Fluxo de trabalho para de alta conteúdo, Quantificação de células individuais de marcadores fluorescentes de Microscópio Universal Data, apoiada pela Open Source Software

Summary

Apresentado é um informática fluxo de trabalho flexível permitindo uma análise baseada em imagem multiplexado de células marcadas com fluorescência. O fluxo de trabalho quantifica marcadores nucleares e citoplasmáticos e calcula marcador translocação entre esses compartimentos. Os procedimentos são fornecidos por perturbação das células utilizando metodologia de siRNA e fiável para a detecção do marcador através de imunofluorescência indirecta em formatos de 96 poços.

Abstract

Avanços no entendimento dos mecanismos de controlo que regem o comportamento das células em modelos de cultura de tecidos de mamíferos aderentes estão se tornando cada vez mais dependente de modos de análise de uma única célula. Métodos que entregam dados compostos refletem os valores médios de biomarcadores de populações de células risco de perder a dinâmica subpopulação que refletem a heterogeneidade do sistema biológico estudado. De acordo com este, as abordagens tradicionais estão sendo substituídas por, ou suportadas com formas mais sofisticadas de ensaio celular desenvolvidos para permitir a avaliação por meio de microscopia de alta conteúdo. Estes ensaios potencialmente gerar um grande número de imagens de biomarcadores fluorescentes, o que permitiu, acompanhando os pacotes de software proprietário, permite medições multi-paramétricos por célula. No entanto, os custos relativamente elevados de capital e overspecialization de muitos destes dispositivos têm impedido a sua acessibilidade para muitos pesquisadores.

Descrito aqui é umfluxo de trabalho universalmente aplicável para a quantificação de várias intensidades dos marcadores fluorescentes específicos de regiões sub-celulares de células individuais adequadas para utilização com a maioria dos microscópios de imagens fluorescentes. A chave para este fluxo de trabalho é a implementação do software Profiler celular livremente disponível de ¹ a distinguir as células individuais nestas imagens, segmento los em regiões subcelulares definidos e fornecer intensidade de fluorescência do marcador valores específicos para estas regiões. A extracção de valores de intensidade de células individuais a partir de dados de imagem é o objectivo central deste fluxo de trabalho e será ilustrada com a análise dos dados de controlo a partir de uma tela de siRNA para G1 reguladores de pontos de verificação de células humanas aderentes. No entanto, o fluxo de trabalho aqui apresentado pode ser aplicado para a análise de dados a partir de outros meios de perturbação celular (por exemplo, ecrãs de compostos) e outras formas de fluorescência baseada marcadores celulares e, portanto, deve ser útil para uma vasta gama de laboratórios.

Introduction

O trabalho aqui apresentado descreve a utilização do software Profiler celular livremente disponível para executar guiada por algoritmo repartição de imagens de microscopia de fluorescência de células aderentes para identificar células individuais e as regiões subcelulares definidos. Esta abordagem, referida como a segmentação de imagens, permite a análise de multi-paramétrico subsequente das células fotografadas por quantificação marcadores marcados com fluorescência localizadas a cada célula ou região sub-celular (referido como objectos segmentados). Esse fluxo de trabalho constitui uma base para permitir a análise de conteúdo de alta e se destina a servir como uma ferramenta que pode ser desenvolvido e modificado para atender multi-paramétricos, analisa célula individual em laboratórios sem acesso a instrumentos de alto teor especializadas ou software proprietário. Os arquivos fornecidos com este manuscrito incluem um conjunto de teste de dados de imagem raw relevantes, configurações de algoritmo e scripts de suporte para gerar a análise descrita. O algoritmo fornecido configurações fProfiler ou celular são otimizados para o conjunto de dados de exemplo e os detalhes seção de discussão que possam ser necessárias adaptações para permitir a utilização de dados de imagem de outros estudos.

Uma vez que os dados quantitativos foi extraído usando Profiler Cell, diferentes laboratórios podem ter requisitos diferentes de como usar as informações apresentadas pelos valores de células individuais dos dados em bruto; mostrado aqui é uma abordagem pela qual os portões são aplicados aos dados em bruto para cada ensaio. Usando estas portas, os dados são transformados em termos binários de resposta, permitindo a visualização das tendências que ligam diferentes tratamentos com as subpopulações de células que sofrem de resposta definido pelas portas. Os portões são definidos com base em observações das distribuições de dados obtidos para os controlos positivos e negativos adequados para cada medição relevante. A utilização de portas é apenas um exemplo de como gerir as medições, à base de células-primas. Também mostrado é o uso de intensidade de DNA nuclear mimasurements em sua forma bruta como uma faixa contínua de valores, em combinação com os dados fechados. Outras abordagens para a gestão de dados de análise de imagem deve ser considerada, dependendo da natureza do estudo; alternativas estatísticos a utilizar portas para a atribuição de células para as subpopulações foram relatados ² e sistemáticas comparação de estratégias para resumir dados de alto conteúdo em um grande número de parâmetros foram relatados ^3.

Análises de alta conteúdo de dados de imagem encontraram o uso em estudos celulares da droga-resposta, reverter genética e estresse ambiental sinalização ^4-6. O mérito da análise de alto teor decorre do fato de que a análise de algoritmos de dados de microscopia de fluorescência permite que os parâmetros quantitativos e espaciais a ser considerado simultaneamente em células individuais ^7. Deste modo, os resultados para vários ensaios celulares pode ser um comportamento de referência cruzada, diferencial de ensaio-dsubpopulações de células efined pode ser rastreado dentro das condições experimentais e ensaios podem incluir a consideração das variáveis ​​morfológicas. O estratégias e análise de fluxo de trabalho discutido aqui, como para outras abordagens de alto conteúdo, são capazes de fornecer dados multiplexados que são cruzados com células individuais. Estudos de alta conteúdo métodos terno que geram imagens de microscopia fluorescente e são aplicáveis ​​a análise de dados que variam de dezenas de imagens produzidas em microscopia de fluorescência convencional à base de baixo rendimento através dos milhares de imagens produzidas utilizando plataformas de triagem de alto conteúdo automatizadas.

O fluxo de trabalho é ilustrado aqui com dados de exemplo a partir do qual ensaios separados são medidos em termos quer de intensidades marcador fluorescente nucleares ou translocação citoplasma / núcleo de uma proteína fluorescente repórter, respectivamente. O fluxo de trabalho é flexível em que estes testes podem ser consideradas separadamente ou em combinação, dependendo each determinada questão de investigação por vários investigadores. Os dados deste exemplo são produzidos como parte de uma experiência de interferência de RNA (RNAi) (Figura 1). Pequenas interferentes oligonucleótidos de ARN (ARNip) são usados ​​para knockdown proteínas específicas em células HCT116 de carcinoma colorectal humano, que resultam em alterações de dois repórteres fluorescentes de cinase (CDK) actividade dependente de ciclina. A fosforilação dependente de CDK6 da proteína do retinoblastoma nuclear na serina 780 (P-S780 RB1) é avaliada por coloração de anticorpos. Nas mesmas células, um repórter marcado com proteína verde fluorescente de actividade de CDK2 (GFP-CDK2 repórter) é avaliada pela sua proporção nuclear para citoplasmático quando, na ausência de actividade de CDK2 do repórter reside no núcleo e sobre serviço de transporte de activação CDK2 para o citoplasma ^8. Além disso, o ADN nuclear de cada célula é corado usando um corante intercalante de ADN, Bisbenzamida, que serve como um meio para identificar as células e definir as fronteiras núcleos nas imagens bem como umsa medida de abundância ADN fornecer informações sobre a posição do ciclo celular da célula (Figura 2).

As actividades de CDK6 e CDK2 são detectáveis ​​como células de trânsito da fase G1 para a fase S do ciclo celular ⁵ e sucedem ^9,10 e, como tal, estreita concordância entre os dois repórteres em células individuais é esperado. O conjunto de dados de demonstração usado aqui como um exemplo analisa o efeito de siRNA alvo CDK6, proteína do retinoblastoma (RB1) e um controlo negativo não-alvo (Tabela 1). Knockdown de CDK6 deve provocar uma diminuição tanto do epitopo RB1 P-S780 e uma acumulação de células na fase G1 do ciclo celular. O knockdown RB1 serve como um controlo de reagente para a especificidade do anticorpo fosfo-S780. Imagens de microscópio de fluorescência fixados em formalina ^11, células de cultura de tecidos HCT116 fluorescently manchadas são utilizados para análise de imagem algorítmica. Os dados numéricos resultante é então utilizada parareferência cruzada os repórteres e avaliar o impacto dos diferentes estados knockdown.

O tamanho potencial dos dados produzidos por este tipo de análise pode representar um desafio para ferramentas de análise normais. Por exemplo, os dados de células individuais podem ser maiores do que alguns software de planilha eletrônica irá acomodar. Estão incluídos os scripts Perl que realizam altamente repetitivo, processamento simples, supervisionado dos dados para auxiliar a análise de grandes conjuntos de dados. Os scripts Perl são escritos especificamente para os arquivos de saída produzidos pelo celular Profiler, ao processar arquivos de imagem com uma convenção de nomenclatura de arquivo específico (Figura 3), e permitir a variável do número de campos por poço a ser utilizados na análise. É freqüentemente importante para dados do ensaio portão célula individual para acompanhar as tendências em subpopulações de células ⁵ e mostrado aqui é o uso de um script Perl para marcar cada célula com base em um portão conjunto predeterminado para cada tipo de ensaio. Também estão incluídos os scripts Perl opcionaisque resumem o resultado de dados para poços individuais (ou condições), entregando: porcentagem de células dentro da porta ao conjunto e os valores médios dos escores brutos de ensaio. A segunda opção, mais homogênea de visualização dos dados, é válido onde respostas afetam a totalidade ou a maioria das células dentro de um poço. Como discutido acima, essa avaliação é menos útil do que a oferecida pela aquisição electrónica de dados célula individual onde a resposta está confinada a um subconjunto de células dentro de uma população.

A utilidade do fluxo de trabalho descrito não está limitado a perturbação por siRNA ou os ensaios descritos marcadores. Estudos têm usado essa abordagem para ensaiar respostas em experimentos de cultura de tecidos usando combinações de siRNA, inibidores químicos e tratamento de radiação e para a avaliação de outros que CDK6 marcadores e atividade CDK2 ^5.

Conceptualmente, a estratégia experimental permite que uma variedade de regiões sub-celulares biologicamente úteis para ser automaticamente registadaem células individuais presentes em imagens de microscópio de fluorescência. Como tal, esta abordagem pode render informações biológicas quantitativa, os dados multiplexados revelando que pode ser perdida por meio de técnicas que se concentram em populações em vez de células individuais. Com pequenas modificações, o fluxo de trabalho de abordagem e análise descrito pode render, dados quantitativos de células individuais para quaisquer saídas ensaio baseado em fluorescência e respostas de células-biológico, em que a avaliação quantitativa do conteúdo de DNA, a quantificação da fluorescência nuclear ou citoplasmática ou o vaivém de marcadores entre estes dois compartimentos individualmente ou de forma multiplexada é de interesse. Como requisitos de publicação tendem cada vez mais para a apresentação dos dados em bruto abertamente acessível, acesso e familiaridade com ferramentas gratuitas para análise de imagens de microscopia como os descritos aqui também vai ser de interesse direto para os laboratórios que olham para reavaliar os dados publicados.

Protocol

1. Experimental Perturbation e marcação celular para marcadores de resposta (Reverse Transfection siRNA Tela)

1. Num capuz de cultura de tecidos estéril pipeta 70 ul de 200 nM em tampão 1x siRNA siRNA em poços de uma solução estéril, simples placa de 96 poços. Dilui-se a transfecção de lípido em 40 volumes de meio DMEM isento de soro e dispensar 105 ul a cada poço contendo siARN.
   NOTA: Diluir 262,5 uL de lípido em 10,5 ml de DMEM isento de soro produz uma mistura adequada mestre para um conjunto de placa de 96 poços de siRNA, proporcionando 2,6 uL de lípido por poço. Uso de 200 nM de concentração de siRNA começando neste passo vai entregar uma concentração de trabalho de 20 nM na etapa 1.3, mas procedimentos funcionará para concentrações de trabalho para baixo a 5 nM, com a concentração inicial ajustada em conformidade (isto é, 50 nM). Uma concentração mais baixa de trabalho pode reduzir fora do alvo pontuações falsos positivos, ainda que podem reduzir a magnitude da resposta em-alvo, conduzindo a um aumento do sobre-target taxas de falsos negativos.
2. Misture a placa por vibração suave durante dez minutos à temperatura ambiente. Sub-dividir os resultantes 175 ul em três réplicas por 50 ul de destino em, uma cultura de tecido opaco tratada, placa de 96 poços com uma base transparente.
3. Transfectar reversa dispensando 8.000 células por poço em 150 ul de DMEM contendo 10% de soro directamente para os complexos lipídicos siRNA 50 ul. Células colorretal humanos Use HCT116 expressam de forma estável um marcador GFP-tagged relatando atividade CDK2 ^5,8. Nenhuma outra mistura é necessária. Selar a placa com um adesivo membrana respirável estéril para controlar a humidade e evitar "edge efeitos" placa e colocar a placa num incubador humidificado a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 48 horas.
4. Aspirar os meios de comunicação de tal modo que uma pequena quantidade residual de media permanece nas cavidades. Fixar as células por adição de 100 ul de formaldeído a 4% tamponado a cada poço e incuba-se em um extractor de fumo durante 10 minutos a sala temperature.
5. Remover a solução de fixação a placa de aspiração. Neste ponto, quer interromper a experiência por lavagem da placa três vezes com 100 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e depois armazenam selado, sob 100 ul de PBS no escuro a 4 ° C durante até uma semana, ou continuar com o permeabilização das células.
   NOTA: Recomendamos placas de processamento, logo que possível após a sua fixação, e, geralmente, prefere armazenamento de placas totalmente transformados. Biocidas conservantes tais como timerosal, azida de sódio, ou alternativas comerciais podem ser adicionados para prevenir o crescimento micoroganismal. A adição de inibidores de fosfatase ajuda a preservar fosfo-epitopos, e outros meios para preservar os estados de modificação de proteína pode ser útil em contextos de ensaio relevantes
6. Remova a placa de PBS e permeabilizar as células por adição de 100 ul de solução de permeabilização. Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente sem agitação. Aspirar a solução de permeabilização usando um MultiCHannel pipeta. Repita este passo três vezes.
7. Bloquear as células por adição de 100 ul por bloco solução bem durante 30 minutos à temperatura ambiente. Remover a solução de bloqueio por aspiração da placa, então sondar com 50 ul de anticorpo anti RB1 P-S780 diluídas 500 vezes em solução de bloqueio durante 2 horas no escuro à temperatura ambiente.
8. Lava-se a placa três vezes com 100 uL de solução de lavagem da placa, deixando a solução sobre a placa durante 5 min de cada vez. Sondar a placa durante a noite no escuro a 4 ° C com 50 ul fluorescentemente marcado com anticorpo secundário diluído 1000 vezes em solução de bloqueio suplementado com 2 uM do corante de ADN específicos de cromatina Bisbenzamida. Lava-se a placa três vezes tal como anteriormente e armazenamento selado, sob 100 ul de PBS no escuro a 4 ° C. Imagem da placa durante duas semanas.

2. Imagem e Segmentação de Imagens

1. Use um microscópio confocal ou fiação de disco de fluorescência com um objetivo 20X tomar separado 16de bits, imagens TIFF escala de cinza em três canais correspondentes ao corante DNA, GFP e fluorophores imuno-coloração. Captura muitos conjuntos de imagens que não se sobrepõem, aqui referida como frames, a imagem aproximadamente 1.000-2.000 células por poço.
2. Nomeie os arquivos de imagem de forma sistemática, para que cada nome do arquivo é uma combinação única de 'nome da experiência', 'bem endereço', 'número do quadro "e" identificador de canal ", nesta ordem (Figura 3). O conjunto de dados de exemplo usa "Blue" (cromatina coloração DNA) ou "Green" (GFP) ou "Red" (o fluoróforo manchada de imuno) como identificadores de canal. O identificador de endereço bem, número do quadro e canal são mais adiante referido como os metadados da imagem. Use o símbolo de sublinhado para evitar confuso bem e estrutura de metadados.
3. Nomeie os arquivos com esses elementos de metadados na ordem especificada. Isto é necessário para assegurar que os passos subsequentes de software corregrupo conjuntos ctly de imagens para análise.
4. Baixe e instale o Profiler celular freeware, o Active Perl Community Edition, ambiente de programação estatística R e RStudio. Aceite todas as opções padrão durante a instalação; Usuários de PC instalar o Active Perl deve habilitar todas as opções relacionadas com a PATH, associação de extensão de arquivo e mapeamento de script onde for solicitado. Ativo Perl é opcional para usuários de Mac, mas caso contrário terá de executar o script Perl no passo 3.2 a partir da linha de comando Terminal em vez de usar ícone clicando.
5. Abra o software Profiler celular, clique em "Arquivo", "Importar Pipeline 'então' Do arquivo" e selecione o arquivo 3_channels_pipeline.cppipe (Figuras S1A e S1B). O arquivo contém as instruções necessárias para o software para interpretar os metadados do arquivo de imagem a partir da convenção de nome de arquivo descrito. Profiler celular agora relaciona as imagens, extrai DNA nuclear e intensidades de anticorpos a partir de these e utiliza o canal de GFP para calcular a relação de nucleares versus intensidade de citoplasma para cada célula detectados (Figuras 4 & 5).
6. Clique no botão "Ver as definições de saída ', no canto inferior esquerdo da janela do Profiler Cell. No topo da nova tela são caixas de texto com a etiqueta 'Pasta Padrão de Entrada "e" pasta de saída padrão ". Um de cada vez, clique nos ícones de pasta-à direita dessas caixas e selecione o local dos arquivos de imagem para análise e o destino para os dados extraídos, respectivamente (Figura S1C).
7. Comece a análise de imagem, pressionando o botão 'analisar imagens', no canto inferior esquerdo do Profiler Cell. Na parte inferior da tela observar o tempo restante para a extracção de dados, 'Stop Análise' e botões de "pausa". Se necessário interromper a análise por selecção do botão "pausa" a qualquer momento, o que é útilao assistir as imagens que estão sendo analisados ​​(descrito no passo 2.8).
8. Opcionalmente, abra as janelas para qualquer uma das etapas de análise de imagem clicando nos ícones de olho-no painel sobre o extremo esquerdo da janela do programa (Figura S1D). Observe a janela 'IdentifyPrimaryObjects' e os de 'secundários' e 'Objects terciária "para verificar se as configurações atuais na Profiler celular para realizar a segmentação de imagens são adequadas (ver Figura 1 e Discussão para aconselhamento sobre como modificar essas configurações).
9. Clique em "Ok" na ​​caixa de mensagem que aparece quando a análise for concluída. Vá para o local 'pasta de saída padrão ", onde todos os arquivos de dados com os resultados são salvos como separados por vírgula valor (.csv) (Figura S2A).

3. extração de dados

1. Encontre o novo arquivo 'Nuclei.csv', que está incluído entre ossaída do Profiler celular. Este arquivo contém dados de células individuais para fluorescente intensidade anticorpo nuclear, intensidade DNA nuclear e valores da relação repórter GFP-CDK2 (Figuras 6A e S2A).
   NOTA: Muitos laboratórios vai querer processar este tipo de dados para atender a natureza de seus próprios ensaios. Sugerido para os dados atuais é o gating das células de cada condição de tratamento de acordo com os dados de anticorpos e os valores repórter GFP-CDK2 usando o script Perl fornecida '2_gate_classifier.pl'.
2. Copie o arquivo fornecido script Perl '2_gate_classifier.pl' na mesma pasta que o arquivo de dados 'Nuclei.csv' (Figura S2A). Clique duas vezes no ícone para o script Perl e, quando solicitado, digite o nome completo do arquivo de dados seguido por um nome filename '.csv' para o arquivo no qual as células devem ser fechado e, finalmente, os valores de porta para o anticorpoe os dados de fluorescência repórter GFP-CDK2.
   NOTA: Como determinar principalmente definições de selecção e aplicá-las para análise de dados são discutidas abaixo na seção de dados representativos e Figura 6 (para analisar os dados fornecidos uso '0.004' e '1.5', respectivamente). Usuários de Mac devem executar o script Perl a partir da linha de comando Terminal, escrevendo: "perl 2_gate_classifier.pl '.
3. Observe o arquivo recém-criado que combina os valores do ensaio de células individuais matérias a partir dos dados originais Profiler celular com rótulos de sub-populações que mostram como cada célula de cada poço realiza contra as duas portas (Figura 6C).
4. Traçar os dados para cada condição experimental utilizando os rótulos subpopulação de células individuais, abrindo o software RStudio. Clique em "Arquivo" e "Abrir Arquivo" e selecione o arquivo fornecido "analysis.r '. Observe os comandos para traçar Figuras 6B, 7 e 8 na janela superior esquerda da RStudio (Figura S2B). Na janela superior esquerdo, entre os símbolos de aspas duplas nas linhas 5 e 6, digite o endereço do computador da pasta que contém os dados fechados. Inclua a letra de unidade e o nome do arquivo em si, respectivamente (por exemplo, "C: pasta / análise / saída da análise" e "nuclei_gated.csv").
   NOTA: Se RStudio é utilizado pela primeira vez num dado computador, o pacote de ilustrações R 'ggplot2' terá de ser instalado pela primeira vez. Isto é uma vez só passo para uma nova instalação do RStudio, após o que este passo torna-se redundante. Para instalar 'ggplot2', clique na guia chamado "pacotes" acima da janela no canto inferior direito da RStudio, clique no botão "Instalar Pacotes 'que aparece abaixo desta. Uma nova janela irá aparecer. Tipo 'ggplot2' (cotações omitindo) para o 'Pacotes' sritmo nesta nova janela e, finalmente, clique no botão "Instalar" para fechar a janela, instale as funções ggplot2 necessárias e retornar à janela RStudio principal para continuar a partir do passo 3.6.
5. Destacar linhas de 1 a 17 na janela superior esquerda da RStudio, em seguida, clique no botão "Executar". Isto irá inserir os dados experimentais, limiares e detalhes bem localização em R (Figura S2C). R passou a deter temporariamente os dados relevantes para a plotagem.
6. Destaque blocos individuais do código restante sob linha 17 e criar as parcelas correspondentes ao clicar no botão "Run" como antes. Observe as parcelas na janela no canto inferior direito da RStudio e salvar o número de formatos, clicando no botão "Export" (Figura S2D).
7. Ao fechar RStudio, clique em "Não Salvar" quando solicitado. Isso evita confusão na próxima uso de RStudio, que de outra forma armazenar dadosda sessão anterior.

Results

O exemplo de um conjunto de imagens geradas utilizando o protocolo de transfecção de inversão de rastreio de siRNA foram preparadas e analisadas utilizando o software Profiler celular. Os dados brutos numérico resultante é de tal modo que cada célula é representado individualmente, ser reconduzidas para a sua imagem e também de origem e medido por vários parâmetros de intensidade de fluorescência (Figura 6A). Para cada célula identificada a intensidade média de fluorescência nuclear para o anticorpo RB1 P-S780 e a intensidade de ADN integrado para os corantes de ADN definida-máscaras nucleares são determinados. Valores de intensidade GFP média para as regiões do núcleo e no citoplasma de cada célula também são registrados permitindo o cálculo do nuclear contra fluorescência citoplasmática do repórter GFP-CDK2. A jusante destas medições da intensidade de fluorescência algorítmica é feito uso destes dados para definir células individuais para portões dois ensaios, coloração do anticorpo nuclear e GFP-CDK2 repórter. Anotação posterior das células em the com base em resultados de ensaio e a utilização destes marcadores para permitir a subpopulações específicas para ser ainda caracterizado por uma terceira medição (conteúdo de DNA nuclear) é descrita.

Histograma dos dados de intensidade de fluorescência em bruto recolhidas para cada ensaio são uma forma eficaz de avaliar como subpopulações de células se comportam em diferentes condições. Os histogramas da Figura 6B mostram as distribuições de população de células de dados individuais a partir de poços em triplicado para cada condição knockdown RNAi. À esquerda estão os dados de intensidade anticorpo nuclear e à direita estão os dados correspondentes para o repórter GFP-CDK2. Os dados anticorpo RB1 P-S780 revela que as células amplamente existir em duas populações no que diz respeito a esta modificação pós-traducional e que as populações de células com perda de RB1 fosforilado em S780 pode ser distinguida como um pico de intensidade de mão esquerda nuclear que está enriquecido quando CDK6 é derrubado por siRNA. Este mesmo pico da esquerdaé visto quando o próprio RB1 é o alvo ARNi, reflectindo a remoção absoluta da proteína e, assim, P-S780 coloração RB1. Em contraste, nas mesmas condições experimentais para as mesmas células, quando observada através do ensaio de repórter GFP-CDK2, mostram uma dinâmica diferente em os dados de células individuais. A distribuição contínua é observada, com apenas um único pico, mas siRNA que perturba o ciclo celular (siCDK6) e provoca acúmulo de resultados da fase G1 em uma extensão do ombro do lado direito do que a distribuição (ou seja, indicando reforçada presença de células que mostram um aumentar na proporção GFP nuclear / citoplasma, representada no eixo X).

Também é mostrado nas histogramas de Figura 6B são os valores de porta (barras verticais) que são seleccionados com base da distribuição de ambos os conjuntos de dados de ensaio. A regra utilizada para os dados anticorpo RB1 P-S780 é para definir a posição do portão como o meia-height: posição máxima de largura sobre o ombro esquerdo da principal(Direita) de pico quando se analisam os dados da célula de controle negativo (não-alvo siRNA). Dados destacado em vermelho são células com reduzida e ausente RB1 P-S780, que são identificados com este portão. Um portão semelhante posicionado no ombro oposto da distribuição dos valores de relação é utilizada para o repórter GFP-CDK2. As células subpopulação de alta proporção resultante, que não possuem ou recurso reduzida atividade CDK2, são mostrados em verde. Para ilustrar a análise multiplexado dos dois ensaios Figura 6C mostra a implementação de ambos os valores de porta usando o script 2_gate_classifier.pl perl para converter os dados em bruto (Figura 6A) para o arquivo anotada abaixo. Esse novo arquivo inclui os dados originais ao lado de uma nova coluna de rótulos de classe para cada célula e os dois valores de porta utilizados para distingui-los (neste caso, portões de 0,004 para os dados de anticorpos e de 1,5 para o repórter GFP-CDK2 foram utilizados, respectivamente) .

Tendo classificou as células individuais from cada condição knockdown com base em dois ensaios agora é possível usar esses rótulos de classe para ajudar a anotação de parcelas dos dados do ensaio. A Figura 7 mostra dispersar parcelas de dados de células individuais para a P-S780 RB1 e GFP ensaios CDK2 a partir dos dados exemplo dado por todas as três condições de RNAi. Números anotando os quadrantes sobre os diagramas de dispersão mostram as percentagens relativas de cada subpopulação fechado a todo o contexto para knockdown e que são gerados em R, utilizando as etiquetas de classe descritos acima. Estes gráficos mostram que, em comparação com células transfectadas com não-alvo ARNsi (Figura 7B), as células transfectadas com siCDK6 revelam uma distribuição de dados líquido deslocado tanto para baixo no eixo Y (indicando ausência de RB1 fosforilação em serina 780) e para a direita no eixo X (indicando uma baixa actividade de CDK2, Figura 7C). Ambas as mudanças são esperadas para knockdown desta meta. Em contraste com isto, os dados de SirAs células transfectadas B1 (Figura 7A) mostram uma perda da coloração do anticorpo de acordo com a perda do epitopo, mas pouco efeito na distribuição de dados para o repórter CDK2 em comparação com os controlos não-transfectadas com siRNA alvejando, sugerindo que não houve grande efeito sobre a GFP repórter -CDK2 surge de RB1 knockdown.

Para explorar ainda mais o uso de dados de célula individual, a classificação subpopulação e ensaio multiplexing figura 8 mostra o gráfico de dispersão para os dados de perfis siCDK6 histograma Figura 7C ao lado emparelhados para intensidade integrada DNA. Os pares de histogramas referem-se a metades opostas de toda a população, dividido com base na intensidade ou anticorpo (à direita do gráfico de dispersão) ou GFP-CDK2 valores de razão de repórter (acima da dispersão). A quantificação da intensidade de ADN nuclear para estas populações mostra dois picos característicos de 2N e 4N teor de ADN como picos à esquerda e à direita, respectivamente. O intentions das portas mostrados nas Figuras 6, 7 e 8 são de tal forma que as células identificadas como de baixo para P-S780 RB1 (rotulado: P-S780-) ou com um valor elevado rácio do repórter GFP-CDK2 (rotulado: G1) vai estar em fase G1 do ciclo celular. Com efeito, os histogramas de perfis de ADN para sub-populações identificados com qualquer um destes ensaios contêm predominantemente células com teor de DNA 2N. Os perfis de ADN da população opostamente fechado (marcado: P-S780 + ou não-G1) contém células com distribuições variam de 2N a 4N, de acordo com estas células, que adopta uma gama de posições do ciclo celular fase pós-G1.

Embora o foco aqui tem sido a geração e análise de dados de células individuais a partir de imagens coradas fluorescentemente, ele também é útil para ser capaz de levar esses dados e resumir cada ensaio de uma forma bem-a-poço para monitorizar a variabilidade entre repetições e o desempenho de todos os poços, para cada ensaio através de uma placa inteira de dados. a) Os dados RB1 P-S780 e b) Os dados repórter GFP-CDK2. Os valores plotados em A e B são produzidos por dois scripts Perl adicionais fornecidos com este manuscrito; 'Antibody_fluorescence_summary.pl' e 'G1assay_summary.pl', respectivamente. Esses scripts usar os dados brutos criados por Profiler Cell (Nuclei.csv) e os dados do relatório por bem como i) células totais medidos por poço, ii) o número de células dentro do portão, iii) as células por cento, dentro da porta e iv) a aritmética média das medidas, dados brutos para que bem. Isso está incluído como uma opção adequada para olhar através de grandes conjuntos de dados de ensaio, antes de se concentrar em dados individuais de tratamento utilizando avaliação multiplexado de dados de células individuais, como ilustrado na 8. Os gráficos exibidos aqui enredo "iii) células por cento dentro do portão 'para ambos os ensaios, que atendam as distribuições de dados não-normais visto para os dados P-S780 RB1 e GFP-CDK2 nos histogramas da Figura 6B. Esses scripts também calcular 'iv) a média aritmética das medidas, dados brutos para que bem ", que iria servir de análise de dados para respostas população homogênea e distribuição normal dos dados antes e depois da perturbação experimental.

Figura 1:. Visão geral das etapas no fluxo de trabalho para analisar quantitativamente os dados de imagem de microscópio fluorescente etiquetado O fluxo de trabalho é representado aqui como quatro etapas (A) Em primeiro lugar, é necessário preparar experimentalmente células para imagens fluorescentes.. O exemplo aqui descrito é que um detela nas quais as células tumorais humanas aderentes tratadas com siRNA são cultivadas durante 48 horas, fixadas e coradas em uma placa de 96 poços de cultura de tecidos. Condições de RNAi diferentes estão presentes em triplicado em poços separados dentro do prato. As células são marcadas com um corante de ADN, um anticorpo especifico para RB1 fosforilada na CDK4 e 6 selectiva local alvo Serina-780 (P-S780 RB1) e que também expressam estavelmente um GFP-CDK2-repórter, relatando G1 do ciclo celular de saída. Conjuntamente, estas sondas fluorescentes constituem dois ensaios avaliados separadamente dentro do fluxo de trabalho. (B) imagens de microscópio Paralelos para cada sonda fluorescente (canal) são gerados e nomeado como para incluir detalhes por que o software de análise de imagem pode organizar os dados. (C) A ficheiros de imagem são carregados no software Profiler celular, o que identifica células individuais através de algoritmos e os pares associados de núcleos e citoplasma antes de ceder medições de intensidade para as três sondas fluorescentes detectared em cada um. (D) Finalmente, um script Perl é usado para organizar os dados quantitativos matérias produzidas. Essa etapa se aplica portões para os dados de intensidade de fluorescência para cada célula, efetivamente binning as células para as subpopulações, que podem ser plotados, monitorado e interrogado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Dados experimentais para ser obtida por análise de imagem, os tratados com siRNA, as células marcadas com fluorescência a partir dos dados fixos exemplo fixados foram fotografadas e as medições de intensidade correspondentes tomadas por célula.. Dados de imagem representativos são mostrados para cada parâmetro gravada durante a análise da imagem de intensidade (A) ADN nuclear:. A intensidade de coloração do corante de ADN nuclear é utilizada para produzir uma medida de DNA por núcleo (B) Intensidade Nuclear de fosfo-RB1:. específico para P-S780 RB1 usando um (preto) anticorpo primário e fluorescente etiquetado anticorpo secundário (vermelho) permitem uma medição da intensidade de RB1 fosforilação at-imuno . S780 por núcleo (C) GFP-CDK2 repórter: As células utilizadas estavelmente expressam uma proteína repórter GFP marcada com que transloca entre o núcleo e citoplasma em conjunto com um padrão do ciclo celular. Medição dupla de a intensidade de GFP nuclear e citoplasmática emparelhados para cada célula permite o cálculo de uma proporção por célula que pode ser usada para distinguir a fase G1 do resto do ciclo celular. Três alvos siRNA irá ser usado para ilustrar a análise; um não-alvo siRNA controle negativo; CDK6 siRNA como um controlo positivo em perturbando a fosforilação RB1 e do progresso do ciclo celular; RB1 siRNA para estabelecer a especificidade do anticorpo.k "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Organização de ficheiros de imagem antes da análise de imagem As imagens obtidas a partir da placa de cultura de tecido são denominados sistematicamente, a fim de permitir que o software de análise de imagem para relacionar os dados de imagem de volta para o contexto experimental inicial.. Esta informação é colocado dentro do nome de arquivo para cada imagem. (A) Como cada poço na placa de experimento pode corresponder a diferentes alvos RNAi ou tratamentos, a parte formas de endereço bem do nome do arquivo. (B) O número do quadro faz parte do nome do arquivo . como cada poço é fotografada para coletar múltipla, não sobrepostas quadros (C) As sondas fluorescentes de cada quadro são gravadas separadamente; consequentemente, os nomes de arquivos também precisa refletir qual o canal de cada imagem se relaciona. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4:. O uso de celular Profiler para medir DNA nuclear e coloração de anticorpos Com as configurações no arquivo gasoduto fornecida (3_channels_pipeline.cppipe), o profiler celular valores de intensidade de análise de imagem de software medidas de fluorescência para DNA nuclear e anticorpo-vinculativo sobre células individuais . (A) Os núcleos são identificadas na imagem do canal "azul" de ADN coradas. (B) < / Strong> As posições dos núcleos de DNA manchado estão temporariamente detidas em um "Núcleos máscara '. A máscara de Núcleos é então colocado sobre (C) as imagens azuis e vermelhos de canal (dados de DNA e de imunofluorescência, respectivamente) e os valores de fluorescência de segmentos de imagem que se sobrepõem com a máscara são contabilizados em contrapartida de cada célula identificada. A identificação bem sucedida de núcleos vizinhos separados, podem ser avaliados visualmente o aspecto da máscara Núcleos. Para ilustração, aparece circulado esta imagem Máscara in, são exemplos onde as configurações escolhidas para o algoritmo tem mis-identificados núcleos vizinhos como um único núcleo. Ajustar as definições de algoritmo para minimizar esses eventos é introduzido na seção de discussão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

/ftp_upload/51882/51882fig5highres.jpg "/>
Figura 5: Utilização de Profiler celular para medir intensidades GFP nucleares e citoplasmáticos A CDK2 repórter marcado com GFP transloca entre o núcleo e citoplasma em relação à posição do ciclo celular das células.. Ao mesmo tempo que calcula as Profiler celular de ADN e intensidades nucleares de anticorpo por célula (Figura 4), ​​que também calcula a razão citoplasma para nuclear de intensidades de GFP para cada célula. (A) Os corantes de dados de ADN para cada imagem é usado para gerar Núcleos de uma máscara. Profiler (B) celular utiliza a Núcleos em conjunto mascarar a imagem do repórter GFP GFP-CDK2 para propagar a posição de cada célula e, em seguida, expande-se com a do perímetro de cada célula para estimar toda a pegada de cada célula. Isto torna-se um novo, 'máscara celular'. (C) A máscara de núcleos é subtraída da máscara celular para produzir uma série de donut semelhante citoplasma de contornos, que se tornamo 'Cytoplasm máscara'. (D) A máscara eo citoplasma máscara núcleos são usados ​​por Profiler celular para medir pares de valores GFP nuclear e citoplasmática. Estes valores emparelhados são então usados ​​por Profiler celular para calcular as razões, que informam a posição de cada célula no ciclo celular. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6:. A extração de dados - processamento de dados de células individuais matérias impondo portões em valores de ensaio tendências biológicas a partir dos dados de células individuais para a coloração de anticorpos e ensaios repórter GFP-CDK2 são extraídos usando dados fechados. Histogramas dos dados brutos permitir a identificação dos valores de porta adequados. Estes são então imposta com um script Perl. (A) Aproduto final de analisar os arquivos de imagem com as definições previstas Profiler celular são separados por vírgula de valor (.csv). Esses arquivos c ontain dados de células individuais relativas a cada um dos diferentes segmentos sub-celular. O ficheiro 'Nuclei.csv' contém todas as medições relativas seleccionadas para a utilização da máscara de Núcleos. Essas medições incluem intensidade anticorpo nuclear, intensidade de ADN nuclear e a proporção de GFP (núcleo / citoplasma). (B) Os histogramas de intensidade anticorpo nuclear (esquerda) e rácios repórter GFP-CDK2 (direita), traçada a partir dos dados de células individuais para cada condição knockdown siRNA . As barras no histogramas apresentados mostram as posições do portão desejadas para estes ensaios. Dados coloridos em histogramas indicar as subpopulações fechados. (C) Os portões para os dois ensaios ilustrados na B são aplicados aos dados brutos usando o script Perl '2_gate_classifier.pl'. O scriptcria uma cópia modificada do arquivo de saída Profiler célula original (Nuclei.csv) para ajudar plotagem subseqüente. Os dois valores de porta são registrados no novo arquivo (em destaque na cor aqui) e uma coluna de novo "rótulo" é adicionado. A rótulos bin cada célula em um dos quatro possíveis subgrupos com base nos dois valores de ensaio fechado para cada célula. Esses rótulos são usados ​​em parcelas subsequentes, que apresentam cálculos das contribuições de cada subpopulação, bem como o cruzamento de parâmetros adicionais gerados no Profiler Cell. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7:. Gráficos de dispersão para cada condição de siRNA que descreve os dados brutos para células individuais e posições do portão Espalhe parcelas de individados da célula dupla de todas as imagens para as condições de siRNA indicados: (A) siRB1; (B) controle negativo de segmentação Sinon; (C) siCDK6. Plotados contra os eixos Y são valores de fluorescência nuclear de coloração RB1 anti-P-S780. Conspiraram contra os X-eixos são os valores da relação correspondentes calculados a partir do repórter GFP-CDK2. As barras vermelhas e verdes indicam as posições das portas para o portão RB1 P-S780 e os portões repórter GFP-CDK2, respectivamente. As duas portas dividir as células em quatro subpopulações e os números nos quadrantes resultantes são o número de células por cento de cada um deles. Anotações em torno dos eixos para A indicam os quatro possíveis rótulo-elementos aplicados a cada célula pelo script Perl 2_gate_classifier.pl. Estas etiquetas são mostrados em relação à sua respectiva porta de ensaio e são utilizados no R-script (analysis.r) para gerar os gráficos das figuras 6, 7 e Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Celulares subpopulações definidas pelos dois ensaios de trânsito G1 mostram perfis de ADN 2N e 4N de acordo com o resultado do ensaio O gráfico de dispersão dos dados para as células siCDK6 é repetido a partir da Figura 7C.. Cercando o gráfico de dispersão são histogramas para intensidade integrada DNA nuclear relativa aos subgrupos da população. Aquelas acima da dispersão se relacionam com o ensaio de repórter GFP-CDK2. Aqueles para a direita do gráfico de dispersão relacionar sozinho nuclear fosfo-RB1 medições de anticorpos. As linhas de porta coloridas são estendidas para mostrar sua relação com os histogramas. Etiquetas porta pela qual os dados da célula foram selecionados para estas parcelas adicionais também são mostrados. Células com perda de RB1 fosforilados em serina 780 (P-S780-) ou aqueles com um alto GFP-CDK2 repórter nuclear à relação citoplasmática (indicando baixa atividade CDK2) mostram perfis de ADN predominantemente 2N-like, enquanto os seus homólogos opostas para cada respectivo ensaio apresentam uma distribuição de 2N e 4N, característica de uma população fase mista, pós-G1 das células. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: parcelas Resumo dos valores de ensaio fechado para cada siRNA condição gráficos de dados Resumo de fechado (a) Dados RB1 P-S780 e dados (B) GFP-CDK2 de poços em triplicado para cada condição knockdown siRNA.. Os valores foram calculados a partir da saída do Profiler celular bruto (Nuclei.csv) usando oScripts Perl, 'antibody_fluorescence_summary.pl' (A) ou 'G1assay_summary.pl' (B). Os valores são representados graficamente meio das células por cento, dentro da porta aplicada a cada ensaio. As barras indicam erros padrão calculados a partir de poços em triplicado. , Homocedásticas valores T-Test P desemparelhados para cada condição knockdown em comparação com não-alvo siRNA são mostrados acima os dados representados onde P <0,001 (**) e P <0,05 (*). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura S1. Configurando o software Profiler celular para análise de imagens. (A) de tela de Profiler celular antes de quaisquer definições de análise de imagem são inseridos. (B) de tela de celular Profiler após os detalhes do algoritmo contidas no '3_channels_pipeline.cppipe' foram carregados. A alta guia iluminado no canto superior esquerdo indica que esta tela mostra os parâmetros para a fase de '' LoadImages da análise. Clicando sobre as outras partes da lista abaixo esta irá revelar os detalhes para as etapas posteriores na análise. (C) de tela de Profiler celular com detalhes para Pasta de entrada e de saída Pasta entrou. (D) de tela de Profiler celular após o "Analisar botão "imagens foi clicado para começar a análise. Sobrepondo-se três novas janelas que ilustram as máscaras algorithmically produzidos gerados pelo software a partir das imagens em análise. Estas janelas são acessados ​​clicando nos ícones "olho" para a posição de abertura ao lado dos passos relevantes na análise, no canto superior esquerdo da janela Profiler celular principal. Estes pontos de vista ajudam o usuário a verificar se as configurações gerando as máscaras confetes de cor de acordo com os dados originais, em anexo, em tons de cinza.

ent "> Figura S2. O uso de Perl e RStudio aos dados de células individuais do portão e traçar as subpopulações de células resultantes. (A) O painel da direita mostra a pasta escolhida para receber os arquivos de saída .csv (ícones verdes) a partir da análise Profiler Cell. Os scripts Perl fornecidos com o manuscrito (ícones azuis) são copiados para esta pasta. Destaca-se o script Perl '2_gate_classifier.pl', que foi clicado duas vezes com o rato para produzir a caixa de diálogo no painel da esquerda. São mostrados a prompts e correspondentes digitado respostas necessárias para gate os dados de células individuais a partir do arquivo 'Nuclei.csv'. (B) de tela de RStudio imediatamente após o carregamento do script 'analysis.R'. Destacam-se os comandos para carregar os dados fechados de A em o software antes de traçar (detalhes blocos em linhas 5 e 6 terá de ser ajustada de acordo com os dados fechado onde está localizado na computaçãor utilizado para análise). (C) de tela de RStudio uma vez os dados foram enviados. (D) de tela de exibição RStudio destacou o bloco de código necessário para produzir o enredo mostrado na janela inferior direita. Códigos para cada parcela são separados por linhas em branco e agrupadas por tipo de enredo.

alvo siRNA	Endereços bem Placa
Non-targeting (NT)	E5, F5, G5
Retinoblastoma (RB)	E7, F7, G7
Ciclina quinase dependente 6 (CDK6)	B2, C2, D2

Tabela 1: Bem endereços e condições siRNA correspondentes utilizados nos dados exemplo dado.

Discussion

O fluxo de trabalho descrito constitui um procedimento para a perturbação de poços múltiplos de células utilizando siRNA, a detecção de marcador subsequente e, finalmente, o uso de uma série de passos suportado por software para facilitar a extracção dos dados quantitativos a partir das imagens de microscopia de fluorescência resultantes. A abordagem é focada na entrega de valores de intensidade nucleares e citoplasmáticos de células individuais, o que tem ampla aplicação prática em muitas aplicações baseadas em células. Os dados exemplo aqui utilizado foi gerado em um ambiente de tela siRNA em que dois ensaios fluorescentes para a fase G1 trânsito ciclo celular são testados e correlacionados de volta para uma medida biofísica mais direta do conteúdo de DNA nuclear.

O uso de um corante de ADN fluorescente no DNA nuclear de imagem é uma passo indispensável no processo de segmentação da imagem, uma vez que permite a identificação de células individuais e a 'Núcleos máscara' resultante serve como o ponto de partida para identificar correspondente cytoplasmiregiões c. A CDK2 repórter marcado com GFP, que é expresso de forma estável em células, dá uma variável ainda consistentemente mais elevado do que o sinal de fundo no citoplasma, através da qual este compartimento pode ser delineada. O mesmo gasoduto análise deve ser aplicável à análise de eventos de translocação de proteínas utilizando outros repórteres ligados a fluorescência adequadas ea sua resposta à perturbação. Além disso, o repórter GFP, substituindo-CDK2 com corantes fluorescentes específicos do citoplasma permitiria a utilização deste algoritmo alternativo para medir as dimensões do citoplasma e os tamanhos relativos das células nas imagens.

Outra consideração de projecto na estratégia de segmentação de imagens descrito aqui é o uso de Profiler celular para fornecer valores de intensidade integrada para a quantificação de ADN. Integração da intensidade de valores para o DNA nuclear de dados de coloração permitir eventuais variações no tamanho do núcleo, e representa uma estreita correspondência para os perfis de quantificação vistospara iodeto de propídio manchado FACS dados. No entanto, a intensidade integrada não podem fornecer um meio adequado para avaliar a função da proteína em que a concentração média, exemplificado por intensidade de fluorescência média de antigénio, é biologicamente mais relevante do que a quantidade total integrado proteína (e fluorescência associada) dentro de um compartimento da célula. Por conseguinte, os valores de intensidade média foram utilizadas para a P-S780 RB1 e dados GFP. A opção de alterar entre os dois modos (média ou integrado) de avaliação de dados é encontrado no painel 'ExportToSpreadsheet' do software Profiler Cell.

As definições de análise no arquivo 3_channels_pipeline.cppipe são otimizados para as imagens do conjunto dados de exemplo. Análise de novas imagens conjuntos com este protocolo, é necessário que os nomes dos arquivos adotar a convenção de nomenclatura acima descrito (Figura 3). Além disso, valores de sensibilidade para atender o brilho da coloração DNA nuclear e limiares para o fundointensidades nos novos conjuntos de imagens podem ter de ser ajustada dentro das definições Profiler celular. Dado o papel chave a coloração DNA vale para construir as várias máscaras de segmentação de imagem, o aplicativo de configurações de sensibilidade corretas para este canal é a chave para a análise de sucesso de novos dados de imagem com o software Profiler Cell. O arquivo de configurações, desde Profiler Cell (3_channels_pipeline.cppipe) contém notas sobre os parâmetros mais freqüentemente útil para adaptar a análise de novos dados. Estas notas são na caixa de texto na parte superior da tela na janela principal Profiler o celular e incluir orientações sobre como alterar as configurações de sensibilidade e ajustando o número de canais a serem analisados. Como indiciado em Protocol seção 2.8, para testar configurações para novos dados de imagem pode ser necessário observar a segmentação de imagens durante a análise de imagem clicando aberto os ícones "olho" para cada um dos "Identificar ... objetos" etapas do protocolo (Figura S1D ). Em particular, a visualização dos dados da imagem, através de "IdentifyPrimaryOjects 'mostra se a máscara Núcleos está correctamente identificado a partir de imagens da coloração do ADN. Na página software Profiler celular para o módulo 'IdentifyPrimaryOjects' é o fator de correção de limiar. Ajuste de tentativa e erro desse valor irá corrigir a maioria dos erros de reconhecimento nucleares. Os valores equilibrar o canal de ADN contra a intensidade do fundo para cada imagem. Valores do fator de correção Threshold dobradiça em torno de 1, onde maior do que este é mais rigoroso (bom para imagens claras) e menos do que 1 é branda (adequado para imagens com menos contraste entre a coloração e de fundo).

A saída bruta de dados célula individual de Profiler celular pode ser analisado em diferentes maneiras de atender as necessidades de outros estudos. Mostrado aqui, é a utilização de um script Perl para aplicar portas para dois dos parâmetros medidos em cada célula, a fim de ajudar a extrair tendências biológicas a partir de uma a dadosd autorização de referência cruzada das subpopulações identificadas com medidas adicionais. Embora seja igualmente possível incluir elementos de gating no âmbito do Profiler Cell, a rota alternativa utilizada aqui proporciona maior flexibilidade e velocidade, especialmente se grandes conjuntos de dados precisam ser avaliados. O estágio mais lento nas fases de aquisição de pós-imagem do actual protocolo é o funcionamento do software Profiler Cell. Profiler celular aqui é executado sem impor portões para produzir um conjunto de dados brutos fechado-un, que pode ser novamente analisadas com o script Perl subsequente mais rapidamente e, se necessário, de forma iterativa, com diferentes valores de porta. Nem todos os estudos vai saber com antecedência os valores de porta adequados como isso pode variar de acordo com reagentes em um determinado conjunto de dados, e, potencialmente, ao longo do tempo. É, portanto, recomenda-se a gerar histogramas que descrevem a distribuição dos dados obtidos a partir de matéria-Profiler celular para controles positivos e células mock-perturbadas, a fim de identificar valu portão adequadoes para os parâmetros de interesse.

Os scripts Perl são escritos para aceitar uma estrutura de colunas rigidamente definido de dados do Profiler celular e pode parar de funcionar se um usuário modifica o número de parâmetros de saída por Profiler celular usando as configurações do 'ExportToSpreadsheet'. Para ajudar a implementar a modificação das configurações de notas estão incluídos dentro dos arquivos de script Perl. Para ver estes ler o script em um editor de texto, editor de texto, de preferência de um programador definir a elementos Perl código de cor (por exemplo, http://www.activestate.com/komodo-edit). Estas notas indicam onde para ajustar o script para se adaptar às mudanças no formato de dados. Similar aos scripts Perl, o arquivo R-código fornecido (analysis.r), que contém as instruções para plotar os dados da análise de dados de imagem, pode ser lido em um editor de texto ou software RStudio ver notas adicionais sobre a utilização e adaptação. Estas notas podem ser complementados com informações sobre expressões regulares e Perl ^{12 eo pacote ggplot2 13 para R, ambos os quais formam a base de como os dados são lidos, anotado e plotados, respectivamente.}

Novos estudos utilizando microscopia de fluorescência, bem como dados em bruto depositados com as publicações de origem abertos são passíveis de métodos de análise, tais como as descritas aqui. A própria natureza dos dados de alto conteúdo se presta à análise recursiva com ênfases diferentes analíticas, dependendo dos interesses de qualquer observador de pesquisa. Embora as questões que podem ser feitas dos dados estão limitados pelas sondas usadas originalmente, os dados de imagem muitas vezes pode ser significativamente novamente analisadas para além do âmbito dos estudos que os geraram.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SiRNA de controle negativo AllStars	Qiagen	1027280	SiRNA de controle negativo.
CDK6 siRNA	Dharmacon/ Síntese personalizada	NA	Sequência antisense: 5' CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU
RB1 siRNA	Dharmacon/ Síntese personalizada	NA	Sequência antisense: 5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT
5x tampão siRNA	Thermo Scientific	B-002000-UB-100	Para ser diluído com água tratada sem nuclease e não DEPC.
Água sem nulcessação (não DEPC)	Applied Biosystems	AM9937	Para diluição de tampão siRNA.
Hiperfect	Qiagen	301705	Lipídio de transfecção.
DMEM	Life Technologies	41966052	piruvato e meios de cultura de tecidos suplementados com alto teor de glicose.
Placa de cultura de tecidos de 96 poços	Falcon	3072	Plain, placa de cultura de tecidos de 96 poços para a mistura paralela e compartimentada de complexos de transfecção.
Placa de visualização Packard	Perkin Elmer LAS	6005182	placa TC de 96 poços com base óptica na qual as células são transfectadas, cultivadas, fixadas e, eventualmente, fotografadas. Fornecido com vedações de placas adesivas opacas, que são usadas durante o armazenamento de placas usadas.
Membrana respirável	Alpha Labs	LW2783	Membrana adesiva estéril, permeável a gases.
Formalina tamponada neutra, 10%	Sigma-Aldrich	HT5012-1CS	10% Formalina (4% formaldeído) fixador usado puro no protocolo.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100PC	Detergente
[cabeçalho]
Tris	Sigma-Aldrich	T1503	Base Trizma (tris(hidroximetil)aminometano)
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Para solução de lavagem de placas.
Anticorpo anti-P-S780 RB1	Abcam	ab32513	Coelho monoclonal
AlexaFluor647 Anti-coelho	Invitrogen	A21245	Anticorpo secundário altamente adsorvido e marcado com fluorescência.
Hoechst 33342 (Bisbenzimida)	Sigma-Aldrich	B2261	Fluorescente, intercalação de cromatina, corante de DNA.
Solução de permeabilização	NA NA		0,1% Triton X-100 em solução salina tamponada com Tris 50 mM, pH 8,0.
Solução de lavagem de placas	NA	NA	Solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% de Tween-20.
Solução em bloco	NA	NA	5% de leite em pó em solução salina Tamponada com Tris e 0,1% de Tween-20. Para placa de bloqueio antes da imunocoloração e diluição de anticorpos.
Cell Profiler 2.1	Broad Institute		http://www.cellprofiler.org/download.shtml
Active Perl Community Edition	ActiveState		http://www.activestate.com/activeperl/downloads
ambiente de programação R	The R Foundation		http://www.r-project.org
Rstudio	Rstudio		http://www.rstudio.com/