Name: Fluxo de trabalho para de alta conteúdo, Quantificação de células individuais de marcadores fluorescentes de Microscópio Universal Data, apoiada pela Open Source Software (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprenda a quantificar marcadores fluorescentes em células individuais usando software de código aberto. Este fluxo de trabalho computacional analisa imagens de microscopia para medir intensidades nucleares e citoplasmáticas.

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Este trabalho foi financiado por doações CRUK 15043 e 14251 CRUK. Agradecemos a Daniel Wetterskog e Ka Kei Ho para a assistência técnica e leitura crítica do manuscrito.

1. Experimental Perturbation e marcação celular para marcadores de resposta (Reverse Transfection siRNA Tela) <ol><li> Num capuz de cultura de tecidos estéril pipeta 70 ul de 200 nM em tampão 1x siRNA siRNA em poços de uma solução estéril, simples placa de 96 poços. Dilui-se a transfecção de lípido em 40 volumes de meio DMEM isento de soro e dispensar 105 ul a cada poço contendo siARN. NOTA: Diluir 262,5 uL de lípido em 10,5 ml de DMEM isento de soro produz uma mistura adequada mestre para um conjunto de placa de 96 poços de siRNA, proporcionando 2,6 uL de lípido por poço. Uso de 200 nM de concentração de siRNA começando neste passo vai entregar uma concentração de trabalho de 20 nM na etapa 1.3, mas procedimentos funcionará para concentrações de trabalho para baixo a 5 nM, com a concentração inicial ajustada em conformidade (isto é, 50 nM). Uma concentração mais baixa de trabalho pode reduzir fora do alvo pontuações falsos positivos, ainda que podem reduzir a magnitude da resposta em-alvo, conduzindo a um aumento do sobre-target taxas de falsos negativos. </li><li> Misture a placa por vibração suave durante dez minutos à temperatura ambiente. Sub-dividir os resultantes 175 ul em três réplicas por 50 ul de destino em, uma cultura de tecido opaco tratada, placa de 96 poços com uma base transparente. </li><li> Transfectar reversa dispensando 8.000 células por poço em 150 ul de DMEM contendo 10% de soro directamente para os complexos lipídicos siRNA 50 ul. Células colorretal humanos Use HCT116 expressam de forma estável um marcador GFP-tagged relatando atividade CDK2 5,8. Nenhuma outra mistura é necessária. Selar a placa com um adesivo membrana respirável estéril para controlar a humidade e evitar &quot;edge efeitos&quot; placa e colocar a placa num incubador humidificado a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 48 horas. </li><li> Aspirar os meios de comunicação de tal modo que uma pequena quantidade residual de media permanece nas cavidades. Fixar as células por adição de 100 ul de formaldeído a 4% tamponado a cada poço e incuba-se em um extractor de fumo durante 10 minutos a sala temperature. </li><li> Remover a solução de fixação a placa de aspiração. Neste ponto, quer interromper a experiência por lavagem da placa três vezes com 100 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e depois armazenam selado, sob 100 ul de PBS no escuro a 4 ° C durante até uma semana, ou continuar com o permeabilização das células. NOTA: Recomendamos placas de processamento, logo que possível após a sua fixação, e, geralmente, prefere armazenamento de placas totalmente transformados. Biocidas conservantes tais como timerosal, azida de sódio, ou alternativas comerciais podem ser adicionados para prevenir o crescimento micoroganismal. A adição de inibidores de fosfatase ajuda a preservar fosfo-epitopos, e outros meios para preservar os estados de modificação de proteína pode ser útil em contextos de ensaio relevantes </li><li> Remova a placa de PBS e permeabilizar as células por adição de 100 ul de solução de permeabilização. Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente sem agitação. Aspirar a solução de permeabilização usando um MultiCHannel pipeta. Repita este passo três vezes. </li><li> Bloquear as células por adição de 100 ul por bloco solução bem durante 30 minutos à temperatura ambiente. Remover a solução de bloqueio por aspiração da placa, então sondar com 50 ul de anticorpo anti RB1 P-S780 diluídas 500 vezes em solução de bloqueio durante 2 horas no escuro à temperatura ambiente. </li><li> Lava-se a placa três vezes com 100 uL de solução de lavagem da placa, deixando a solução sobre a placa durante 5 min de cada vez. Sondar a placa durante a noite no escuro a 4 ° C com 50 ul fluorescentemente marcado com anticorpo secundário diluído 1000 vezes em solução de bloqueio suplementado com 2 uM do corante de ADN específicos de cromatina Bisbenzamida. Lava-se a placa três vezes tal como anteriormente e armazenamento selado, sob 100 ul de PBS no escuro a 4 ° C. Imagem da placa durante duas semanas. </li></ol> 2. Imagem e Segmentação de Imagens <ol><li> Use um microscópio confocal ou fiação de disco de fluorescência com um objetivo 20X tomar separado 16de bits, imagens TIFF escala de cinza em três canais correspondentes ao corante DNA, GFP e fluorophores imuno-coloração. Captura muitos conjuntos de imagens que não se sobrepõem, aqui referida como frames, a imagem aproximadamente 1.000-2.000 células por poço. </li><li> Nomeie os arquivos de imagem de forma sistemática, para que cada nome do arquivo é uma combinação única de &#39;nome da experiência&#39;, &#39;bem endereço&#39;, &#39;número do quadro &quot;e&quot; identificador de canal &quot;, nesta ordem (Figura 3). O conjunto de dados de exemplo usa &quot;Blue&quot; (cromatina coloração DNA) ou &quot;Green&quot; (GFP) ou &quot;Red&quot; (o fluoróforo manchada de imuno) como identificadores de canal. O identificador de endereço bem, número do quadro e canal são mais adiante referido como os metadados da imagem. Use o símbolo de sublinhado para evitar confuso bem e estrutura de metadados. </li><li> Nomeie os arquivos com esses elementos de metadados na ordem especificada. Isto é necessário para assegurar que os passos subsequentes de software corregrupo conjuntos ctly de imagens para análise. </li><li> Baixe e instale o Profiler celular freeware, o Active Perl Community Edition, ambiente de programação estatística R e RStudio. Aceite todas as opções padrão durante a instalação; Usuários de PC instalar o Active Perl deve habilitar todas as opções relacionadas com a PATH, associação de extensão de arquivo e mapeamento de script onde for solicitado. Ativo Perl é opcional para usuários de Mac, mas caso contrário terá de executar o script Perl no passo 3.2 a partir da linha de comando Terminal em vez de usar ícone clicando. </li><li> Abra o software Profiler celular, clique em &quot;Arquivo&quot;, &quot;Importar Pipeline &#39;então&#39; Do arquivo&quot; e selecione o arquivo 3_channels_pipeline.cppipe (Figuras S1A e S1B). O arquivo contém as instruções necessárias para o software para interpretar os metadados do arquivo de imagem a partir da convenção de nome de arquivo descrito. Profiler celular agora relaciona as imagens, extrai DNA nuclear e intensidades de anticorpos a partir de these e utiliza o canal de GFP para calcular a relação de nucleares versus intensidade de citoplasma para cada célula detectados (Figuras 4 &amp; 5). </li><li> Clique no botão &quot;Ver as definições de saída &#39;, no canto inferior esquerdo da janela do Profiler Cell. No topo da nova tela são caixas de texto com a etiqueta &#39;Pasta Padrão de Entrada &quot;e&quot; pasta de saída padrão &quot;. Um de cada vez, clique nos ícones de pasta-à direita dessas caixas e selecione o local dos arquivos de imagem para análise e o destino para os dados extraídos, respectivamente (Figura S1C). </li><li> Comece a análise de imagem, pressionando o botão &#39;analisar imagens&#39;, no canto inferior esquerdo do Profiler Cell. Na parte inferior da tela observar o tempo restante para a extracção de dados, &#39;Stop Análise&#39; e botões de &quot;pausa&quot;. Se necessário interromper a análise por selecção do botão &quot;pausa&quot; a qualquer momento, o que é útilao assistir as imagens que estão sendo analisados ​​(descrito no passo 2.8). </li><li> Opcionalmente, abra as janelas para qualquer uma das etapas de análise de imagem clicando nos ícones de olho-no painel sobre o extremo esquerdo da janela do programa (Figura S1D). Observe a janela &#39;IdentifyPrimaryObjects&#39; e os de &#39;secundários&#39; e &#39;Objects terciária &quot;para verificar se as configurações atuais na Profiler celular para realizar a segmentação de imagens são adequadas (ver Figura 1 e Discussão para aconselhamento sobre como modificar essas configurações). </li><li> Clique em &quot;Ok&quot; na ​​caixa de mensagem que aparece quando a análise for concluída. Vá para o local &#39;pasta de saída padrão &quot;, onde todos os arquivos de dados com os resultados são salvos como separados por vírgula valor (.csv) (Figura S2A). </li></ol> 3. extração de dados <ol><li> Encontre o novo arquivo &#39;Nuclei.csv&#39;, que está incluído entre ossaída do Profiler celular. Este arquivo contém dados de células individuais para fluorescente intensidade anticorpo nuclear, intensidade DNA nuclear e valores da relação repórter GFP-CDK2 (Figuras 6A e S2A). NOTA: Muitos laboratórios vai querer processar este tipo de dados para atender a natureza de seus próprios ensaios. Sugerido para os dados atuais é o gating das células de cada condição de tratamento de acordo com os dados de anticorpos e os valores repórter GFP-CDK2 usando o script Perl fornecida &#39;2_gate_classifier.pl&#39;. </li><li> Copie o arquivo fornecido script Perl &#39;2_gate_classifier.pl&#39; na mesma pasta que o arquivo de dados &#39;Nuclei.csv&#39; (Figura S2A). Clique duas vezes no ícone para o script Perl e, quando solicitado, digite o nome completo do arquivo de dados seguido por um nome filename &#39;.csv&#39; para o arquivo no qual as células devem ser fechado e, finalmente, os valores de porta para o anticorpoe os dados de fluorescência repórter GFP-CDK2. NOTA: Como determinar principalmente definições de selecção e aplicá-las para análise de dados são discutidas abaixo na seção de dados representativos e Figura 6 (para analisar os dados fornecidos uso &#39;0.004&#39; e &#39;1.5&#39;, respectivamente). Usuários de Mac devem executar o script Perl a partir da linha de comando Terminal, escrevendo: &quot;perl 2_gate_classifier.pl &#39;. </li><li> Observe o arquivo recém-criado que combina os valores do ensaio de células individuais matérias a partir dos dados originais Profiler celular com rótulos de sub-populações que mostram como cada célula de cada poço realiza contra as duas portas (Figura 6C). </li><li> Traçar os dados para cada condição experimental utilizando os rótulos subpopulação de células individuais, abrindo o software RStudio. Clique em &quot;Arquivo&quot; e &quot;Abrir Arquivo&quot; e selecione o arquivo fornecido &quot;analysis.r &#39;. Observe os comandos para traçar Figuras 6B, <strong&gt; 7 e 8 na janela superior esquerda da RStudio (Figura S2B). Na janela superior esquerdo, entre os símbolos de aspas duplas nas linhas 5 e 6, digite o endereço do computador da pasta que contém os dados fechados. Inclua a letra de unidade e o nome do arquivo em si, respectivamente (por exemplo, &quot;C: pasta / análise / saída da análise&quot; e &quot;nuclei_gated.csv&quot;). NOTA: Se RStudio é utilizado pela primeira vez num dado computador, o pacote de ilustrações R &#39;ggplot2&#39; terá de ser instalado pela primeira vez. Isto é uma vez só passo para uma nova instalação do RStudio, após o que este passo torna-se redundante. Para instalar &#39;ggplot2&#39;, clique na guia chamado &quot;pacotes&quot; acima da janela no canto inferior direito da RStudio, clique no botão &quot;Instalar Pacotes &#39;que aparece abaixo desta. Uma nova janela irá aparecer. Tipo &#39;ggplot2&#39; (cotações omitindo) para o &#39;Pacotes&#39; sritmo nesta nova janela e, finalmente, clique no botão &quot;Instalar&quot; para fechar a janela, instale as funções ggplot2 necessárias e retornar à janela RStudio principal para continuar a partir do passo 3.6. </li><li> Destacar linhas de 1 a 17 na janela superior esquerda da RStudio, em seguida, clique no botão &quot;Executar&quot;. Isto irá inserir os dados experimentais, limiares e detalhes bem localização em R (Figura S2C). R passou a deter temporariamente os dados relevantes para a plotagem. </li><li> Destaque blocos individuais do código restante sob linha 17 e criar as parcelas correspondentes ao clicar no botão &quot;Run&quot; como antes. Observe as parcelas na janela no canto inferior direito da RStudio e salvar o número de formatos, clicando no botão &quot;Export&quot; (Figura S2D). </li><li> Ao fechar RStudio, clique em &quot;Não Salvar&quot; quando solicitado. Isso evita confusão na próxima uso de RStudio, que de outra forma armazenar dadosda sessão anterior. </li></ol>

<ol><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), 100(2006).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar

O fluxo de trabalho descrito constitui um procedimento para a perturbação de poços múltiplos de células utilizando siRNA, a detecção de marcador subsequente e, finalmente, o uso de uma série de passos suportado por software para facilitar a extracção dos dados quantitativos a partir das imagens de microscopia de fluorescência resultantes. A abordagem é focada na entrega de valores de intensidade nucleares e citoplasmáticos de células individuais, o que tem ampla aplicação prática em muitas aplicações baseadas em células. Os dados exemplo aqui utilizado foi gerado em um ambiente de tela siRNA em que dois ensaios fluorescentes para a fase G1 trânsito ciclo celular são testados e correlacionados de volta para uma medida biofísica mais direta do conteúdo de DNA nuclear. O uso de um corante de ADN fluorescente no DNA nuclear de imagem é uma passo indispensável no processo de segmentação da imagem, uma vez que permite a identificação de células individuais e a &#39;Núcleos máscara&#39; resultante serve como o ponto de partida para identificar correspondente cytoplasmiregiões c. A CDK2 repórter marcado com GFP, que é expresso de forma estável em células, dá uma variável ainda consistentemente mais elevado do que o sinal de fundo no citoplasma, através da qual este compartimento pode ser delineada. O mesmo gasoduto análise deve ser aplicável à análise de eventos de translocação de proteínas utilizando outros repórteres ligados a fluorescência adequadas ea sua resposta à perturbação. Além disso, o repórter GFP, substituindo-CDK2 com corantes fluorescentes específicos do citoplasma permitiria a utilização deste algoritmo alternativo para medir as dimensões do citoplasma e os tamanhos relativos das células nas imagens. Outra consideração de projecto na estratégia de segmentação de imagens descrito aqui é o uso de Profiler celular para fornecer valores de intensidade integrada para a quantificação de ADN. Integração da intensidade de valores para o DNA nuclear de dados de coloração permitir eventuais variações no tamanho do núcleo, e representa uma estreita correspondência para os perfis de quantificação vistospara iodeto de propídio manchado FACS dados. No entanto, a intensidade integrada não podem fornecer um meio adequado para avaliar a função da proteína em que a concentração média, exemplificado por intensidade de fluorescência média de antigénio, é biologicamente mais relevante do que a quantidade total integrado proteína (e fluorescência associada) dentro de um compartimento da célula. Por conseguinte, os valores de intensidade média foram utilizadas para a P-S780 RB1 e dados GFP. A opção de alterar entre os dois modos (média ou integrado) de avaliação de dados é encontrado no painel &#39;ExportToSpreadsheet&#39; do software Profiler Cell. As definições de análise no arquivo 3_channels_pipeline.cppipe são otimizados para as imagens do conjunto dados de exemplo. Análise de novas imagens conjuntos com este protocolo, é necessário que os nomes dos arquivos adotar a convenção de nomenclatura acima descrito (Figura 3). Além disso, valores de sensibilidade para atender o brilho da coloração DNA nuclear e limiares para o fundointensidades nos novos conjuntos de imagens podem ter de ser ajustada dentro das definições Profiler celular. Dado o papel chave a coloração DNA vale para construir as várias máscaras de segmentação de imagem, o aplicativo de configurações de sensibilidade corretas para este canal é a chave para a análise de sucesso de novos dados de imagem com o software Profiler Cell. O arquivo de configurações, desde Profiler Cell (3_channels_pipeline.cppipe) contém notas sobre os parâmetros mais freqüentemente útil para adaptar a análise de novos dados. Estas notas são na caixa de texto na parte superior da tela na janela principal Profiler o celular e incluir orientações sobre como alterar as configurações de sensibilidade e ajustando o número de canais a serem analisados. Como indiciado em Protocol seção 2.8, para testar configurações para novos dados de imagem pode ser necessário observar a segmentação de imagens durante a análise de imagem clicando aberto os ícones &quot;olho&quot; para cada um dos &quot;Identificar ... objetos&quot; etapas do protocolo (Figura S1D </strong&gt;). Em particular, a visualização dos dados da imagem, através de &quot;IdentifyPrimaryOjects &#39;mostra se a máscara Núcleos está correctamente identificado a partir de imagens da coloração do ADN. Na página software Profiler celular para o módulo &#39;IdentifyPrimaryOjects&#39; é o fator de correção de limiar. Ajuste de tentativa e erro desse valor irá corrigir a maioria dos erros de reconhecimento nucleares. Os valores equilibrar o canal de ADN contra a intensidade do fundo para cada imagem. Valores do fator de correção Threshold dobradiça em torno de 1, onde maior do que este é mais rigoroso (bom para imagens claras) e menos do que 1 é branda (adequado para imagens com menos contraste entre a coloração e de fundo). A saída bruta de dados célula individual de Profiler celular pode ser analisado em diferentes maneiras de atender as necessidades de outros estudos. Mostrado aqui, é a utilização de um script Perl para aplicar portas para dois dos parâmetros medidos em cada célula, a fim de ajudar a extrair tendências biológicas a partir de uma a dadosd autorização de referência cruzada das subpopulações identificadas com medidas adicionais. Embora seja igualmente possível incluir elementos de gating no âmbito do Profiler Cell, a rota alternativa utilizada aqui proporciona maior flexibilidade e velocidade, especialmente se grandes conjuntos de dados precisam ser avaliados. O estágio mais lento nas fases de aquisição de pós-imagem do actual protocolo é o funcionamento do software Profiler Cell. Profiler celular aqui é executado sem impor portões para produzir um conjunto de dados brutos fechado-un, que pode ser novamente analisadas com o script Perl subsequente mais rapidamente e, se necessário, de forma iterativa, com diferentes valores de porta. Nem todos os estudos vai saber com antecedência os valores de porta adequados como isso pode variar de acordo com reagentes em um determinado conjunto de dados, e, potencialmente, ao longo do tempo. É, portanto, recomenda-se a gerar histogramas que descrevem a distribuição dos dados obtidos a partir de matéria-Profiler celular para controles positivos e células mock-perturbadas, a fim de identificar valu portão adequadoes para os parâmetros de interesse. Os scripts Perl são escritos para aceitar uma estrutura de colunas rigidamente definido de dados do Profiler celular e pode parar de funcionar se um usuário modifica o número de parâmetros de saída por Profiler celular usando as configurações do &#39;ExportToSpreadsheet&#39;. Para ajudar a implementar a modificação das configurações de notas estão incluídos dentro dos arquivos de script Perl. Para ver estes ler o script em um editor de texto, editor de texto, de preferência de um programador definir a elementos Perl código de cor (por exemplo, http://www.activestate.com/komodo-edit). Estas notas indicam onde para ajustar o script para se adaptar às mudanças no formato de dados. Similar aos scripts Perl, o arquivo R-código fornecido (analysis.r), que contém as instruções para plotar os dados da análise de dados de imagem, pode ser lido em um editor de texto ou software RStudio ver notas adicionais sobre a utilização e adaptação. Estas notas podem ser complementados com informações sobre expressões regulares e Perl &lt;sup&gt; 12 eo pacote ggplot2 13 para R, ambos os quais formam a base de como os dados são lidos, anotado e plotados, respectivamente. Novos estudos utilizando microscopia de fluorescência, bem como dados em bruto depositados com as publicações de origem abertos são passíveis de métodos de análise, tais como as descritas aqui. A própria natureza dos dados de alto conteúdo se presta à análise recursiva com ênfases diferentes analíticas, dependendo dos interesses de qualquer observador de pesquisa. Embora as questões que podem ser feitas dos dados estão limitados pelas sondas usadas originalmente, os dados de imagem muitas vezes pode ser significativamente novamente analisadas para além do âmbito dos estudos que os geraram.

O trabalho aqui apresentado descreve a utilização do software Profiler celular livremente disponível para executar guiada por algoritmo repartição de imagens de microscopia de fluorescência de células aderentes para identificar células individuais e as regiões subcelulares definidos. Esta abordagem, referida como a segmentação de imagens, permite a análise de multi-paramétrico subsequente das células fotografadas por quantificação marcadores marcados com fluorescência localizadas a cada célula ou região sub-celular (referido como objectos segmentados). Esse fluxo de trabalho constitui uma base para permitir a análise de conteúdo de alta e se destina a servir como uma ferramenta que pode ser desenvolvido e modificado para atender multi-paramétricos, analisa célula individual em laboratórios sem acesso a instrumentos de alto teor especializadas ou software proprietário. Os arquivos fornecidos com este manuscrito incluem um conjunto de teste de dados de imagem raw relevantes, configurações de algoritmo e scripts de suporte para gerar a análise descrita. O algoritmo fornecido configurações fProfiler ou celular são otimizados para o conjunto de dados de exemplo e os detalhes seção de discussão que possam ser necessárias adaptações para permitir a utilização de dados de imagem de outros estudos. Uma vez que os dados quantitativos foi extraído usando Profiler Cell, diferentes laboratórios podem ter requisitos diferentes de como usar as informações apresentadas pelos valores de células individuais dos dados em bruto; mostrado aqui é uma abordagem pela qual os portões são aplicados aos dados em bruto para cada ensaio. Usando estas portas, os dados são transformados em termos binários de resposta, permitindo a visualização das tendências que ligam diferentes tratamentos com as subpopulações de células que sofrem de resposta definido pelas portas. Os portões são definidos com base em observações das distribuições de dados obtidos para os controlos positivos e negativos adequados para cada medição relevante. A utilização de portas é apenas um exemplo de como gerir as medições, à base de células-primas. Também mostrado é o uso de intensidade de DNA nuclear mimasurements em sua forma bruta como uma faixa contínua de valores, em combinação com os dados fechados. Outras abordagens para a gestão de dados de análise de imagem deve ser considerada, dependendo da natureza do estudo; alternativas estatísticos a utilizar portas para a atribuição de células para as subpopulações foram relatados 2 e sistemáticas comparação de estratégias para resumir dados de alto conteúdo em um grande número de parâmetros foram relatados 3. Análises de alta conteúdo de dados de imagem encontraram o uso em estudos celulares da droga-resposta, reverter genética e estresse ambiental sinalização 4-6. O mérito da análise de alto teor decorre do fato de que a análise de algoritmos de dados de microscopia de fluorescência permite que os parâmetros quantitativos e espaciais a ser considerado simultaneamente em células individuais 7. Deste modo, os resultados para vários ensaios celulares pode ser um comportamento de referência cruzada, diferencial de ensaio-dsubpopulações de células efined pode ser rastreado dentro das condições experimentais e ensaios podem incluir a consideração das variáveis ​​morfológicas. O estratégias e análise de fluxo de trabalho discutido aqui, como para outras abordagens de alto conteúdo, são capazes de fornecer dados multiplexados que são cruzados com células individuais. Estudos de alta conteúdo métodos terno que geram imagens de microscopia fluorescente e são aplicáveis ​​a análise de dados que variam de dezenas de imagens produzidas em microscopia de fluorescência convencional à base de baixo rendimento através dos milhares de imagens produzidas utilizando plataformas de triagem de alto conteúdo automatizadas. O fluxo de trabalho é ilustrado aqui com dados de exemplo a partir do qual ensaios separados são medidos em termos quer de intensidades marcador fluorescente nucleares ou translocação citoplasma / núcleo de uma proteína fluorescente repórter, respectivamente. O fluxo de trabalho é flexível em que estes testes podem ser consideradas separadamente ou em combinação, dependendo each determinada questão de investigação por vários investigadores. Os dados deste exemplo são produzidos como parte de uma experiência de interferência de RNA (RNAi) (Figura 1). Pequenas interferentes oligonucleótidos de ARN (ARNip) são usados ​​para knockdown proteínas específicas em células HCT116 de carcinoma colorectal humano, que resultam em alterações de dois repórteres fluorescentes de cinase (CDK) actividade dependente de ciclina. A fosforilação dependente de CDK6 da proteína do retinoblastoma nuclear na serina 780 (P-S780 RB1) é avaliada por coloração de anticorpos. Nas mesmas células, um repórter marcado com proteína verde fluorescente de actividade de CDK2 (GFP-CDK2 repórter) é avaliada pela sua proporção nuclear para citoplasmático quando, na ausência de actividade de CDK2 do repórter reside no núcleo e sobre serviço de transporte de activação CDK2 para o citoplasma 8. Além disso, o ADN nuclear de cada célula é corado usando um corante intercalante de ADN, Bisbenzamida, que serve como um meio para identificar as células e definir as fronteiras núcleos nas imagens bem como umsa medida de abundância ADN fornecer informações sobre a posição do ciclo celular da célula (Figura 2). As actividades de CDK6 e CDK2 são detectáveis ​​como células de trânsito da fase G1 para a fase S do ciclo celular 5 e sucedem 9,10 e, como tal, estreita concordância entre os dois repórteres em células individuais é esperado. O conjunto de dados de demonstração usado aqui como um exemplo analisa o efeito de siRNA alvo CDK6, proteína do retinoblastoma (RB1) e um controlo negativo não-alvo (Tabela 1). Knockdown de CDK6 deve provocar uma diminuição tanto do epitopo RB1 P-S780 e uma acumulação de células na fase G1 do ciclo celular. O knockdown RB1 serve como um controlo de reagente para a especificidade do anticorpo fosfo-S780. Imagens de microscópio de fluorescência fixados em formalina 11, células de cultura de tecidos HCT116 fluorescently manchadas são utilizados para análise de imagem algorítmica. Os dados numéricos resultante é então utilizada parareferência cruzada os repórteres e avaliar o impacto dos diferentes estados knockdown. O tamanho potencial dos dados produzidos por este tipo de análise pode representar um desafio para ferramentas de análise normais. Por exemplo, os dados de células individuais podem ser maiores do que alguns software de planilha eletrônica irá acomodar. Estão incluídos os scripts Perl que realizam altamente repetitivo, processamento simples, supervisionado dos dados para auxiliar a análise de grandes conjuntos de dados. Os scripts Perl são escritos especificamente para os arquivos de saída produzidos pelo celular Profiler, ao processar arquivos de imagem com uma convenção de nomenclatura de arquivo específico (Figura 3), e permitir a variável do número de campos por poço a ser utilizados na análise. É freqüentemente importante para dados do ensaio portão célula individual para acompanhar as tendências em subpopulações de células 5 e mostrado aqui é o uso de um script Perl para marcar cada célula com base em um portão conjunto predeterminado para cada tipo de ensaio. Também estão incluídos os scripts Perl opcionaisque resumem o resultado de dados para poços individuais (ou condições), entregando: porcentagem de células dentro da porta ao conjunto e os valores médios dos escores brutos de ensaio. A segunda opção, mais homogênea de visualização dos dados, é válido onde respostas afetam a totalidade ou a maioria das células dentro de um poço. Como discutido acima, essa avaliação é menos útil do que a oferecida pela aquisição electrónica de dados célula individual onde a resposta está confinada a um subconjunto de células dentro de uma população. A utilidade do fluxo de trabalho descrito não está limitado a perturbação por siRNA ou os ensaios descritos marcadores. Estudos têm usado essa abordagem para ensaiar respostas em experimentos de cultura de tecidos usando combinações de siRNA, inibidores químicos e tratamento de radiação e para a avaliação de outros que CDK6 marcadores e atividade CDK2 5. Conceptualmente, a estratégia experimental permite que uma variedade de regiões sub-celulares biologicamente úteis para ser automaticamente registadaem células individuais presentes em imagens de microscópio de fluorescência. Como tal, esta abordagem pode render informações biológicas quantitativa, os dados multiplexados revelando que pode ser perdida por meio de técnicas que se concentram em populações em vez de células individuais. Com pequenas modificações, o fluxo de trabalho de abordagem e análise descrito pode render, dados quantitativos de células individuais para quaisquer saídas ensaio baseado em fluorescência e respostas de células-biológico, em que a avaliação quantitativa do conteúdo de DNA, a quantificação da fluorescência nuclear ou citoplasmática ou o vaivém de marcadores entre estes dois compartimentos individualmente ou de forma multiplexada é de interesse. Como requisitos de publicação tendem cada vez mais para a apresentação dos dados em bruto abertamente acessível, acesso e familiaridade com ferramentas gratuitas para análise de imagens de microscopia como os descritos aqui também vai ser de interesse direto para os laboratórios que olham para reavaliar os dados publicados.

<table><tbody><tr><td>SiRNA de controle negativo AllStars</td><td>Qiagen</td><td>1027280</td><td>SiRNA de controle negativo.</td></tr><tr><td>CDK6 siRNA</td><td>Dharmacon/ Síntese personalizada</td><td>NA</td><td>Sequência antisense: 5' CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU</td></tr><tr><td>RB1 siRNA</td><td>Dharmacon/ Síntese personalizada</td><td>NA</td><td>Sequência antisense: 5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT</td></tr><tr><td>5x tampão siRNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>B-002000-UB-100</td><td>Para ser diluído com água tratada sem nuclease e não DEPC.</td></tr><tr><td>Água sem nulcessação (não DEPC)</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM9937</td><td>Para diluição de tampão siRNA.</td></tr><tr><td>Hiperfect</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td>Lipídio de transfecção.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966052</td><td>piruvato e meios de cultura de tecidos suplementados com alto teor de glicose.</td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 96 poços</td><td>Falcon</td><td>3072</td><td>Plain, placa de cultura de tecidos de 96 poços para a mistura paralela e compartimentada de complexos de transfecção.</td></tr><tr><td>Placa de visualização Packard</td><td>Perkin Elmer LAS</td><td>6005182</td><td>placa TC de 96 poços com base óptica na qual as células são transfectadas, cultivadas, fixadas e, eventualmente, fotografadas. Fornecido com vedações de placas adesivas opacas, que são usadas durante o armazenamento de placas usadas.</td></tr><tr><td>Membrana respirável</td><td>Alpha Labs</td><td>LW2783</td><td>Membrana adesiva estéril, permeável a gases.</td></tr><tr><td>Formalina tamponada neutra, 10%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5012-1CS</td><td>10% Formalina (4% formaldeído) fixador usado puro no protocolo.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100PC</td><td>Detergente</td></tr><tr> não iônico<td colspan="4">[cabeçalho]</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Base Trizma (tris(hidroximetil)aminometano)</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>Para solução de lavagem de placas.</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-P-S780 RB1</td><td>Abcam</td><td>ab32513</td><td>Coelho monoclonal</td></tr><tr><td>AlexaFluor647 Anti-coelho</td><td>Invitrogen</td><td>A21245</td><td>Anticorpo secundário altamente adsorvido e marcado com fluorescência.</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (Bisbenzimida)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>Fluorescente, intercalação de cromatina, corante de DNA.</td></tr><tr><td>Solução de permeabilização</td><td>NA NA</td><td></td><td>0,1% Triton X-100 em solução salina tamponada com Tris 50 mM, pH 8,0.</td></tr><tr><td>Solução de lavagem de placas</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% de Tween-20.</td></tr><tr><td>Solução em bloco</td><td>NA</td><td>NA</td><td>5% de leite em pó em solução salina Tamponada com Tris e 0,1% de Tween-20. Para placa de bloqueio antes da imunocoloração e diluição de anticorpos.</td></tr><tr><td>Cell Profiler 2.1</td><td>Broad Institute</td><td></td><td>http://www.cellprofiler.org/download.shtml</td></tr><tr><td>Active Perl Community Edition</td><td>ActiveState</td><td></td><td>http://www.activestate.com/activeperl/downloads</td></tr><tr><td>ambiente de programação R</td><td>The R Foundation</td><td></td><td>http://www.r-project.org</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>Rstudio</td><td></td><td>http://www.rstudio.com/</td></tr></tbody></table>

fluxo de trabalho para de alta conteúdo, quantificação de células individuais de marcadores fluorescentes de microscópio universal data, apoiada pela open source software

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Avanços no entendimento dos mecanismos de controlo que regem o comportamento das células em modelos de cultura de tecidos de mamíferos aderentes estão se tornando cada vez mais dependente de modos de análise de uma única célula. Métodos que entregam dados compostos refletem os valores médios de biomarcadores de populações de células risco de perder a dinâmica subpopulação que refletem a heterogeneidade do sistema biológico estudado. De acordo com este, as abordagens tradicionais estão sendo substituídas por, ou suportadas com formas mais sofisticadas de ensaio celular desenvolvidos para permitir a avaliação por meio de microscopia de alta conteúdo. Estes ensaios potencialmente gerar um grande número de imagens de biomarcadores fluorescentes, o que permitiu, acompanhando os pacotes de software proprietário, permite medições multi-paramétricos por célula. No entanto, os custos relativamente elevados de capital e overspecialization de muitos destes dispositivos têm impedido a sua acessibilidade para muitos pesquisadores. Descrito aqui é umfluxo de trabalho universalmente aplicável para a quantificação de várias intensidades dos marcadores fluorescentes específicos de regiões sub-celulares de células individuais adequadas para utilização com a maioria dos microscópios de imagens fluorescentes. A chave para este fluxo de trabalho é a implementação do software Profiler celular livremente disponível de 1 a distinguir as células individuais nestas imagens, segmento los em regiões subcelulares definidos e fornecer intensidade de fluorescência do marcador valores específicos para estas regiões. A extracção de valores de intensidade de células individuais a partir de dados de imagem é o objectivo central deste fluxo de trabalho e será ilustrada com a análise dos dados de controlo a partir de uma tela de siRNA para G1 reguladores de pontos de verificação de células humanas aderentes. No entanto, o fluxo de trabalho aqui apresentado pode ser aplicado para a análise de dados a partir de outros meios de perturbação celular (por exemplo, ecrãs de compostos) e outras formas de fluorescência baseada marcadores celulares e, portanto, deve ser útil para uma vasta gama de laboratórios.

Apresentado é um informática fluxo de trabalho flexível permitindo uma análise baseada em imagem multiplexado de células marcadas com fluorescência. O fluxo de trabalho quantifica marcadores nucleares e citoplasmáticos e calcula marcador translocação entre esses compartimentos. Os procedimentos são fornecidos por perturbação das células utilizando metodologia de siRNA e fiável para a detecção do marcador através de imunofluorescência indirecta em formatos de 96 poços.

Fluxo de trabalho para de alta conteúdo, Quantificação de células individuais de marcadores fluorescentes de Microscópio Universal Data, apoiada pela Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

O objetivo geral deste procedimento é medir objetivamente as respostas de células individuais, quantificando intensidades específicas de marcadores fluorescentes a partir de imagens de microscópio. Isso é feito primeiro submetendo células de cultura de tecidos aderentes ao knockdown do gene mediado por irna. Na segunda etapa, as células são coradas com fluorescência e, em seguida, fotografadas para vários marcadores de interesse.Na etapa final, a expressão dos marcadores dentro de regiões subcelulares específicas é definida algoritmicamente, são células individuais. Em última análise, as respostas celulares a pistas biológicas do knockdown de genes podem ser analisadas medindo os níveis de expressão fluorescente dos marcadores de interesse e sua translocação subcelular. Embora este procedimento forneça informações sobre a regulação do trânsito do ciclo celular G em resposta aos siRNAs.Também pode ser aplicado a estudos que geram imagens de células fluorescentes, estudando transporte nuclear e homeostase de proteínas. Demonstrando o procedimento estarão Daniel Wek e Car K HO colegas pós-doutorados do meu laboratório Comece dispensando 70 microlitros de 200 nanomolares de irna, diluído um tampão de irna nos poços apropriados de uma placa estéril de 96 poços em uma capa de cultura de tecidos estéril. Em seguida, adicione 105 microlitros de lipídio de transfecção diluído em 40 volumes de meio DMEM livre de soro em cada poço de sir a misturar a placa por vibração suave da temperatura ambiente e, após 10 minutos, subdivida os 175 microlitros resultantes em três réplicas de 50 microlitros por alvo em uma placa de 96 poços tratada com cultura de tecidos opaca com uma base transparente.Em seguida, dispense 8.000 células por poço em 150 microlitros de DMEM com 10% de soro diretamente nos complexos de irna lipídica de 50 microlitros sem misturar. Em seguida, sele a placa com uma membrana respirável adesiva estéril e coloque a placa em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. 48 horas depois, aspirar a mídia das placas.Em seguida, fixe as células em 100 microlitros de formaldeído tampão a 4% em uma capela à temperatura ambiente Após 10 minutos, aspire o fixador e faça três lavagens de 100 microlitros com PBS após a última lavagem. Remover o PBS e perfurar as células com três ciclos de incubação de solução de permeização de 100 microlitros de 10 minutos cada à temperatura ambiente sem agitação. Após a última incubação, remova a solução de permeação e adicione 100 microlitros de solução em bloco por poço por 30 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, aspire a solução em bloco e sonde as células com 50 microlitros do anticorpo primário de interesse dentro de duas semanas após a marcação do microscópio confocal uc com uma objetiva de 20 x para obter imagens TIFF separadas em escala de cinza de 16 bits em três canais correspondentes ao corante de DNA GFP e imunocoloração. Os quatro Flora capturam muitos conjuntos de imagens ou quadros não sobrepostos para obter imagens de aproximadamente 1000 a 2000 células por poço. Nomear o arquivo de imagem sistematicamente com as informações de metadados para que cada nome de arquivo seja uma combinação exclusiva de nome do experimento, endereço do poço, número do quadro e identificador do canal.Em seguida, abra o software de criação de perfil de célula e clique em arquivo e importe o pipeline. Em seguida, em do arquivo, selecione o arquivo de tubo CP do pipeline de três canais, que contém as instruções necessárias para que o software interprete os metadados do arquivo de imagem do nome de arquivo salvo O Convention Cell Profiler agora pode ser usado para relacionar as imagens, extrair o DNA nuclear e as intensidades de anticorpos dos arquivos e usar o canal GFP para calcular a proporção da intensidade nuclear versus citoplasma. Para cada célula detectada, clique no botão exibir configurações de saída e, em seguida, clique nas pastas de entrada e saída padrão.Selecionando o local dos arquivos de imagem para análise e o destino dos dados extraídos, respectivamente. Em seguida, na janela de módulos de análise, clique nos ícones de olho apropriados para observar as janelas identificar objetos primários e objetos terciários durante a análise e clique em analisar imagens quando a análise for concluída. Clique em ok na caixa de mensagem e vá para a pasta de saída padrão Local onde todos os arquivos de dados são salvos como arquivos de valores separados por vírgula.Para realizar a extração de dados, encontre o novo arquivo CSV de núcleos incluído na saída do cell profiler, que contém os dados de células individuais para a intensidade do anticorpo nuclear fluorescente intensidade do DNA nuclear e os valores de proporção de dois repórteres GFP CDK. Copie o arquivo de script de pulso fornecido para o classificador de marcha PL na mesma pasta que o arquivo de dados CSV de núcleos. Em seguida, clique duas vezes no ícone do Pearl Script.E quando solicitado, digite o nome completo do arquivo de dados seguido por um nome de arquivo CSV DOT para o arquivo no qual as células devem ser fechadas e os valores de porta para a fluorescência de anticorpos e dados do repórter G FP CDK dois. Confirme se o arquivo recém-criado combina os valores brutos de ensaio de célula individual do perfil de célula original dos dados com os rótulos de subpopulação mostrando como cada célula de cada poço funciona em relação a ambas as portas. Agora, abra o software R Studio para plotar os dados para cada condição experimental usando os rótulos de subpopulação de células individuais clicando em arquivo e abrir arquivo e, em seguida, selecionando o arquivo r de ponto de análise fornecido.Digite o endereço do computador da pasta que contém os dados fechados, incluindo a letra da unidade e o nome do próprio arquivo. Em seguida, destaque as linhas de um a 17 na janela superior esquerda do nosso estúdio e clique no botão executar para inserir os valores limite de dados experimentais e os detalhes da localização do poço. Por fim, destaque os blocos individuais do código restante abaixo da linha 17 e clique no botão Executar para criar os gráficos correspondentes.Observe os gráficos na janela no canto inferior direito do nosso estúdio e clique no botão exportar para salvá-los em vários formatos. O fluxo de trabalho descrito aqui analisa as imagens do microscópio fluorescente para produzir dados brutos na forma de uma lista detalhando cada célula identificada e seus valores de ensaio correspondentes. Existem muitas opções para a análise desses dados.Por exemplo, nesses gráficos de histograma, os valores de ensaio para as células tratadas com RNAs de controle permitem a identificação das portas apropriadas para limitar cada ensaio. Os limites de gating são então aplicados usando um script de pulso para rotular cada célula nos dados brutos de acordo com o resultado do ensaio. Essa abordagem de rotulagem auxilia na avaliação visual preliminar e automatizada das relações entre os tratamentos e a distribuição da subpopulação de conjuntos muito grandes de dados de células individuais.Por exemplo, neste experimento representativo, três condições de knockdown de irna resultaram em distribuições contrastantes das células em relação às portas dos dois ensaios. Os gráficos R usam os rótulos para calcular as distribuições percentuais das células em cada quadrante. Os rótulos também permitem que medições fluorescentes adicionais sejam cruzadas com os dados do ensaio.Neste experimento, as subpopulações de células tratadas com SI CDK seis foram agrupadas de acordo com seus respectivos marcadores de ensaio e plotadas como histogramas de coloração de DNA nuclear. Esse uso dos rótulos de dados celulares revela a relação entre os dois ensaios celulares e o conteúdo de DNA nas células. Ao executar este procedimento, é sempre importante lembrar de testar e ajustar os parâmetros de segmentação de imagem ao usar o Cell Profiler.Isso é particularmente importante ao usar arquivos de imagem novos ou não testados pela primeira vez. Okey.

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