Arbetsflöde för hög halt, Individuell Cell Kvantifiering av fluorescerande markörer från Universal Mikroskop Data, som stöds av Open Source Software

Summary

Presenteras är en flexibel informatik arbetsflöde möjliggör multiplex bildbaserad analys av fluorescerande celler. Arbetsflödet kvantifierar nukleära och cytoplasmiska markörer och beräknar markör sloka mellan dessa avdelningar. Förfaranden tillhandahålls för störning av celler med användning av siRNA och tillförlitlig metod för analys av markör detektering genom indirekt immunofluorescens i 96-brunnars format.

Abstract

Framsteg inom förstå kontrollmekanismer som styr beteendet hos celler i vidhäftande däggdjursvävnadskulturmodeller blir alltmer beroende av former av encelliga analys. Metoder som levererar sammansatta uppgifter återspeglar medelvärden av biomarkörer från cellpopulationer riskerar att förlora subpopulation dynamik som speglar det heterogena studerade biologiska systemet. I linje med detta, är traditionella metoder ersätts av, eller stöds med, mer sofistikerade former av cellulär analys som utvecklats för att möjliggöra en bedömning av hög halt mikroskopi. Dessa analyser potentiellt generera ett stort antal bilder av fluorescerande biomarkörer, vilket möjliggörs genom åtföljande proprietära programvarupaket, tillåter fler parametriska mätningar per cell. Dock har de relativt höga kapitalkostnader och overspecialization av många av dessa enheter hindrade deras tillgänglighet till många utredare.

Beskrivs här är enuniversellt användbar arbetsflöde för kvantifiering av flera fluorescerande markör intensiteter från specifika subcellulära regioner i enskilda celler lämpliga för användning med bilder från de flesta fluorescerande mikroskop. Nyckeln till detta arbetsflöde är genomförandet av den fritt tillgängliga Cell Profiler programvara ¹ att särskilja enskilda celler i dessa bilder, segment dem till definierade subcellulära regioner och leverera fluorescens markör intensitetsvärden som är specifika för dessa regioner. Utvinningen av individuella cellintensitetsvärden från bilddata är det centrala syftet med detta arbetsflöde och kommer att illustreras med analysen av styrdata från en siRNA skärm för G1 checkpoint tillsynsmyndigheter i vidhäftande humana celler. Däremot kan arbetsflödet presenteras här tillämpas på analys av data från andra medel för cell störning (t.ex. sammansatta skärmar) och andra former av fluorescensbaserade cellulära markörer och därmed bör vara användbara för ett brett spektrum av laboratorier.

Introduction

Arbetet presenteras här beskriver användningen av fritt tillgänglig programvara Cell Profiler för att utföra algoritmen styrd fördelning av fluorescerande mikroskopiska bilder av vidhäftande celler för att identifiera enskilda celler och definierade subcellulära regioner. Detta tillvägagångssätt, som kallas bildsegmentering, medger att efterföljande multi parametrisk analys av de avbildade cellerna genom att kvantifiera fluorescensmärkta markörer lokaliserade till varje cell eller subcellulär regionen (kallad segmente objekt). Detta arbetsflöde utgör en grund för att möjliggöra hög innehållsanalys och är avsedd att fungera som ett verktyg som kan vidareutvecklas och modifieras för att passa flera parametriska analyser individuell cell i laboratorier utan tillgång till specialiserade hög halt instrument eller proprietär programvara. Filerna medföljer detta manuskript inkluderar ett test uppsättning relevanta råbilddata, algoritminställningar och stödjande skript för att generera den analys som beskrivs. Den tillhandahålls algoritminställningar feller Cell Profiler är optimerade för de exempeldata som och diskussionsavsnittet detaljer vilka justeringar kan vara nödvändiga för att möjliggöra användning av bilddata från andra studier.

När kvantitativa data har extraherats med hjälp av Cell Profiler, kan olika laboratorier har olika krav på hur man kan använda den information som presenteras av de enskilda cellvärden i rådata; som visas här är ett tillvägagångssätt genom vilket grindar appliceras på rådata för varje analys. Med hjälp av dessa portar, är de data som omvandlas till binära termer av svar, vilket gör visualisering av trender som förbinder olika behandlingar med de subpopulationer av celler som genomgår svar definieras av grindarna. Grindarna sätts utifrån observationer av datafördelning erhållits för lämpliga negativa och positiva kontroller för varje relevant mätning. Användningen av grindar är bara ett exempel på hur man kan hantera de råa, cellbaserade mätningar. Också visas här är användningen av nukleärt DNA intensitet migasurements i sin råa form som en kontinuerlig rad värden i kombination med gated data. Andra tillvägagångssätt för hantering av data bildanalys bör övervägas, beroende på naturen av studien; statistiska alternativ till att använda grindar för att tilldela celler till subpopulationer har rapporterats ² och systematiska jämförelser av strategier för att sammanfatta data med hög innehålls över ett stort antal parametrar har rapporterats ^3.

Hög innehålls analyser av bilddata har funnit användning i cellulära studier av läkemedelssvar, omvända genetik och miljöstress signalering ^4-6. Förtjänsten av hög innehållsanalys härrör från det faktum att algoritmisk analys av fluorescensmikroskopi uppgifter möjliggör kvantitativa och rumsliga parametrar som skall beaktas samtidigt över enskilda celler ^7. På detta sätt kan cellulära utfall för flera analyser vara korsreferenser, differentiell beteende analys-defined cellsubpopulationer kan spåras inom experimentella förhållanden och analyser kan omfatta granskning av morfologiska variabler. Den strategier och analyser arbetsflöde diskuteras här, som för andra high-innehåll tillvägagångssätt, kan leverera multiplexerade data som kors refererade till enskilda celler. Hög halt metoder kostym studier som genererar fluorescerande mikroskop bilder och är tillämpliga för analys av data som sträcker sig från tiotals bilder som produceras i låg genomströmning konventionell fluorescens-baserade mikroskopi genom de tusentals bilder som framställts med hjälp av automatiserade hög halt screening plattformar.

Arbetsflödet illustreras här med exempeldata från vilka separata analyser mäts i termer av antingen kärn fluorescerande markör intensiteter eller nukleär / cytoplasma translokation av ett fluorescerande reporter protein, respektive. Arbetsflödet är flexibel i att dessa analyser kan behandlas separat eller i kombination beroende på each given frågeställning av olika utredare. De exempeldata produceras som en del av en RNA-interferens (RNAi) experiment (Figur 1). Små störande RNA oligonukleotider (siRNA) används för att VÄLDIGANDE specifika proteiner i HCT116 mänskliga kolorektala cancerceller som resulterar i förändringar för två fluorescerande reportrar av cyklin-beroende kinas (CDK) aktivitet. Den CDK6 beroende fosforylering av kärn retinoblastomprotein vid serin 780 (P-S780 RB1) bedöms av antikroppsfärgning. I samma celler, är ett grönt fluorescerande protein-märkta reporter av CDK2-aktivitet (GFP-CDK2 reporter) bedöms av landets kärnenergi till cytoplasma förhållandet var i avsaknad av CDK2 aktivitet reportern bosatt i kärnan och vid CDK2 aktiverings skyttlar i cytoplasman ^8. Dessutom är det nukleära DNA i varje cell färgas med hjälp av en DNA-interkalerande färgämne, Bisbenzimide, som fungerar som ett sätt att identifiera celler och definiera kärnor gränserna bilderna samt ensa mått av DNA överflöd med information om cellcykelläge av cellen (Figur 2).

Verksamheten i CDK6 och CDK2 är detekterbara som celler transit från G1 till S-fasen av cellcykeln ⁵ och avlöser varandra ^9,10 och som sådan, är nära överensstämmelse mellan de två reportrarna i enskilda celler förväntat. Demonstrationen dataset används här analyser som exempel effekten av siRNA riktar CDK6, retinoblastom protein (RB1) och en icke-inriktning negativ kontroll (tabell 1). Knockdown av CDK6 bör framkalla både en minskning av P-S780 RB1 epitopen och en ackumulering av celler i G1-fasen av cellcykeln. Den RB1 knockdown fungerar som en reagens kontroll för specificiteten hos fosfor-S780 antikropp. Fluorescensmikroskop bilder från formalin fast ^11, fluorescerande färgade HCT116 vävnadskulturceller används för algoritmisk bildanalys. Den resulterande numeriska data används sedan för attkorshänvisning reportrarna och bedöma konsekvenserna av de olika knockdown stater.

Den potentiella storleken på de data som produceras av denna typ av analys kan presentera en utmaning till normala analysverktyg. Till exempel kan de individuella celldata vara större än vissa kalkylprogram kommer att rymma. Inkluderat är Perl-skript som utför enkla, högt repetitiva, övervakad behandling av uppgifter för att underlätta analys av stora datamängder. De Perl-skript är skrivna speciellt för de utgående filer som produceras av Cell Profiler, när de behandlar bildfiler med en specifik fil namnkonvention (Figur 3), och möjliggör variabla antal fält per brunn som ska användas i analysen. Det är ofta viktigt att grinden individuell cell analysuppgifter för att spåra trender i cellsubpopulationer ⁵ och visas här är användningen av ett Perl-skript för att flagga varje cell baserat på en uppsättning grind förutbestämd för varje analys typ. Ingår även valfria Perl-skriptsom sammanfattar uppgifterna utfallet för enskilda brunnar (eller villkor), leverera: andelen celler inom den inställda grinden och medelvärdena för de råa analys poängen. Den senare, mer homogena sätt att visa data, är giltigt där svaren påverkar alla eller de flesta celler i en brunn. Som diskuterats ovan, är mindre användbar än den som ges av den enskilda cellen uppgifter gating där svar begränsas till en delmängd av celler inom en population sådan bedömning.

Nyttan av den beskrivna arbetsflödet är inte begränsad till störning av siRNA eller marköranalyser beskrivna. Studier har använt denna metod för att analysera svaren i vävnadskultur experiment med kombinationer av siRNA, kemiska hämmare och strålbehandling samt för bedömning av andra än CDK6 markörer och CDK2 aktivitet ^5.

Begreppsmässigt låter den experimentella strategin en mängd biologiskt användbara subcellulära regioner som skall registreras automatiskti enskilda celler som finns i fluorescerande mikroskop bilder. Som sådan, kan detta tillvägagångssätt ge kvantitativa, multiplexade uppgifter avslöjar biologisk information som kan missas genom tekniker som fokuserar på populationer snarare än enskilda celler. Med smärre modifieringar, kan den metod och analys arbetsflöde beskrivs ge kvantitativa, individuella celldata för eventuella fluorescensbaserade analys utgångar och cellbiologiska reaktioner, där kvantitativ bedömning av DNA-innehåll, kvantifiering av kärnkraft eller cytoplasmatisk fluorescens eller skytt av markörer mellan dessa två fack, antingen individuellt eller i ett multiplex sätt är av intresse. Som förlags krav tenderar alltmer mot inlämnande av öppet tillgängliga rådata, tillgång till och förtrogenhet med gratis verktyg för mikroskopi bildanalys såsom de som beskrivs här kommer också att vara av direkt intresse för labb som vill omanalysera publicerade data.

Protocol

1. Experimentell Perturbation och Cell Märkning för Response Markers (Omvänd Transfection siRNA Screen)

1. I en steril vävnadsodling huva pipett 70 pl 200 nM siRNA i 1x siRNA buffert i brunnar i en steril, vanligt 96 brunnar. Späd transfektion lipid i 40 volymer av serumfritt DMEM-medium och dispensera 105 ^ il i varje brunn innehållande siRNA.
   OBS: Utspädning 262,5 il lipid i 10,5 ml serumfritt DMEM ger en huvudblandning lämplig för en hel 96-brunnsplatta av siRNA, leverera 2,6 | il av lipid per brunn. Användning av 200 nM siRNA startkoncentration i detta steg kommer att leverera en fungerande koncentration på 20 nM i steg 1.3, men rutiner kommer att arbeta för att arbeta koncentrationer ned till 5 nM, med utgångskoncentrationen justeras därefter (dvs 50 nM). Lägre arbets koncentration kan minska off-target falska positiva poäng, även om de kan minska storleken på on-mål svar, vilket leder till ökad on-target falskt negativa.
2. Blanda plattan genom försiktig vibration för tio minuter vid rumstemperatur. Dela upp de resulte 175 pl i tre 50 ^ replikerar per mål på en ogenomskinlig, vävnadskultur behandlas, 96-brunnar med en transparent bas.
3. Omvänd transfektera genom dispense 8.000 celler per brunn i 150 pl DMEM innehållande 10% serum direkt på 50 il lipid-siRNA komplex. Använd HCT116 humana kolorektala celler stabilt uttrycker en GFP-märkta markör rapportering CDK2 aktivitet ^5,8. Inga ytterligare blandning är nödvändig. Täta plattan med en steril, lim membran som andas för att kontrollera luftfuktigheten och förhindra platt "kanteffekter" och placera plattan i en fuktad inkubator vid 37 ° C, 5% _CO2 under 48 timmar.
4. Suga ut mediet så att en liten restmängd av medie kvar i brunnarna. Fixera cellerna genom att tillsätta 100 pl av 4% buffrad formaldehyd till varje brunn och inkubera i ett dragskåp i 10 min vid rums temperatur.
5. Ta bort fästlösningen genom att aspirera plattan. Vid denna punkt antingen avbryta experimentet genom tvättning av plattan tre gånger med 100 | il fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och sedan lagra förseglas under 100 il PBS i mörker vid 4 ° C i upp till en vecka, eller fortsätta med permeabilisering av cellerna.
   OBS: Vi rekommenderar behandlingsplattor så snart som möjligt efter fixering, och i allmänhet föredrar lagring av fullt bearbetade plåtar. Biocidprodukter konserveringsmedel såsom timerosal, natriumazid, eller kommersiella alternativ kan tillsättas för att förhindra micoroganismal tillväxt. Tillsättning av fosfatasinhibitorer bidrar till att bevara Fosfor-epitoper, och andra sätt att bevara proteinmodifierings stater kan vara användbar i relevanta analyssammanhang
6. Avlägsna PBS från plattan och permeabilisera cellerna genom att tillsätta 100 pl av permeabilisering lösning. Inkubera under 10 min vid rumstemperatur utan skakning. Aspirera permeabilization lösningen med en MultichAnnel pipett. Upprepa detta steg tre gånger.
7. Blockera cellerna genom tillsats av 100 | il blockningslösning per brunn under 30 min vid rumstemperatur. Avlägsna blockningslösning genom att aspirera plattan, sedan sonden med 50 pl av anti P-S780 RB1 antikropp utspädd 500-faldigt i blocket lösningen för 2 h i mörker vid rumstemperatur.
8. Tvätta plattan tre gånger med 100 | il platta tvättlösning, som lämnar lösningen på plattan under 5 minuter varje gång. Sond plattan över natten i mörker vid 4 ° C med 50 | il fluorescent-märkt sekundär antikropp utspädd 1000-faldigt i blocklösning kompletterad med 2 | iM av kromatin-specifik DNA-färgämne Bisbenzimide. Tvätta plattan tre gånger såsom tidigare och lagra förseglas under 100 | j, l PBS i mörker vid 4 ° C. Bild plattan inom två veckor.

2. Imaging och Bildsegmente

1. Använd en konfokala eller spinning-disk fluorescensmikroskop med en 20X mål att ta separat 16-bitars, gråskala TIFF-bilder i tre kanaler som motsvarar DNA färgämnet, GFP och immunfärgnings fluoroforer. Fånga många icke-överlappande bilduppsättningar, som här kallas ramar, till bilden ungefär 1000-2000 celler per brunn.
2. Namnge bildfiler systematiskt så att varje filnamn är en unik kombination av "experiment namnet", "väl adress", "ramnummer" och "kanalidentifierare", i denna ordning (Figur 3). Den inställda exempeldata använder "Blue" (kromatin DNA färgning) eller "grönt" (GFP) eller "Röd" (den immun färgade fluoroforen) som kanal identifierare. Den väl adress, ramnummer och kanalidentifieraren är vidare på kallad bildens metadata. Använd understreck symbol för att undvika förvirrande väl och ram metadata.
3. Namnge filerna med dessa metadataelementen i den angivna ordningen. Detta är nödvändigt för att säkerställa att de efterföljande programsteg Correctly grupp uppsättningar bilder för analys.
4. Ladda ner och installera freeware Cell Profiler, Active Perl Community Edition, R miljö statistisk programmering och RStudio. Acceptera alla standardalternativ under installationen; PC-användare installerar Active Perl ger möjlighet för alla alternativ som rör PATH, filändelsen förening och manus kartläggning där du blir tillfrågad. Active Perl är frivilligt för Mac-användare, men de annars kommer att behöva köra Perl-skript i steg 3.2 från Terminal kommandoraden istället för att använda ikonen klicka.
5. Öppna Cell Profiler programvara, klicka på "File", "Importera Pipeline" sedan "Från fil" och välj filen 3_channels_pipeline.cppipe (Siffror S1A & S1B). Filen innehåller instruktioner som är nödvändiga för programvaran att tolka bildfil metadata från filnamnskonvention beskrivs. Cell Profiler avser nu bilderna, utdrag nukleärt DNA och intensiteter antikropps från these och använder GFP kanalen för att beräkna förhållandet mellan nukleär kontra cytoplasma intensiteten för varje cell detekteras (fig 4 & 5).
6. Klicka på "Inställningar Se utgångs kallade knappen i det nedre vänstra hörnet av Cell Profiler fönstret. På toppen av den nya skärmen är textrutor märkta "Default Input Folder" och "Default Output Folder". En i taget, klicka på mapp-ikonerna till höger om dessa rutor och markera platsen för bildfiler för analys och destinationen för de extraherade data, respektive (Figur S1C).
7. Börja bildanalysen genom att trycka på "Analysera Images knappen i det nedre vänstra hörnet av Cell Profiler. Längst ner på skärmen observera återstående tid för datautvinning, den "Stoppa Analysis" och "Paus" knapparna. Om det behövs en paus i analysen genom att välja "Paus" knappen när som helst, vilket är användbartnär du tittar på bilderna som analyseras (beskrivs i steg 2,8).
8. Eventuellt öppna fönstren för någon av bildanalys steg genom att klicka på ögon ikonerna i panelen på den yttersta vänster av programfönstret (figur S1D). Observera "IdentifyPrimaryObjects" fönstret och de för "Sekundära" och "tertiära Objects för att kontrollera att de aktuella inställningarna i Cell Profiler för att utföra bildsegmente är lämpliga (se figur 1 och diskussion för råd om att ändra dessa inställningar).
9. Klicka på "OK" i meddelanderutan som visas när analysen är klar. Gå till platsen "Default Output Folder" där alla datafiler med resultaten sparas som kommaseparerade-värde (.csv) filer (Figur S2A).

3. Dataextrahera

1. Hitta den nya filen "Nuclei.csv", som ingår bland deutdata från Cellinformation. Den här filen innehåller enskilda celldata för fluorescerande nukleär antikropp intensitet, kärn-DNA intensitet och GFP-CDK2 reporter kvotvärden (figur 6A & S2a).
   OBS: Olika laboratorier kommer att vilja behandla denna typ av data för att passa den typ av sina egna analyser. Föreslås för det aktuella uppgifterna är gating av celler från varje behandlingstillstånd enligt de uppgifter antikropps och GFP-CDK2 reporter värden med hjälp av den medföljande Perl script '2_gate_classifier.pl ".
2. Kopiera förutsatt Perl skriptfilen "2_gate_classifier.pl" i samma mapp som den "Nuclei.csv" datafil (Figur S2A). Dubbelklicka på ikonen för Perl-skript och, när du uppmanas, skriver det fullständiga namnet på datafilen följt av ett ".csv" filnamn namn för filen i vilken cellerna ska gated och slutligen grind värden för antikroppfluorescens och GFP-CDK2 reporter uppgifter.
   OBS: Hur man huvudsakligen avgör gate inställningar och använda dessa för analys av data diskuteras nedan i Representant Data sektionen och figur 6 (för att analysera data tillhandahålls användning "0,004" och "1.5", respektive). Mac-användare bör köra Perl-skript från Terminal kommandoraden genom att skriva: "perl 2_gate_classifier.pl".
3. Observera den nyskapade filen som kombinerar de råa enskilda cellanalysvärden från de ursprungliga Cell Profiler data med underbefolknings etiketter som visar hur varje cell från varje brunn utför mot både grindar (figur 6C).
4. Plotta data för varje experimentell tillstånd att använda de individuella cell subpopulation etiketter genom att öppna RStudio programvaran. Klicka på "File" och "Öppna fil", välj sedan den medföljande "analysis.r" fil. Observera kommandona för att rita figurer 6B, 8 i det övre vänstra fönstret i RStudio (Figur S2B). I det övre vänstra fönstret, mellan de dubbla citationstecken symboler på linjerna 5 och 6, skriver datoradress för den mapp som innehåller de gated uppgifterna. Inkludera enhetsbeteckningen och namnet på själva filen, respektive (t.ex. "C: / mappAnalys / analys output" och "nuclei_gated.csv").
   OBS: Om RStudio används för första gången på en viss dator, kommer R grafikpaketet "ggplot2" måste installeras först. Detta är en endast en gång steg för en ny installation av RStudio, varefter detta steg blir överflödig. För att installera "ggplot2", klicka på fliken som heter "paket" ovanför fönstret i det nedre högra hörnet av RStudio, klicka på knappen "Installera paket" knappen som visas nedanför detta. Ett nytt fönster kommer att visas. Skriv "ggplot2" (utan citat) i "Paket stakten i denna nya fönster och slutligen klicka på "Install" för att stänga fönstret, installera nödvändiga ggplot2 funktionerna och återgå till huvud RStudio fönster för att fortsätta från steg 3.6.
5. Markera raderna 1 till 17 i det övre vänstra fönstret i RStudio, klicka sedan på "Kör" knappen. Detta kommer att gå in experimentella data, tröskelvärden och väl platsinformation till R (Figur S2C). R kommer nu tillfälligt hålla relevanta data för plottning.
6. Markera enskilda block av den återstående koden nedanför linjen 17 och skapa motsvarande tomter genom att klicka på "Kör" knappen som tidigare. Observera tomter i fönstret i det nedre högra hörnet av RStudio och spara antal format genom att klicka på "Exportera" -knappen (Figur S2D).
7. Medan stängning RStudio, klicka på "Spara inte" när du ombeds. Detta förhindrar förvirring på nästa användning av RStudio, som annars kommer att hålla uppgifterfrån föregående session.

Representative Results

Exemplet uppsättning bilder som genereras med hjälp av omvänd transfektion siRNA screening protokoll har förberetts för och analyseras med hjälp Cell Profiler programvara. Det resulte numeriska rådata är sådan att varje cell är individuellt representerade, spåras tillbaka till sin image och väl om ursprung och mätt i flera fluorescensintensitet parametrar (Figur 6A). För varje cell som identifierats medelvärdet nukleär fluorescens intensiteten för P-S780 RB1 antikropp och den integrerade DNA intensiteten för de DNA dye-definierade nukleära masker bestäms. Genomsnittlig GFP intensitetsvärden för kärnan och cytoplasman regionerna i varje cell registreras också tillåter beräkning av kärn kontra cytoplasmatisk fluorescens av GFP-CDK2 reporter. Nedströms av dessa algoritm fluorescens intensitetsmätningar använder sig av dessa individuella celldata för att definiera portarna för två analyser, nukleär färgning antikropp och GFP-CDK2 reporter. Efterföljande annotering av cellerna på the grundval av analysresultatet och användning av dessa etiketter för att göra det möjligt för specifika subpopulationer ska präglas vidare av en tredje mätning (nukleär DNA-innehåll) beskrivs.

Histogram diagram över intensitetsdata rå fluorescens samlats för varje analys är ett effektivt sätt att bedöma hur cellsubpopulationer beter sig i olika förhållanden. Histogrammen i figur 6B visar befolkningsfördelningar av enskilda celldata från tre brunnar för varje RNAi knockdown skick. Till vänster är de data för nukleär antikropp intensitet och till höger är motsvarande uppgifter för GFP-CDK2 reporter. Den RB1 antikroppsuppgifter P-S780 avslöjar att cellerna finns i stort sett i två populationer med avseende på denna post-translationell modifiering och att cellpopulationer med förlust av RB1 fosforyleras på S780 kan urskiljas som en vänstertopp av kärn intensitet som är berikad när CDK6 slås ned av siRNA. Samma vänstra toppses när RB1 själv är RNAi målet, vilket återspeglar den direkt avlägsnande av proteinet och därigenom P-S780 RB1 färgning. Däremot samma försöksbetingelser för samma celler, när de observeras via GFP-CDK2 reporter analys, visar en annan dynamik i de enskilda celldata. En kontinuerlig fördelning observeras, med endast en enda topp, men siRNA som stör cellcykeln (siCDK6) och orsakar ackumulering i G1-fas resulterar i en förlängning av den högra axeln på att distributionen (dvs indikerar förbättrad närvaro av celler som visar en öka inom kärnkrafts / cytoplasman GFP-förhållande, plottas på X-axeln).

Dessutom visas på histogrammen i figur 6B är grindvärden (vertikala staplar) som väljs på grundval av de fördelningar av båda uppsättningarna analysuppgifter. Regeln används för RB1 antikroppsuppgifter P-S780 är att definiera grinden position som halvhöjd: max bredd position på vänster axel av huvud(Höger) topp när man överväger de negativa kontrollcelldata (icke-inriktning siRNA). Data markerade rött är celler med nedsatt och frånvarande P-S780 RB1, som identifieras med denna port. En liknande grind placerad på motsatt axel av förhållandet värdeöverföring används för GFP-CDK2 reporter. De resulte hög ratio subpopulation celler, som saknar eller funktion reducerad CDK2 aktivitet, visas i grönt. För att illustrera multiplex analys av de två analyserna Figur 6C visar genomförandet av båda grind värden med hjälp av 2_gate_classifier.pl perl script för att omvandla rådata (Figur 6A) i den kommenterade filen nedan. Denna nya filen innehåller originaldata tillsammans en ny kolumn av klass etiketter för varje cell och de två grindvärden som används för att skilja dem (i detta fall portar 0,004 för data antikropp och 1,5 för GFP-CDK2 reporter användes, respektive) .

Efter att ha klassificerat de enskilda cellerna from varje knockdown tillstånd på grundval av de två analyserna är det nu möjligt att använda dessa klass etiketter för att bistå annotering av plottar av analysuppgifter. Figur 7 visar spridningsdiagram för de enskilda celldata för P-S780 RB1 och GFP- CDK2 analyser från de exempeldata som fastställts för samtliga tre RNAi villkor. Siffror Kommentera kvadranterna på scatterplots visar de relativa procentandelar av varje gated subpopulation till hela för att knockdown sammanhang och genereras i R med hjälp av klassetiketter som beskrivs ovan. Dessa kurvor visar att, jämfört med celler transfekterade med icke-inriktning siRNA (fig 7B), celler som transfekterats med siCDK6 avslöjar en nettouppgifter fördelning skiftas både nedåt på Y-axeln (som indikerar frånvaro av RB1 fosforylering vid serin 780) och till höger På X-axeln (som indikerar låg CDK2 aktivitet figur 7C). Båda dessa förändringar väntas för knockdown av detta mål. I motsats till detta, data från SIRB1 transfekterade celler (figur 7A) visar en förlust på färgningsantikroppen i linje med förlust av epitop, men liten effekt i distributionsuppgifter för CDK2 reportern jämfört med kontroller transfekterade med icke-inriktning siRNA, vilket tyder ingen större effekt på GFP -CDK2 reporter uppstår från RB1 knockdown.

För att ytterligare undersöka användningen av enskilda celldata subpopulation klassificering och analys multiplexering Figur 8 visar punktdiagram för siCDK6 data från figur 7C tillsammans parade histogram profiler för integrerad DNA intensitet. Paren av histogram avser motsatta halvor av hela befolkningen, uppdelat på grundval av antingen antikroppsintensitet (till höger i spridningsdiagram) eller GFP-CDK2 reporter kvotvärden (ovanför spridningsdiagram). Kvantifiering av nukleär DNA intensitet för dessa populationer visar två toppar som är karaktäristiska för 2N och 4N DNA-innehåll som vänster och höger toppar, respektive. Inom intentions av grindarna som visas i figurerna 6, 7 och 8 är sådana att celler identifierats som låg för P-S780 RB1 (märkt: P-S780-) eller med ett högt förhållande värde från GFP-CDK2 reporter (märkt: G1) kommer vara i G1-fasen av cellcykeln. Faktum är att DNA-profil histogram för subpopulationer identifieras med någon av dessa analyser innehåller övervägande celler med 2N DNA-innehåll. DNA-profiler av den motsatt gated populationen (märkt: P-S780 + eller icke-G1) innehåller celler med distributioner som sträcker sig från 2 N till 4N, i linje med sådana celler utsträckning en rad cellcykeln positionerar post G1-fasen.

Även om fokus här har varit generering och analys av enskilda celldata från fluorescerande färgade bilder, är det också bra att kunna ta dessa uppgifter och sammanfatta varje analys på en väl genom brunnar basis för att övervaka variationer mellan replikat och prestanda av alla brunnar för en given analys över en hel platta av data. A) RB1 uppgifter och B P-S780) GFP-CDK2 reporter uppgifter. De värden plottas i A och B är producerad av två ytterligare Perl-skript som medföljer detta manuskript; 'Antibody_fluorescence_summary.pl "och" G1assay_summary.pl', respektive. Dessa skript använder rådata som skapats av Cell Profiler (Nuclei.csv) och rapportdata per samt i) totala celler mätt per brunn, ii) antal celler i porten, iii) procent celler i grinden och iv) det aritmetiska medelvärdet av de uppmätta, rådata för det också. Detta ingår som ett alternativ som lämpar sig för att titta över stora uppsättningar analysuppgifter, innan fokus på individuella behandlings data med hjälp av multiplex bedömning av enskilda celldata som visas i 8. Diagrammen visas här tomten "iii) procent celler i porten" för båda analyserna, som passar de icke-normala uppgifter fördel sett för P-S780 RB1 och GFP-CDK2 data i histogrammen i figur 6B. Dessa skript beräknar även "iv) det aritmetiska medelvärdet av de uppmätta, rådata för att väl", vilket skulle passa analys av data för homogena befolknings svar och normalfördelning uppgifter före och efter experimentell störnings.

Figur 1:. Översikt över stegen i arbetsflödet för att kvantitativt analysera fluorescerande mikroskop bilddata Arbetsflödet representeras här som fyra steg (A) Först är det nödvändigt att experimentellt förbereda celler för fluorescerande avbildning.. Exemplet som beskrivs här är att i envisas och där siRNA behandlade adherenta humana tumörceller odlas under 48 timmar, fixeras och färgas på en 96-brunnars vävnadsodlingsplatta. Olika RNAi råder även i tre exemplar i separata brunnar inom plattan. Celler färgades med ett DNA-färgämne, en antikropp specifik för RB1 fosforylerades på CDK4 och 6 selektiv målställe Serin-780 (P-S780 RB1) och de också stabilt uttrycker en GFP-CDK2-reporter, rapportering G1 cellcykel avsluta. Kollektivt dessa fluorescerande prober utgör två analyser separat bedömts inom arbetsflödet. (B) Parallella mikroskop bilder för varje fluorescerande sond (kanal) genereras och namnges sådan att innehålla uppgifter genom vilka bildanalys programvara kan organisera data. (C) Den bildfiler laddas in i cell Profiler programvara, som algoritm identifierar enskilda celler och tillhörande par av kärnor och cytoplasma innan ger intensitetsmätningar för de tre fluorescerande prober detekterared i varje. (D) Slutligen är en Perl-skript används för att organisera de råa kvantitativa data som produceras. Det här steget gäller portarna till fluorescensintensiteten data för varje cell, effektivt binning cellerna i delpopulationer, vilket kan ritas, spåras och korsförhör. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Experimentella data som ska erhållas genom bildanalys De fasta, siRNA-behandlade, fluorescerande celler från exempeldata som avbildades och motsvarande mått intensitets tas per cell.. Representativa bilddata visas för varje parameter som registrerats under bildanalys (A) Kärn DNA intensitet:. Intensiteten för färgning av kärn-DNA-färgämne används för att ge ett mått på DNA per kärna (B) Kärn intensitet fosfor-RB1:. Immuno-färgning specifik för P-S780 RB1 använder en primär (svart) antikropp och fluorescerande taggade sekundär antikropp (röd) möjliggör en intensitetsmätning RB1 fosforylering på . S780 per kärna (C) GFP-CDK2 reporter: De celler som används stabilt uttrycker en GFP-märkt reporterprotein som translokerar mellan kärnan och cytoplasman i en uppsättning mönster med cellcykeln. Dubbla mätningar av den parade nukleär och cytoplasmisk GFP intensitet för varje cell kan man beräkna ett förhållande per cell som kan användas för att särskilja G1-fasen från resten av cellcykeln. Tre siRNA mål kommer att användas för att illustrera analysen; en icke-inriktning negativ kontroll siRNA; CDK6 siRNA som en positiv kontroll i störande RB1 fosforylering och cellcykel framsteg; RB1 siRNA etablera antikroppspecificitet.k "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Organisation av bildfiler före bildanalys Bilderna tagna från vävnadsodlingsplatta namnges systematiskt så att bilden analysprogram att relatera bilddata tillbaka till den ursprungliga experimentella sammanhang.. Denna information är placerad inom filnamnet för varje bild. (A) Eftersom varje brunn på experimentet plattan kan motsvara olika RNAi mål eller behandlingar, brunnen adress utgör en del av filnamnet. (B) ramnumret är en del av filnamnet . som varje brunn avbildas att samla flera, icke överlappande ramar (C) är fluorescerande prober från varje ram avbildas separat; Följaktligen filnamnen måste också avspegla vilken kanal varje bild avser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4:. Användning av Cell Profiler för att mäta nukleärt DNA och antikroppar färgning Med inställningarna i förutsatt pipeline filen (3_channels_pipeline.cppipe), de Cell Profiler bildanalysmjukvaruåtgärder fluorescensintensitetsvärden för nukleärt DNA och antikroppsbindande rör enskilda celler . (A) Kärnor identifieras i "blå" kanal bild av färgade DNA. (B) < / Strong> Positionerna för DNA färgade kärnor innehas tillfälligt i en "Nuclei mask". Kärnorna masken sedan överlagras på (C) de blå och röda kanal bilder (DNA och antikropps fluorescens uppgifter, respektive) och fluorescensvärdena från bildsegment som överlappar med masken registreras mot varje identifierad cell. Framgångsrik identifiering av separata, grann kärnor kan visuellt bedömas utseendet på Nuclei masken. För illustration, visas inringat i denna mask bild, är exempel där de valda inställningarna för algoritmen har mis-identifierade grann kärnor som en enda kärna. Justera inställningarna algoritmen för att minimera dessa händelser införs i diskussionsavsnittet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

/ftp_upload/51882/51882fig5highres.jpg "/>
Figur 5: Användning av Cell Profiler för att mäta nukleära och cytoplasmatiska GFP intensitet GFP-tagged CDK2 reporter translokerar mellan kärnan och cytoplasman i relation till cellcykelpositionen hos cellerna.. Samtidigt som Cell Profiler beräknar DNA och antikropps nukleära intensiteter per cell (Figur 4), beräknar den också kärnkrafts till cytoplasman förhållande av GFP intensiteter för varje cell. (A) Uppgifterna DNA dye för varje bild används för att generera en Nuclei mask. (B) Cell Profiler använder Kärnor mask i samband med GFP bilden från GFP-CDK2 reporter på utsäde positionen för varje cell och sedan expanderar till varje cell omkrets för att uppskatta hela fotavtryck i varje cell. Detta blir en ny, "Cell mask". (C) Den kärnor masken subtraheras från cellmasken för att ge en donut-liknande serie av cytoplasma konturer, vilka blirden "Cytoplasma masken". (D) Den kärnor mask och cytoplasma mask används av Cell Profiler för att mäta par av nukleära och cytoplasmatiska GFP värden. Dessa parade värden används sedan av Cell Profiler för att beräkna nyckeltal, som informerar om varje cell position i cellcykeln. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6:. Datautvinning - Bearbetning rå individuella celldata genom att införa grindar på analysvärden Biologiska trender från de enskilda celldata för färgning antikropp och GFP-CDK2 reporter analyser utvinns med hjälp av gated uppgifter. Histogram av rådata möjliggör identifiering av lämpliga grindvärden. Dessa är sedan införde ett Perl-skript. (A)slutprodukten att analysera bildfiler med de medföljande inställningar för Cell Profiler är kommaseparerade värde (.csv) filer. Dessa filer c ontain enskilda cell uppgifter om var och en av de olika undercellulära segment. Filen "Nuclei.csv" innehåller alla valda mätningar i samband med användningen av Nuclei masken. Dessa mätningar omfattar nukleär antikropp intensitet, nukleärt DNA intensitet och GFP förhållandet (kärna / cytoplasma). (B) Histogram av kärnantikroppsintensitet (vänster) och GFP-CDK2 reporter förhållanden (höger) ritas från enskilda celldata för varje siRNA knockdown skick . Staplarna på de visade histogrammen visar de önskade positionerna gate för dessa analyser. Färgade uppgifter om histogrammen anger gated subpopulationer. (C) Grindarna för de två analyserna visas i B gäller till rådata med Perl script '2_gate_classifier.pl ". Skriptetskapar en modifierad kopia av original Cell Profiler utgång (Nuclei.csv) fil att bistå efterföljande plottning. De två grind värdena registreras i den nya filen (markerad i färg här) och en ny "Label" kolumnen läggs. Den etiketter bin varje cell i en av fyra möjliga undergrupper baserade på de två gated analysvärden för varje cell. Dessa etiketter används i efterföljande tomter som funktionen beräkningar av bidragen från varje delpopulation samt korsvis hänvisning av ytterligare parametrar som genereras i Cell Profiler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7:. Spridningsdiagram för varje siRNA tillstånd föreställande rådata för enskilda celler och portpositioner Scatter tomter av indidubbla celldata från alla bilder för siRNA villkor som anges: (A) siRB1; (B) Sinon inriktning negativ kontroll, (C) siCDK6. Avsatt mot Y-axlarna är värden av kärn fluorescens från anti-P-S780 RB1 färgning. Avsatt mot X-axeln visar motsvarande kvotvärden beräknade från GFP-CDK2 reporter. De röda och gröna staplar visar positionerna för portarna för P-S780 RB1 grind och GFP-CDK2 reporter grindar, respektive. De två grindar dela cellerna i fyra subpopulationer och siffrorna över de resulterande kvadranter är den procentuella antalet celler från var och en av dessa. Anteckningar kring axlarna för A ange de fyra möjliga märkningselement tillämpas på varje cell av 2_gate_classifier.pl Perl-skript. Dessa etiketter visas i förhållande till deras respektive analys gate och används i R-script (analysis.r) för att generera tomter i figurerna 6, 7 och klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8: Cell subgrupper definierade av de två G1 transit analyser visar 2N och 4N DNA-profiler i linje med analysresultatet Spridningen tomt på data för de siCDK6 cellerna upprepas från figur 7C.. Runt punktdiagram är histogram för integrerad nukleärt DNA intensitet rör grupper av befolkningen. De ovan spridningsdiagram avser GFP-CDK2 reporter analys. De till höger om spridningsdiagram avser kärn- fosfo-RB1 mätningar antikropp enbart. De färgade grindlinjerna utvidgas att visa sin relation till histogrammen. Gate etiketter med vilka celldata valdes ut för dessa ytterligare tomter visas också. Celler med förlust av RB1 fosforyleras på serin 780 (P-S780-) eller de med en hög GFP-CDK2 reporter nukleär cytoplasma förhållandet (som indikerar låg CDK2 aktivitet) visar övervägande 2N-liknande DNA-profiler, medan deras motsatta motsvarigheter för respektive analys visar en fördelning av 2N och 4N, karakteristisk för en blandad, post-G1 fasen population av celler. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Figur 9: Sammanfattning tomter av gated analysvärden för varje siRNA skick tomter av gated (A) P-S780 RB1 data och (B) GFP-CDK2 data från tre brunnar för varje siRNA knockdown skick sammanfattningsdata.. Värdena beräknades från den råa Cell Profiler utgång (Nuclei.csv) med användning avPerl-skript, "antibody_fluorescence_summary.pl" (A) eller "G1assay_summary.pl" (B). Värdena uppritade är hjälp av procent celler i porten appliceras på varje analys. Staplar indikerar standardfel beräknade från triplikatbrunnar. Oparade, homoscedastic T-Test P-värden för varje knockdown tillstånd jämfört med icke-inriktning siRNA visas ovanför plottade data där P <0,001 (**) och P <0,05 (*). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur S1. Ställa in Cell Profiler mjukvara för bildanalys. (A) Skärmdump av Cell Profiler innan några inställningar bildanalys bokförs. (B) Skärmdump av Cell Profiler efter algoritmen uppgifterna i "3_channels_pipeline.cppipe" har laddats. Den höga tände fliken i övre vänstra hörnet visar att denna bild visar parametrarna för "LoadImages" skede av analysen. Genom att klicka på de andra delarna av listan nedan detta kommer att avslöja detaljerna för de efterföljande stegen i analysen. (C) Skärmdump av Cell Profiler med information för Input Folder och Output Folder in. (D) Skärmdump av Cell Profiler efter "Analyze bilder "knappen har klickat för att börja analysen. Lagrad är tre nya fönster illustrerar algoritm producerade masker som genereras av programvaran från bilderna som analyseras. Dessa fönster är åtkomliga genom att klicka på "öga" ikoner till öppet läge intill de relevanta stegen i analysen, i det övre vänstra hörnet av huvud Cell Profiler fönster. Dessa åsikter hjälper användaren att kontrollera om inställningarna genererar de konfetti färgade masker överens med de medföljande, original, gråskala uppgifter.

ent "> Figur S2. Användning av Perl och RStudio till gate individuella celldata och plotta de resulte cellsubpopulationer. (A) Den högra panelen visar den mapp som valts för att ta emot utdata .csv filer (gröna ikoner) från Cell Profiler analysen. De Perl-skript som med manuskriptet (blå ikoner) kopieras till denna mapp. Markerad är "2_gate_classifier.pl" Perl-skript, vilket har varit dubbelklickar med musen för att producera den dialogruta i den vänstra panelen. Visas är uppmaningar och motsvarande skrivit svar som behövs för att grinden de enskilda celldata från "Nuclei.csv" fil. (B) Skärmdump av RStudio omedelbart efter laddning av "analysis.R" manus. Markerad är kommandona för att ladda upp gated data från A till programvaran innan konspirera (notera detaljer i linjerna 5 och 6 kommer att behöva justeras beroende på var gated uppgifter ligger på computer används för analys). (C) Skärmdump av RStudio gång data har laddats upp. (D) Skärmdump av RStudio visar belyste block av kod som krävs för att producera tomten som visas i det nedre högra fönstret. Koder för varje tomt är åtskilda av tomma rader och grupperas efter typ av tomten.

siRNA mål	Plate väl adresser
Icke-inriktning (NT)	E5, F5, G5
Retinoblastom (RB)	E7, F7, G7
Cyklin beroende kinas 6 (CDK6)	B2, C2, D2

Tabell 1: Tja adresser och motsvarande siRNA villkor som används i exempeldata som.

Discussion

Arbetsflödet beskrivs utgör ett förfarande för flerkälls perturbance av celler genom att använda siRNA, efterföljande markör upptäckt och äntligen använda av en serie mjukvarustödda åtgärder för att underlätta utvinning av kvantitativa data från de resulterande fluorescerande mikroskopiska bilder. Ansatsen är inriktad på leverans av nukleära och cytoplasmiska intensitetsvärden för enskilda celler, som har bred praktisk tillämpning i många cellbaserade applikationer. De exempeldata som används här genererades i en siRNA skärminställning där två fluorescerande analyser för G1 fas cellcykelns transitering testas och korrelerade tillbaka till en mer direkt biofysiska mått på kärn DNA-innehåll.

Användningen av ett fluorescerande DNA fläck till bilden kärn-DNA är ett nödvändigt steg i bildsegmente processen eftersom det möjliggör identifiering av enskilda celler och den resulterande "Nuclei mask" tjänar som utgångspunkt för att identifiera motsvarande cytoplasmiC-regioner. GFP-tagged CDK2 reporter, som stabilt uttrycks i cellerna, ger en variabel ännu genomgående högre än bakgrundssignalen i cytoplasman genom vilket detta fack kan avgränsas. Samma pipeline analys bör vara tillämplig på analys av proteintransloka händelser med hjälp av andra lämpliga fluorescens bundna reportrar och deras svar på perturbance. Dessutom skulle substituera GFP-CDK2-reporter med cytoplasma specifika fluorescerande färgämnen tillåta alternativ användning av denna algoritm för att mäta dimensionerna av cytoplasma och de relativa storlekarna för cellerna i bilderna.

En annan utformning övervägande i bildsegmentestrategi som beskrivs här är att använda Cell Profiler för att leverera integrerade intensitetsvärden för DNA kvantifiering. Integration av intensiteten värden för nukleärt DNA färgnings uppgifter möjliggör möjliga variationer i nucleus storlek, och representerar en nära match för kvantifiering profilerna settför propidiumjodid målat FACS data. Dock kan integrerade intensiteten inte ge ett lämpligt medel för att bedöma proteinfunktion där den genomsnittliga koncentrationen, exemplifierad av medelintensitet antigen fluorescens, är mer biologiskt relevant än den integrerade totala mängden protein (och tillhörande fluorescens) inom en cell fack. Därför menar intensitetsvärden användes för P-S780 RB1 och GFP uppgifter. Alternativet att ändra mellan de två lägena (betyder eller integrerad) data bedömning finns på "ExportToSpreadsheet" panel Cell Profiler programvara.

Inställningarna analys i 3_channels_pipeline.cppipe filen är optimerade för bilderna i uppsättningen exempeldata. Analys av nya bilder set med detta protokoll kommer att kräva att filnamnen antar namnkonventionen som beskrivs ovan (Figur 3). Dessutom värderar känslighet för att passa ljusstyrka nukleärt DNA färgning och trösklar för bakgrundintensiteter i de nya bilduppsättningar kan behöva justeras inom Cell Profiler inställningar. Med tanke på den nyckelroll DNA färgning håller för att bygga de olika bildsegmente masker, är tillämpningen av korrekta känslighetsinställningar för den här kanalen nyckeln till en framgångsrik analys av nya bilddata med Cell Profiler programvara. Den tillhandahålls Cell Profiler inställningsfil (3_channels_pipeline.cppipe) innehåller anteckningar om de oftast användbara parametrar för att anpassa analysen till nya uppgifter. Dessa anteckningar är i textrutan längst upp på skärmen i Cell Profiler i huvudfönstret och inkludera riktlinjer om att ändra känslighetsinställningar och justera antalet kanaler som ska analyseras. Som åtalade i protokoll avsnitt 2.8, för att testa inställningarna för nya bilddata kan det vara nödvändigt att observera bildsegmente under bildanalys genom att klicka öppna de "ögon" ikoner för varje "Identifiera ... Objekt" protokollsteg (figur S1D

Den råa produktionen av enskilda celldata från Cell Profiler kan analyseras på olika sätt för att passa behoven hos andra studier. Visas här är användningen av ett Perl-skript för att tillämpa portarna till två av de parametrar som mäts per cell för att bistå utvinna biologiska trender från data ettd tillstånd samkörning av de identifierade subpopulationer med ytterligare mätningar. Även om det är lika möjligt att inkludera delar av grind inom ramen för Cell Profiler, den alternativa rutten används här ger större flexibilitet och snabbhet, speciellt om stora datamängder behöver bedömas. Den långsammaste steget i efterbildförvärvsfaser nuvarande protokollet är driften av Cell Profiler programvara. Cell Profiler här drivs utan införande grindar för att alstra en un-gated rådatauppsättning, som kan omanalyseras med den efterföljande Perlskript snabbare och, om så behövs, iterativt med olika grind värden. Inte alla studier vet i förväg lämpliga grind värden som kan variera med reagenser på en viss uppsättning data, och potentiellt över tiden. Det är därför rekommenderat att generera histogram som visar rådata fördelningen erhållits från Cell Profiler för positiva kontroller och mock-störda celler i syfte att identifiera lämpliga gate values för parametrarna av intresse.

De Perl-skript är skrivna för att acceptera en fast definierad kolumnstruktur av data från Cell Profiler och kan sluta fungera om en användare ändrar antalet parametrar produktionen med Cell Profiler hjälp av "ExportToSpreadsheet" inställningar. Att bidra till att genomföra ändringar av inställningarna noterna inkluderas inom Perl skriptfiler. För att se dessa läser manuset i en textredigerare, företrädesvis en programmerare textredigerare inställd på färgkod Perl element (t.ex. http://www.activestate.com/komodo-edit). Dessa anteckningar anger var att justera skript för att anpassa sig till förändringar i dataformat. I likhet med Perl-skript, R-kod fil tillhandahålls (analysis.r), innehåller instruktioner för att rita siffrorna från dataanalys bilden, kan läsas i en textredigerare eller RStudio programvara för att se ytterligare anteckningar om användning och anpassning. Dessa anteckningar kan kompletteras med information om reguljära uttryck och Perl <sup> 12 och ggplot2 ¹³ paket för R, som båda ligger till grund för hur data läses, kommenterad och ritas, respektive.

Nya studier med fluorescensmikroskopi samt rådata som deponerats hos öppen källkod publikationer är mottagliga för analysmetoder såsom de som beskrivs här. Själva karaktären av hög halt uppgifter lämpar sig för rekursiva analys med olika analytiska inriktningar beroende på forskningsintressen given observatör. Även de frågor som kan ställas på de uppgifter som begränsas av proberna ursprungligen använts, bilddata kan ofta menings omanalyseras utanför ramen för de studier som genererade dem.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AllStars negative control siRNA	Qiagen	1027280	Negative control siRNA.
CDK6 siRNA	Dharmacon/ Custom synthesis	NA	Antisense sequence: 5' CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU
RB1 siRNA	Dharmacon/ Custom synthesis	NA	Antisense sequence: 5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT
5x siRNA buffer	Thermo Scientific	B-002000-UB-100	To be diluted with nuclease-free, non-DEPC treated water.
Nulcease-free water (non-DEPC)	Applied Biosystems	AM9937	For dilution of siRNA buffer.
Hiperfect	Qiagen	301705	Transfection lipid.
DMEM	Life Technologies	41966052	Pyruvate and high-glucose supplemented tissue culture media.
96 well tissue culture plate	Falcon	3072	Plain, 96 well tissue culture plate for the parallel, compartmentalized mixing of transfection complexes.
Packard Viewplate	Perkin Elmer LAS	6005182	96 well TC plate with optical base on which cells are transfected, grown, fixed and eventually imaged. Supplied with opaque, adhesive plate seals, which are used during storage of used plates.
Breathable membrane	Alpha Labs	LW2783	Sterile, gas-permeable, adhesive membrane.
Neutral buffered formalin, 10%	Sigma-Aldrich	HT5012-1CS	10% Formalin (4% formaldehyde) fixative used neat in protocol.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100PC	Non-ionic detergent

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris	Sigma-Aldrich	T1503	Trizma base (tris(hydroxymethyl)aminomethane)
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	For plate wash solution.
Anti-P-S780 RB1 antibody	Abcam	ab32513	Rabbit monoclonal
AlexaFluor647 Anti-rabbit	Invitrogen	A21245	Highly cross-adsorbed, fluorescently labelled secondary antibody.
Hoechst 33342 (Bisbenzimide)	Sigma-Aldrich	B2261	Fluorescent, chromatin-intercalating, DNA dye.
Permeabilization solution	NA	NA	0.1% Triton X-100 in 50 mM Tris-buffered saline, pH 8.0.
Plate wash solution	NA	NA	Tris-buffered saline containing 0.1% Tween-20.
Block solution	NA	NA	5% powdered milk in Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20. For blocking plate prior to immuno-staining and dilution of antibodies.
Cell Profiler 2.1	Broad Institute		http://www.cellprofiler.org/download.shtml
Active Perl Community Edition	ActiveState		http://www.activestate.com/activeperl/downloads
R programming environment	The R Foundation		http://www.r-project.org
Rstudio	Rstudio		http://www.rstudio.com/