Fluxo de trabalho para de alta conteúdo, Quantificação de células individuais de marcadores fluorescentes de Microscópio Universal Data, apoiada pela Open Source Software

O objetivo geral deste procedimento é medir objetivamente as respostas de células individuais, quantificando intensidades específicas de marcadores fluorescentes a partir de imagens de microscópio. Isso é feito primeiro submetendo células de cultura de tecidos aderentes ao knockdown do gene mediado por irna. Na segunda etapa, as células são coradas com fluorescência e, em seguida, fotografadas para vários marcadores de interesse.

Na etapa final, a expressão dos marcadores dentro de regiões subcelulares específicas é definida algoritmicamente, são células individuais. Em última análise, as respostas celulares a pistas biológicas do knockdown de genes podem ser analisadas medindo os níveis de expressão fluorescente dos marcadores de interesse e sua translocação subcelular. Embora este procedimento forneça informações sobre a regulação do trânsito do ciclo celular G em resposta aos siRNAs.

Também pode ser aplicado a estudos que geram imagens de células fluorescentes, estudando transporte nuclear e homeostase de proteínas. Demonstrando o procedimento estarão Daniel Wek e Car K HO colegas pós-doutorados do meu laboratório Comece dispensando 70 microlitros de 200 nanomolares de irna, diluído um tampão de irna nos poços apropriados de uma placa estéril de 96 poços em uma capa de cultura de tecidos estéril. Em seguida, adicione 105 microlitros de lipídio de transfecção diluído em 40 volumes de meio DMEM livre de soro em cada poço de sir a misturar a placa por vibração suave da temperatura ambiente e, após 10 minutos, subdivida os 175 microlitros resultantes em três réplicas de 50 microlitros por alvo em uma placa de 96 poços tratada com cultura de tecidos opaca com uma base transparente.

Em seguida, dispense 8.000 células por poço em 150 microlitros de DMEM com 10% de soro diretamente nos complexos de irna lipídica de 50 microlitros sem misturar. Em seguida, sele a placa com uma membrana respirável adesiva estéril e coloque a placa em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. 48 horas depois, aspirar a mídia das placas.

Em seguida, fixe as células em 100 microlitros de formaldeído tampão a 4% em uma capela à temperatura ambiente Após 10 minutos, aspire o fixador e faça três lavagens de 100 microlitros com PBS após a última lavagem. Remover o PBS e perfurar as células com três ciclos de incubação de solução de permeização de 100 microlitros de 10 minutos cada à temperatura ambiente sem agitação. Após a última incubação, remova a solução de permeação e adicione 100 microlitros de solução em bloco por poço por 30 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, aspire a solução em bloco e sonde as células com 50 microlitros do anticorpo primário de interesse dentro de duas semanas após a marcação do microscópio confocal uc com uma objetiva de 20 x para obter imagens TIFF separadas em escala de cinza de 16 bits em três canais correspondentes ao corante de DNA GFP e imunocoloração. Os quatro Flora capturam muitos conjuntos de imagens ou quadros não sobrepostos para obter imagens de aproximadamente 1000 a 2000 células por poço. Nomear o arquivo de imagem sistematicamente com as informações de metadados para que cada nome de arquivo seja uma combinação exclusiva de nome do experimento, endereço do poço, número do quadro e identificador do canal.

Em seguida, abra o software de criação de perfil de célula e clique em arquivo e importe o pipeline. Em seguida, em do arquivo, selecione o arquivo de tubo CP do pipeline de três canais, que contém as instruções necessárias para que o software interprete os metadados do arquivo de imagem do nome de arquivo salvo O Convention Cell Profiler agora pode ser usado para relacionar as imagens, extrair o DNA nuclear e as intensidades de anticorpos dos arquivos e usar o canal GFP para calcular a proporção da intensidade nuclear versus citoplasma. Para cada célula detectada, clique no botão exibir configurações de saída e, em seguida, clique nas pastas de entrada e saída padrão.

Selecionando o local dos arquivos de imagem para análise e o destino dos dados extraídos, respectivamente. Em seguida, na janela de módulos de análise, clique nos ícones de olho apropriados para observar as janelas identificar objetos primários e objetos terciários durante a análise e clique em analisar imagens quando a análise for concluída. Clique em ok na caixa de mensagem e vá para a pasta de saída padrão Local onde todos os arquivos de dados são salvos como arquivos de valores separados por vírgula.

Para realizar a extração de dados, encontre o novo arquivo CSV de núcleos incluído na saída do cell profiler, que contém os dados de células individuais para a intensidade do anticorpo nuclear fluorescente intensidade do DNA nuclear e os valores de proporção de dois repórteres GFP CDK. Copie o arquivo de script de pulso fornecido para o classificador de marcha PL na mesma pasta que o arquivo de dados CSV de núcleos. Em seguida, clique duas vezes no ícone do Pearl Script.

E quando solicitado, digite o nome completo do arquivo de dados seguido por um nome de arquivo CSV DOT para o arquivo no qual as células devem ser fechadas e os valores de porta para a fluorescência de anticorpos e dados do repórter G FP CDK dois. Confirme se o arquivo recém-criado combina os valores brutos de ensaio de célula individual do perfil de célula original dos dados com os rótulos de subpopulação mostrando como cada célula de cada poço funciona em relação a ambas as portas. Agora, abra o software R Studio para plotar os dados para cada condição experimental usando os rótulos de subpopulação de células individuais clicando em arquivo e abrir arquivo e, em seguida, selecionando o arquivo r de ponto de análise fornecido.

Digite o endereço do computador da pasta que contém os dados fechados, incluindo a letra da unidade e o nome do próprio arquivo. Em seguida, destaque as linhas de um a 17 na janela superior esquerda do nosso estúdio e clique no botão executar para inserir os valores limite de dados experimentais e os detalhes da localização do poço. Por fim, destaque os blocos individuais do código restante abaixo da linha 17 e clique no botão Executar para criar os gráficos correspondentes.

Observe os gráficos na janela no canto inferior direito do nosso estúdio e clique no botão exportar para salvá-los em vários formatos. O fluxo de trabalho descrito aqui analisa as imagens do microscópio fluorescente para produzir dados brutos na forma de uma lista detalhando cada célula identificada e seus valores de ensaio correspondentes. Existem muitas opções para a análise desses dados.

Por exemplo, nesses gráficos de histograma, os valores de ensaio para as células tratadas com RNAs de controle permitem a identificação das portas apropriadas para limitar cada ensaio. Os limites de gating são então aplicados usando um script de pulso para rotular cada célula nos dados brutos de acordo com o resultado do ensaio. Essa abordagem de rotulagem auxilia na avaliação visual preliminar e automatizada das relações entre os tratamentos e a distribuição da subpopulação de conjuntos muito grandes de dados de células individuais.

Por exemplo, neste experimento representativo, três condições de knockdown de irna resultaram em distribuições contrastantes das células em relação às portas dos dois ensaios. Os gráficos R usam os rótulos para calcular as distribuições percentuais das células em cada quadrante. Os rótulos também permitem que medições fluorescentes adicionais sejam cruzadas com os dados do ensaio.

Neste experimento, as subpopulações de células tratadas com SI CDK seis foram agrupadas de acordo com seus respectivos marcadores de ensaio e plotadas como histogramas de coloração de DNA nuclear. Esse uso dos rótulos de dados celulares revela a relação entre os dois ensaios celulares e o conteúdo de DNA nas células. Ao executar este procedimento, é sempre importante lembrar de testar e ajustar os parâmetros de segmentação de imagem ao usar o Cell Profiler.

Isso é particularmente importante ao usar arquivos de imagem novos ou não testados pela primeira vez. Okey.