Geração de Transgênicos Hydra Por microinjeção de embriões

Resumo

Hydra transgênica estável são feitas por microinjeção de DNA de plasmídeo em embriões, seguida de integração genômica aleatória e propagação assexuada para estabelecer uma linha uniforme. Transgenic Hydra é usado para rastrear movimentos celulares, superexpressar genes, estudar a função do promotor ou derrubar a expressão gênica usando RNAi.

Resumo

Como membro do filo Cnidaria, o grupo irmão de todos os bilaterianos, Hydra pode lançar luz sobre os processos biológicos fundamentais compartilhados entre animais multicelulares. Hydra é usado como modelo para o estudo da regeneração, formação de padrões e células-tronco. No entanto, os esforços de pesquisa foram prejudicados pela falta de um método confiável para perturbações genéticas para estudar a função molecular. O desenvolvimento de métodos transgênicos revitalizou o estudo da biologia da Hidra ¹. A Hydra transgênica permite o rastreamento de células vivas, classificação para produzir populações de células puras para análise bioquímica, manipulação da função gênica por knockdown e superexpressão e análise da função promotora. O DNA do plasmídeo injetado em embriões em estágio inicial se integra aleatoriamente ao genoma no início do desenvolvimento. Isso resulta em filhotes que expressam transgenes em manchas de tecido em uma ou mais das três linhagens (epitelial ectodérmico, epitelial endodérmico ou intersticial). A taxa de sucesso na obtenção de um filhote com tecido transgênico está entre 10% e 20%. A propagação assexuada do filhote transgênico é usada para estabelecer uma linhagem uniformemente transgênica em uma linhagem particular. A geração de Hydra transgênica é surpreendentemente simples e robusta, e aqui descrevemos um protocolo que pode ser facilmente implementado a baixo custo.

Introdução

Hydra foi usado para estudar a regeneração, formação de padrões, e as células-tronco para cerca de 250 anos ² Hydra tem um plano corporal simples, que consiste de três linhagens de células:. Epitelial ectodérmica, endodérmica epitelial e intersticial. O corpo tubular é formado por o ectodérmico e linhagens epiteliais da endoderme, cada um dos quais é uma camada única de células. Todas as células epiteliais no corpo da coluna são mitótico. Quando as células epiteliais são deslocados para as extremidades ^3, a cabeça (boca e tentáculos) na extremidade bucal ou do pé (disco basal) na extremidade aboral, eles prendem na fase G2 do c....

Protocolo

1 Preparação de plasmídeo de DNA, agulhas e injeção Pratos

1. Prepare o DNA de plasmídeo utilizando um kit de alta velocidade ou Maxi Midi e concentra-se o ADN para 2,5 mg / ml usando a precipitação com etanol. O sedimento de DNA deve ser dissolvido em água livre de nuclease desionizada. Armazenar o ADN em 10-20 mL alíquotas a -20 ° C. (Ver Quadro Suplementar 1 para uma lista de vetores disponíveis)
2. Faça um prato de injeção utilizando agarose para construir uma calha para a realização de embriões em uma placa de Petri de 100 x 15 mm.
   1. Coloque uma lâmina de microscópio de vidro de 75 x 50 em um 100 x 15 mm numa caixa de Petri....

Resultados

Estabelecer linhas de Hydra transgênicos

Alimentar filhotes transgênicas a cada 2-3 dias com náuplios de Artemia. Os filhotes, por vezes, não comer por um ou dois dias após a eclosão. Alguns novos filhotes nunca vai comer, e, portanto, não vai sobreviver. Se o filhote é transgénicos quer na ectodérmica (Figura 1A) ou o tecido epitelial endodérmica, permitir que o animal a germinar e recolher as gemas que têm a maioria dos tecidos transgénicos (Figura 1.......

Discussão

Hydra rotineiramente reproduz de forma assexuada, mas requer estímulos ambientais para começar gametas produtores. Esses estímulos não são bem definidos para a maioria das espécies de Hydra e podem variar de estirpe para estirpe. Um obstáculo significativo para a produção de Hidra transgénico é a obtenção de embriões numa base regular porque pode ser difícil num ambiente laboratorial para induzir a tornar-se Hydra sexual. A estirpe AEP ^25, no entanto, produz gâmetas prontam.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
AEP Hydra Strain			E-mail: Celina Juliano na celina.juliano@yale.edu ou Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp
Kit Maxi de Alta Velocidade	Qiagen	12662
100 x 15 mm Placas de Petri	BD Falcon	351029
75 x 50 mm Microscópio de Vidro Slide	Sigma	CLS294775X50
Microinjeção Molde de Peixe	IBI Scientific	FM-600
Vidro de Borosilicato com Filamento	Sutter Instrumento	BF100-50-10	O.D.: 1,0 mm, I.D.: 0,50 mm, 10 cm de comprimento
Extrator de Micropipeta Flamejante/Marrom	Sutter Instrumento	P-97
Fenol Vermelho	Sigma	P3532
Pinça de Joalheiro, Durmont #	Sigma	F6521
Lâmina de Bisturi #15	Fisher	50-822-421
Óleo mineral	Sigma	M8410-500ML
Microinjetor	Narishige	IM-9B
Suporte magnético	Narishige	GJ-1
Placa de ferro	Narishige	IP
Joystick Micromanipulador	Narishige	MN-151

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