numa ampla variedade de configurações de neuroscience experimentais.

Protocolo

Realizar todos os procedimentos e protocolos que envolvem animais, de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Os procedimentos aqui descritos foram analisados ​​e aprovados pelo Colégio Baylor de Medicina Animal Care Institucional e Comitê de Uso.

Vírus adeno-associado (AAV) os vectores de replicação incompetente para a entrega do transgene no cérebro de roedores são aprovados para uma utilização nível de biosegurança. Consulte o site da CDC para a publicação Governo dos EUA "Biossegurança em Laboratórios de Microbiologia e Biomédicas (BMBL)", que detalha os requisitos específicos relativos aos procedimentos de proteção e de tratamento de vírus adequadas. Verifique com a equipe de segurança veterinária e ambiental local para saber os requisitos específicos institucionais para procedimentos que utilizam vírus. Regulamentos relativos salas de procedimento, quarentena e identificação de gaiolas de risco biológico variam entre as instituições.

1. Prépare P0 os filhotes e mães adotivas

1. Forneça ração rica em gordura para todas as mulheres grávidas e lactantes para apoiar as demandas de energia de reprodução e lactação.
2. À noite, configurar uma gaiola de criação, adicionando uma ou duas fêmeas saudáveis ​​para a gaiola de um único macho residente. Na manhã seguinte, verifique as fêmeas para o acasalamento uma ficha e separar as fêmeas dos machos se um plugue está presente.
   1. Use mães adotivas para levantar filhotes de fundo genético com características maternas pobres (por exemplo, C57BL / 6 ou C3HeJ). Mães adotivas aceitar os filhotes de outra ninhada, se os filhotes nascem transferidos no prazo de quatro dias de sua ninhada da mãe adotiva.
   2. Configurar uma gaiola de acasalamento separado usando ICR ou fêmeas FVB ao lado dos criadores experimentais para que os dois conjuntos de fêmeas dão à luz em aproximadamente ao mesmo tempo.
3. As fêmeas entregar em 19 ± 1 dias a partir da data de tampão, dependendo da estirpe de fundo. Três dias antes delivery (16 dias após a data de tomada), coloque a fêmea grávida em uma gaiola limpa com material de nidificação fresco e um abrigo coberto.
4. Verifique se há filhotes recém-nascidos duas vezes por dia a partir 2 dias antes da data provável do parto (17 dias após a data de plugue). Examine a gaiola com o mínimo de estresse para as mães por espreitar através do fundo para a presença de recém-nascidos de-rosa. Ratos geralmente entregar filhotes de manhã, mas em raras ocasiões, vai entregar na tarde.
5. Plano para realizar injeções assim que os filhotes são de enfermagem (o que fica evidenciado por manchas visíveis de leite), ou no prazo de 6 horas de nascimento, o que ocorrer primeiro.

2 Prepare Equipamento para Injeção

1. Prepare uma seringa de 10 mL com uma agulha de 32 G para recém-nascidos gerais P0. Se realizar a injeção estereotáxica, montar a seringa no braço manipulador.
2. Se estiver usando um quadro estereotáxico para injectáveis, esfriar a fase neonatal para 4-8 ° C pela adição de 100% Ethanol e gelo seco para o reservatório na extremidade da frente do bloco. Manter a temperatura acima de 1 ° C para evitar o congelamento das crias.

3 Preparar diluições virais para Injeção

1. Prepara-se uma solução de 1% de corante azul de tripano (20x estoque).
2. Prepare 5-25 mL alíquotas de vírus (AAV) da adeno-associado dentro de uma cabine de segurança biológica classe 2. Coloque estas alíquotas a -80 ° C para uso futuro. Evitar ciclos de congelamento-descongelamento adicionais como esta faz com que o vírus se perder eficácia de transdução.
3. Remove-se uma alíquota de AAV a partir da temperatura de -80 ° C e colocar no congelador de gelo a descongelar.
4. Preparar a solução injectável viral por diluição do vírus em solução salina 1x fosfato gelada (PBS). Comece com uma diluição em série de dez vezes ⁽¹⁰ outubro - 10 agosto partículas virais / hemisfério) para a otimização inicial do padrão de transdução.
5. Adicionar 20x azul de tripano para a solução de AAV para uma concentração final de 0,05%.

4. Estadiamento do recém-nascido Filhotes para Injeção

1. Coloque uma pequena placa de alumínio no gelo para esfriar. Inserir uma tarefa seco limpar no topo da placa para proteger a pele do filhote de metal frio. Isto serve como uma superfície plana frio para anestesiar e injetando os filhotes.
2. Prepare uma almofada de aquecimento adequado para manter os ratos neonatal quente antes e após a injeção.
3. Uma vez que os filhotes recém-nascidos começaram a enfermeira, remover cerca de metade deles da gaiola e deixar a outra metade com a mãe. Coloque os filhotes recolhidos no bloco de aquecimento, enquanto se aguarda a injeção.
   NOTA: Se a mãe biológica não se importa com os filhotes, remova todo o lixo da jaula imediatamente e colocar os filhotes em uma almofada de aquecimento para aguardar injeção. Esta situação pode ocorrer com a primeira ninhada nasceu para C57BL / 6 fêmeas ou com outras linhagens puras que têm características de reprodução pobres. Nesta situação, manchas de leite não será visível em filhotes recém-nascidos.
4. Transferir um filhote de cachorro da almofada de aquecimento sobre a placa de metal frio para induzir a anestesia hipotermia. Espere 2-3 minutos para o filhote de cachorro para se tornar totalmente anestesiado. Confirme anestesia apertando muito suavemente uma pata e monitorar por falta de movimento ou respiração.

5 Injeção de AAV em Neonatal Ratos

1. Free-mão injeção intracraniana de AAV em ratos neonatal:
   1. Carga 5 ul de AAV diluída com 0,05% de azul de tripano para a seringa de injecção.
   2. Limpe cuidadosamente a cabeça do cachorro anestesiado com um cotonete embebido em álcool 70%.
   3. Identificar os locais de injecção em 2/5 da distância entre a sutura lambda para cada olho. Um local de injeção alternativa está localizada a aproximadamente 0,8-1 mm lateral da sutura sagital, a meio caminho entre lambda e bregma. Estes marcos são visíveis através da pele em P0.
   4. Marque o local da injecção com uma caneta de laboratório não-tóxico.
   5. Segure a seringa com a escala visível para monimento do volume de solução administrada.
   6. Certifique-se de que o polegar pode alcançar o topo do êmbolo. Em seguida, retire o polegar do êmbolo ao posicionar a agulha para evitar que acidentalmente distribuir vírus.
   7. Encontre uma posição confortável para preparar o braço para injeção, colocando o cotovelo no banco e apoiando-se no braço do balde de gelo.
   8. Deite o cachorro de lado com a cabeça diretamente sob a seringa. Vire a cabeça do cachorro para que o local da injecção marcada é voltada para cima, e gentilmente, mas com firmeza manter esta posição com a mão aberta.
   9. Segurar a seringa perpendicular à superfície do crânio e inserir a agulha no local de injecção marcado a uma profundidade de aproximadamente 3 mm. Injectar a agulha até que a resistência diminui ligeiramente, indicando que a agulha tenha penetrado no ventrículo lateral. Se for necessária uma referência, marca de 3 mm a partir da ponta da agulha com a máquina não-tóxico. Ajuste a profundidade de injeção para tamanho e tensão cachorro com base em corante targeting dos ventrículos.
   10. Segurar a seringa rigidamente de modo que o êmbolo pode ser deprimido, sem mover a agulha mais para dentro do cérebro. Se a injecção é deslocado para o tálamo, propagação viral será severamente limitado.
   11. Comece injectando lentamente o vírus durante a monitorização do volume a distribuir a partir da seringa. Administrar um volume máximo de 2 ul em cada ventrículo. Se a agulha se encontra na posição correcta, o corante se espalhe para preencher o ventrículo.
   12. Lentamente, retirar a agulha.
   13. Permitir que o primeiro local da injeção para fechar antes de injetar o outro hemisfério.
       NOTA: Não injetar no mesmo local mais de uma vez. Reinserir o vírus forças agulha que já foi injetada a vazar e causar ferimentos ou morte do filhote.
   14. Injectar o ventrículo contralateral utilizando o mesmo procedimento.
2. Injecção estereotáxica de AAV em murganhos neonatais:
   1. Carga 5 ul de AAV diluída com 0,05% de azul de tripano into da seringa de injeção realizada pelo manipulador estereotáxica.
   2. Delicadamente, coloque a cabeça do cachorro entre as barras de ouvido do quadro neonatal. Certifique-se a cabeça é o nível no eixo Y (da frente para trás), verificando que a linha entre lambda e bregma é paralela à fase. Certifique-se a cabeça é o nível no eixo X (lado a lado) com a verificação de que uma linha imaginada entre as orelhas, ou de uma linha entre os olhos, é paralela à fase.
   3. Limpe cuidadosamente a cabeça do cachorro anestesiado com um cotonete embebido em álcool 70%.
   4. Use o manipulador estereotáxica para posicionar a seringa acima lambda e depois zerar o coordenadas X e Y. Mover os braços estereotáxica de (X, Y) = (0,8, 1,5) mm para filhotes P0 padrão.
      Nota: O tamanho do filhote de cachorro e coordenadas estereotáxica pode variar por estirpe e idade. Ajuste coordenadas com base em injeções de corante, conforme necessário para atingir os ventrículos laterais.
   5. Lentamente abaixe a agulha no local da injeção. A superfície do crânio vai indent e solte uma vez que a agulha penetrou a pele. Retrair a agulha até que o crânio recupera a sua forma côncava normal, mas manter o bisel da agulha sob a pele. Zero coordenada Z neste momento.
   6. Insira a agulha até Z = -1,7 mm e, em seguida, retirar a -1,5 mm.
   7. Lentamente injetar o vírus. Cada hemisfério pode aceitar-se a 2 mL de solução.
   8. Manter a seringa no local por 30-60 segundos após o término da injeção e, em seguida, retirar lentamente a agulha durante 1-2 min.
   9. Repita o procedimento para o hemisfério contralateral, utilizando coordenadas negativas no eixo X para o local da injeção.
      NOTA: coordenadas alternativos para a injecção são (X, Y, Z) = (0,8, 2,0, -1,5) mm e (1.2, 1.0, -1.5) mm. Realizar a primeira injeção em (0.8, 2.0), em seguida, passar a (0,8, -2,0), (1.2, 1.0) e, finalmente, (1,2, -1,0). Injectar 1 ul da solução em cada local, para um total de 2 ul por hemisfério. Mova-se rapidamente entre as injeções para concluir o procedimento em less de 10 min.

6 Pós-injeção de Cuidados

1. Depois de completar as injeções em ambos os hemisférios, coloque o filhote de volta na plataforma de aquecimento até a temperatura do corpo e cor da pele volta ao normal eo filhote começa a se mover.
2. Se estiver usando a mãe biológica de amamentar os recém-nascidos injetados, devolver os filhotes injetados para a mãe biológica depois de recuperar o movimento normal. Coloque os restantes filhotes uninjected na almofada de aquecimento. Repita o procedimento até que todos os camundongos foram injetados.
3. Se estiver usando uma mãe adotiva para amamentar os recém-nascidos injetados, transferir todos os filhotes injetados para a mãe adotiva de cuidados depois de recuperar o movimento normal.
   1. Remover a maior parte ou a totalidade das crias pertencentes à mãe adoptiva da gaiola para garantir o sucesso dos animais injectados.
   2. Se os filhotes da mãe adotiva e injetados filhotes têm o mesmo olho e cor da pele, marcar os filhotes da mãe adotiva com uma caneta de laboratório para que possam serdistinguidos mais tarde.
   3. Coloque os filhotes da mãe adotiva e um pouco de sua cama junto com os filhotes injetadas. Certifique-se de que os filhotes injetados adquirir o perfume de sua prole biológica para melhorar a aceitação dos novos filhotes.
   4. Coloque apenas os filhotes injetados de volta na gaiola da mãe adotiva. Abater todos os filhotes restantes da mãe adotiva.
4. Certifique-se de que a mãe está atendendo e amamentação dos filhotes injetados dentro de 10 min de colocá-los na gaiola. Se a mãe não recolhe os filhotes dentro deste tempo, transferir os filhotes para outra mãe adotiva.
5. Rotular a gaiola com um cartão de perigo biológico para mostrar que ele contém animais por vírus injetado. Casa gaiola numa área aprovada durante 72 horas.
6. Após o período de quarentena de 72 horas, a transferência da mãe e filhotes (mas não de cama ou outros itens de gaiola) para uma gaiola limpa. Realize esta transferência dentro de um nível de gabinete 2 de biossegurança para evitar a exposição a qualquer cama de forma viral contaminado. Regressar a gaiola limpa com os animais injetados para a instalação normal do mouse.
7. Coloque a gaiola suja em um saco de risco biológico, esterilizar em autoclave, e depois voltar a gaiola para o viveiro.

7 Cleanup

1. Coloque a solução de vírus restante a 4 ° C para uso futuro. O vírus mantém a eficiência de transdução durante pelo menos 2 meses, quando armazenada a 4 ° C ^8.
2. Desinfetar a agulha de injeção e uma seringa com 2% de água sanitária, seguido por lavagens repetidas em água deionizada.
3. Limpe a área de trabalho com 2% de alvejante seguido por 70% de etanol.
4. Colete todos os itens descartáveis, incluindo pontas de pipetas, tubos, máscara e luvas em um saco plástico de risco biológico. Descarte de resíduos, conforme exigido pela legislação local e as políticas institucionais (ie autoclave ou queime).

8 Prepare mouse Brains for Imaging

1. Inserir um rato injectado numa câmara de dióxido de carbono a 3 eutanásia4 semanas após a injecção. Siga as orientações institucionais para procedimentos de eutanásia adequadas. Não perfuse animais com paraformaldeído como isso irá apagar o rótulo de fluorescência.
2. Remover os cérebros inteiros do crânio e corrigir para 3-12 h em paraformaldeído a 4% em PBS a 4 ° C.
3. Transferir o cérebro fixa a 30% de sacarose para crioprotecção. Incubar a 4 ° C até que o cérebro se deposita no fundo.
4. Colete um balde de gelo seco finamente picado. Corte o cérebro pela metade para baixo da linha média. Bury as metades cerebrais em gelo seco para congelar.
5. Arrefece-se a fase micrótomo por adição de gelo seco e etanol a 100%.
6. Prenda o cérebro para o palco com a linha média para baixo, usando PBS, e deixe congelar.
7. Seção através do cérebro em 30-45 espessura um utilizando um micrótomo deslizante de congelamento.
8. Colocar as secções em placas de 24 poços contendo a solução de anticongelante (250 ml de glicerol, 300 ml de etileno glicol, 500 ml de tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4). Placas de cobertura wiª folha de alumínio e armazenar a -20 ° C para uso futuro.
9. Colete seções 1-4 poços e lavar 3x em PBS.
10. Seções montar em lâminas de microscópio e lamela. Deixar as lâminas para secar em um local escuro.
11. Lâminas de imagem usando filtros adequados para YFP nativa ou tdTomato para verificar o padrão de transdução de vírus.

Resultados

Bem sucedidos intraventricular rendimentos injeção viral expressão neuronal disseminada e robusto. Aqui nós avaliamos a transdução viral usando YFP ou tdTomato genes fluorescentes sob o controle do frango beta actina promotor (CBA promotor). Estas construções foram embalados em AAV8 e injetado nos ventrículos laterais de ratos neonatos (P0) ICR. Títulos virais elevadas (10 ¹⁰ partículas por hemisfério) resultou na marcação densa do bulbo olfatório, estriado, córtex cerebral, hipocampo e cerebelo (Figu...

Discussão

Nós descrevemos um procedimento versátil para manipular a expressão de genes usando neuronal AAV como um veículo para a entrega generalizada no cérebro neonatal mouse. Em comparação com outros métodos de transgénese neuronal, tais como no útero electroporação ou ^uma injecção intracraniana estereotáxico ^2,3, injecção neonatal viral é relativamente fácil e simples. O procedimento básico pode ser realizada em minutos com apenas um balde de gelo e uma seringa de microlitro. Sobrevivência Optimal e expr...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Camundongos consanguíneos	ICR Harlan	Hsd:ICR (CD-1)	Esta cepa também é conhecida como camundongos endogâmicos CD-1
FVB	The Jackson Laboratory	1800	5-6 semanas de idade
Nestlets	Lab Supply	NESTLETS
Shepherd shacks	Lab Supply	SS-mouse
ração para roedores com alto teor de gordura	Purina Mills	PicoLab Mouse diet 20, #5058	Esta é a nossa ração padrão para
roedores com alto teor de gordura (alternativa)	Harlan Laboratories	Teklad Global 19% de proteína dieta para roedores #2019S	Se for necessária uma dieta autoclavável com baixo teor de fitoestrogênio
Seringa de injeção	Hamilton	7653-01	Seringa de 10 ml
Agulhas de injeção	Hamilton	7803-04, RN 6PK PT4, 0,375 "	32 G, para injeções padrão P0
Placa de metal para crioanestesia	McMaster Carr	8975K439	Placa de alumínio bruto, 6" x 12", 0.25" de espessura, precisará ser cortada em 3 partes iguais e bordas lixadas por oficina mecânica local
Dispositivo estereotáxico para pequenos animais com leitura digital	David Kopf Instruments	Modelo 940
Suporte universal para seringa com pé de suporte de agulha	David Kopf Instruments	Modelo 1772-F1
Quadro neonatal	Stoelting	51625	Oficialmente chamado de adaptador de rato e rato neonatal
Sacos de eliminação de risco biológico com indicador estéril	VWR	14220-030	Importante! – Verifique com a equipe veterinária e de segurança ambiental local para saber o seu instituto' Protocolo para Descarte de Resíduos de Risco Biológico