Expressão de proteínas recombinantes de Biologia Estrutural em HEK 293F Suspensão Cells: Uma abordagem inovadora e acessível

Resumo

A expressão de proteínas recombinantes por sistemas de mamíferos está se tornando um método atraente para a produção de complexos proteicos para biologia estrutural. Aqui apresentamos um sistema de expressão simples, mas altamente eficiente, usando células de mamíferos cultivadas em suspensão para purificar complexos de proteínas para estudos estruturais.

Resumo

A expressão e purificação de grandes quantidades de complexos proteicos recombinantes é um requisito essencial para estudos de biologia estrutural. Por mais de duas décadas, os sistemas de expressão procariótica, como E. coli, dominaram a literatura científica por causa de linhagens celulares eucarióticas caras e menos eficientes. Apesar da clara vantagem em termos de rendimentos e custos de expressar proteínas recombinantes em bactérias, a ausência de cofatores específicos, chaperonas e modificações pós-traducionais pode causar perda de função, dobramento incorreto e pode interromper as interações proteína-proteína de certos complexos eucarióticos de múltiplas subunidades, receptores de superfície e proteínas secretadas. O uso de sistemas de expressão celular de mamíferos pode resolver essas desvantagens, uma vez que fornecem um ambiente de expressão eucariótica. No entanto, os baixos rendimentos de proteína e os altos custos de tais métodos limitaram até recentemente seu uso para biologia estrutural. Aqui descrevemos um método simples e acessível para expressar e purificar quantidades de miligramas de proteína, realizando transfecções transitórias de células HEK (Rim Embrionário Humano) 293F cultivadas em suspensão.

Introdução

O rápido progresso da biologia celular e molecular a necessidade constante de drogas melhorou em medicina criou uma necessidade para os biólogos estruturais de olhar para estruturas de proteínas cada vez mais complexos. Estas muitas vezes podem exigir determinadas modificações pós-traducionais, chaperones moleculares e co-fatores para apoiar a sua dobradura elaborado e atividade enzimática. Embora a grande maioria das estruturas presentes no Protein Data Bank foram obtidos usando os sistemas de expressão bacterianos, procariotas são incapazes de realizar um grande número de modificações e estas não têm muitos co-factores essenciais eucarióticas. Isto pode ser um problema para o estudo de grandes complexos de multi-subunidades que são activados por pequenas moléculas de sinalização, bem como para nuclear, da superfície da célula e as proteínas segregadas que requerem mecanismos de dobragem elaborados. Um número de E. coli foram projetados para superar algumas destas limitações ^1. Nos últimos anos, no entanto, a utilização de msistemas de expressão ammalian tem vindo a aumentar, porque eles produzem de forma confiável proteínas eucarióticas que são de outra problemática para expressar em outros sistemas ^2. Hoje em dia, é possível obter linhas celulares estáveis ​​de mamífero e expressão transitória por meio de uma variedade de técnicas que vão desde a transdução virai da transfecção mediada por produto químico, o gene de transferência física, tais como electroporação e injecção directa ^3. Apesar de todos esses métodos têm o seu próprio conjunto de vantagens e desvantagens, apenas alguns deles são adequados para estudos estruturais serem muito caros e / ou demorado.

Aqui nós descrevemos um método muito simples, rápido, de baixo custo, mas altamente eficiente para expressar complexos de proteínas para a biologia estrutural na suspensão crescido células de mamíferos. A abordagem utiliza transientes de co-transfecção de uma linha de rim embrionário humano (HEK) célula (por exemplo, células HEK 293F Livres). Estas células foram derivadas da ce HEK 293linha ll, estão adaptadas a crescer em culturas de suspensão, atingindo altas densidades utilizando meio isento de soro (por exemplo, 293 Freestyle Expressão Médio). As células são então transfectadas transitoriamente utilizando uma versão ramificada de polietilenimina (PEI), um reagente polimérico de baixo custo que tem sido relatado para funcionar para uma grande variedade de células de mamíferos ^4, formando complexos ADN / PEI que entram na célula hospedeira por endocitose ^5. Este método é adequado tanto para pequena escala (30 ml) e em larga escala (até 300 ml) e as experiências podem produzir níveis elevados de complexos de proteínas purificadas. É particularmente útil para o estudo de proteínas que requerem mecanismos de dobragem complexo, co-factores ou particulares de modificações pós-tradução que não pode ser realizada por bactérias, leveduras e células de insectos.

Neste protocolo, apresentam a expressão e purificação do andaime central de três proteínas do complexo de repressão transcricional Sin3A. Este consiste de histonaDeacetylase 1 (HDAC1), supressor defeituoso de silenciamento 3 (SDS3) e Switch-independente 3 (Sin3A). O complexo purificado é utilizado para ensaios de cristalização de alto rendimento.

Protocolo

NOTA: O protocolo é adequado para qualquer escala de expressão, por conseguinte, os volumes e as quantidades dos reagentes deve ser dimensionado proporcionalmente. Um vector de expressão adequado de mamífero podem ser utilizados para este protocolo. Aqui utilizou-se uma modificação de pcDNA 3,1 vector de expressão que permite convenientemente a inclusão ou exclusão de um marcador de afinidade de acordo com a escolha das enzimas de restrição utilizados na clonagem (Figura 1). O protocolo seguinte descreve um transfecção grande escala.

1 Large Scale Cultura / transfecção em 1 L frascos cilíndricos

Crescer e manter as células adaptaram-HEK293F suspensão de acordo com protocolos padrão. Tipicamente, as culturas de arranque, entre 30 e 100 ml são cultivadas em balões de 250 ml de cultura de células cónicas.

1. Células de sementeira em 0.5 x 10 ⁶ células / ml para um volume final de 300 ml em cada frasco rolante 1 L.
   NOTA: frascos rolantes acomodar um mínimo de 150 ml até um máximo de300 ml de cultura em suspensão. Para transfections maior escala usar várias garrafas.
2. Incubar durante 24 horas num incubador agitador orbital a 37 ° C, 120 rpm, e 5% de _CO2, até atingir uma densidade de células de 1,0 x 10 ⁶ células / ml (células devem dividir aproximadamente a cada 24 h).
3. Pipetar um total de 300 ug de ADN, esterilizada por filtração (ver método suplementar) em 30 ml de PBS e vortex vigorosamente durante 3 seg.
   NOTA: É um total de 1 ug de DNA por milh de culas transfectadas. Se dois ou mais plasmídeos são para ser co-transfectadas reduzir a quantidade de cada um de modo a que a proporção de ADN para células permanece constante.
4. Adicionar 1,2 ml de 0,5 mg / ml filtrar esterilizado PEI para a solução de PBS / ADN e vortex vigorosamente durante 3 seg.
5. Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 20 min.
6. Adicionar o ADN / PEI misturar com as células - que devem estar a uma densidade de 1 x 10 ⁶ células / ml (passo 1.3).
7. Após a co-transfecção, as células incubarnum incubador agitador orbital durante mais 48 horas a 37 ° C, 120 rpm, e 5% de CO _2.
8. Proteínas intracelulares da colheita por centrifugação as células a 3000 xg durante 5 min e armazenar o sedimento a -80 ° C.
   NOTA: Como alternativa, usar um padrão (não-CO ₂₎ agitação da incubadora, quando a atmosfera acima da cultura é substituído com 5% de CO ₂ e a tampa do frasco é selado. A atmosfera terá de ser substituída, em cada passagem (normalmente a cada 2 dias).

2.-Protein complexo purificação do extrato de células inteiras

Este protocolo é otimizado para a purificação de complexos nucleares que utilizam proteínas marcadas no pavilhão.

1. Descongelar sedimento celular em ~ 40 ml de tampão de lise de pré-gelada (100 mM de acetato de potássio, 50 mM Tris pH 7,5, 5% de glicerol, 0,3% Triton X-100, os inibidores de protease) por l de cultura.
2. Re-suspender o pellet pipetando para cima e para baixo várias vezes (para evitar a formação de espuma, não vórtice).
3. Exaustivamente re-suspender as células utilizando um homogeneizador de vidro. Sonicar por 3 ciclos (15 seg, 15 seg em off). Centrifugar a 30.000 xg por 25 min a 4 ° C e manter sobrenadante.
4. Equilibrar 1,25 ml de anti-bandeira embalado resina de agarose por litro de cultura por lavagem três vezes com tampão de equilibração de resina (de acetato de potássio 100 mM, Tris 50 mM, pH 7,5).
5. Incubar o extracto de células inteiras a partir do passo 2.3 com a resina de afinidade, em um ou mais tubos de centrífuga de 50 ml e cuidadosamente girar a amostra durante 30-120 min a 4 ° C.
6. Centrifugar a 3.000 xg durante 1 min a 4 ° C, o sobrenadante de descarte.
7. Lava-se a resina com 45 ml de tampão de pré-refrigerada 1 (100 mM de acetato de potássio, 50 mM Tris pH 7,5, 5% de glicerol, 0,3% Triton X-100). Centrifugar a 3000 xg por 1 min e elimine o sobrenadante.
8. Repetir o passo 2.7, utilizando tampão de alto teor salino (300 mM de acetato de potássio, 50 mM Tris pH 7,5, glicerol a 5%), seguido de tampão de baixa salinidade (50 mM de acetato de potássio, 50 mM Tris pH 70,5, glicerol a 5%) e Tampão de Clivagem TEV (50 mM de acetato de potássio, 50 mM Tris pH 7,5, TCEP 0,5 mM).
   NOTA: Certifique-se de cada lavagem é breve ou seja, suficiente para totalmente re-suspender a resina, e não mais.
9. Coletar uma amostra de 10 mL de resina e diluir em um volume de tampão de carga de proteína 2x para análise (controle de proteínas). Não utilizar agentes redutores, para evitar a libertação de anticorpo a partir da resina.
10. Re-suspender a resina em 8-10 ml de tampão de clivagem de TEV pré-refrigerado e transferência para um tubo de centrífuga de 15 ml.
11. Adicionar ~ 40 ug de protease TEV (a partir de estoque de 1 mg / ml) por l de cultura original e misturar bem por pipetagem para cima e para baixo várias vezes.
12. Substituir tubo atmosfera com 100% de gás _N2 para evitar a oxidação da proteína.
13. Delicadamente gire O / N a 4oC.
14. Centrifugar a 3000 xg durante 10 min. Transferir o sobrenadante para um filtro de ultra-centrifugação com um peso molecular de corte adequado e concentraraté 500 ul.
15. Recolher uma amostra de 10 ul da proteína concentrada e diluída em 1 volume de tampão de carga de proteína 2x para análise. (TEV controle eluato).
16. Recolher uma amostra de 10 ul da resina e dilua em 1 volume de tampão de carga de proteína 2x para análise. Não utilizar agentes de redução, a fim de evitar a libertação de grandes quantidades de anticorpos a partir da resina. (Controle de resina pós-TEV).
17. Equilibrar a coluna de cromatografia de exclusão de tamanho com tampão de filtração em gel (acetato de potássio 50 mM, 50 mM Tris pH 7,5, TCEP 0,5 mM).
18. Filtra-se a proteína através de um filtro de 0,22 um
19. Coloque a amostra na coluna e recolher as frações.
20. Amostras executado a partir de passos 2.9, 2.15 e 2.16 e as fracções de filtração gel de passo 2,19 em um SDS-PAGE e Coomassie mancha para análise.
    NOTA: É aconselhável correr um gel de SDS-PAGE de amostras de passos de 2,9, 2,15 e 2,16 antes da filtração em gel para confirmar a expressão da proteína alvo.

Resultados

Aqui mostramos de 2 L (8 x 250 ml culturas) transiente de co-transfecção e a purificação da HDAC1, SDS3, complexo ternário Sin3A. HDAC1 e SDS3 interagir com Sin3A através do domínio HDAC-interação (HID) de Sin3A. Um rendimento típico de purificação superior a 1 mg de complexo por litro de cultura.

Figura 1 Representação esquemática do vector de expressão pcDNA 3.1 modificado. O plasmídeo foi digerido com EcoRV e EcoRI de modo a incluir o marcador de afinidade e o local de clivagem de TEV no terminal amino de Sin3A. Para clonar as versões não marcados de HDAC1 e SDS3, o vector foi digerido com Kpnl e EcoRI.

Figura 2. SDS-PAGE mostra a primeira fase de purificação. A pista "proteína ligada" mostra o complexo ligado à resina de afinidade. Após a digestão de TEV, o marcador presente na Sin3A-HID é clivada e o complexo é eluída a partir da resina, como mostrado no segundo e terceiro pistas do gel.

Figura 3: Cromatograma de cromatografia de exclusão de tamanho utilizando proteína purificada do complexo. Note-se que o complexo puro eluído no volume vazio porque forma um dímero em solução.

Figura 4 mostra SDS-PAGE das fracções da filtração em gel mostrado na Figura 3.

Figura 5 tripano células HEK 293F coradas de azul em 2.3x10 ⁶ células / mL prontas para serem transfectados. Células só devem estar presentes na forma de células individuais ou divididas, enquanto grandes aglomerados pode ser cindida por vórtice vigoroso durante aproximadamente 25 seg.

Problema	Possíveis causas	Ação
Rendimento de proteína baixa.	Baixo número de células transfectadas.	Certifique-se a densidade das células é de aproximadamente 1,0 x 10 6 antes da adição da mistura de reacção para a transfecção da cultura.
	As células podem ter sido subcultivadas demasiadas vezes.	Use células-mãe fresca após aproximadamente 90 passeas idades.
	O ADN pode ser degradado ou ter uma grande quantidade de impurezas.	Certifique-se o ADN de plasmídeo a ser usado tem uma proporção de 260/280 entre 1,8 e 2,0. Executando o ADN num gel de agarose é aconselhável para avaliar a sua qualidade.
	Proteína (s) a ser expresso não são estáveis ​​ou solúveis suficiente.	Teste diferentes construções em pequena escala antes de up-scaling as transfections. Certificar-se que as etiquetas não interfiram com a estrutura da proteína (s) de interesse.
Células olhar turvo e ter uma cor e / ou cheiro estranho.	As células são infectadas com bactérias ou leveduras.	Boa técnica de esterilização deve ser utilizado em todos os momentos. Fumigating as capelas de fluxo laminar e UV-desinfecção sala de cultura celular em caso de infecção ajuda contendo o problema.
As células têm baixa viabilidade.	PH errado na mídia.	Certifique-se que as culturas são cultivadas em 5-8% de CO 2em todos os momentos.
	As células foram cultivadas até uma densidade de mais de 3,0x10 6 células / ml.	As células não devem ser cultivadas até densidades acima de 2,5 x 10 6 células / ml, imediatamente antes de uma transfecção e nunca acima de 3,0 x 10 6 células / ml.
A purificação por afinidade não funcionou	Proteína (s) não está a ser expressa.	Veja acima.
	Condições de purificação pode estar errado.	Ajustar as condições de tampão (por exemplo, sal elevado, de baixa concentração salina, pH).

Tabela 1 Solução de problemas.

Sistema	Vantagens	Desvantagens
E. coli	Rápidosistema de expressão Elevados rendimentos proteicos Barato Indicado para a produção acessível de proteínas marcadas isotopicamente	Falta de chaperonas importantes que podem ser necessários para o dobramento das proteínas Falta de muitas modificações pós translacionais Podem não ter co-fatores que são importantes para a função da proteína e / ou montagem complexa.
P. pastoris	Pode executar a maioria das modificações pós-tradução Barato	Falta algumas modificações pós-traducionais Podem não ter co-fatores que são importantes para a função da proteína e / ou montagem complexa.
De expressão de baculovírus em células de insecto	Pode efectuar todas as modificações pós traducionais Baculovirus é menos citotóxica do que outras estirpes virais	Preparação do vírus para a transdução é demorado O vírus não é estável e não pode ser armazenada por longos períodos de tempo Células de inseto pode faltar co-fatores que são importantes para a função da proteína e / ou montagem complexa.
Biorreactores com sistemas de mamífero	Pode efectuar todas as modificações pós translacionais Pode fornecer todos os co-fatores necessários para a função da proteína e montagem complexa Can células de cultura em altas densidades Pode expressar todas as proteínas de mamíferos que exigem máquinas de dobrar complexos Rendimentos muito elevados de proteína	Requer pessoal especializado para usar o biorreator. Equipamento caro é necessária. Otimizando condição expressãos pode ser demorado.
As células em suspensão HEK 293F	Pode efectuar todas as modificações pós translacionais Pode fornecer todos os co-fatores necessários para a função da proteína e montagem complexa Pode expressar todas as proteínas de mamíferos que exigem complexa maquinaria dobrável Protocolo rápido e intuitivo transfecção Relativamente barata em comparação com biorreactores e / ou outros reagentes de transfecção disponíveis comercialmente.	Embora acessível, não tão barato como a expressão em bactérias

Tabela 2. vantagens e desvantagens dos sistemas de expressão principais.

Discussão

Desenvolvemos um método eficaz e simples de custo (PEI custa muito menos do que os reagentes de transfecção disponíveis comercialmente lipófilos) para a expressão e purificação de grandes quantidades de proteínas recombinantes e os complexos de múltiplas subunidades a partir de células de mamíferos. Transfecção óptima e a eficiência de expressão pode ser alcançada se o DNA de plasmídeo muito puro (260/280 entre 1,8 e 2,0), é usado em combinação com PEI como descrito na secção de protocolo. As células devem ser cultivadas em meios sérica e sem antibiótico, por conseguinte, uma técnica estéril é estritamente necessária para a passagem em células de transfecção e para evitar infecções dispendiosas e demoradas. A viabilidade das células deve ser de 90% ou superior, e as culturas não devem ser cultivadas a densidades superiores a 2,5 x 10 ⁶ células / ml, imediatamente antes de uma transfecção, pois isso irá reduzir o rendimento de proteína. Para a transfecção de sucesso, culturas deve conter apenas uma única célula ou divisão. Clusters podem ser quebrados pelo vigorous vórtex de 20 a 30 segundos (Figura 5). A proporção de cada um plasmídeo utilizado na co-transfecção pode ser variado pelo utilizador de acordo com a estequiometria do complexo ser estudado. A eficiência de expressão pode ser optimizado para a proteína de interesse, de modo que um tempo de expressão adequado pode ser estabelecida. A purificação devem ser realizadas mantendo a amostra fria proteína em todos os momentos para reduzir o risco de degradação proteolítica não desejado. A escolha de marcas e memórias intermédias de purificação é crítica, uma vez que podem interferir com os elementos estruturais ou locais activos de determinadas proteínas, resultando muitas vezes na solubilidade e / ou a perda de actividade enzimática reduzida. Transfecções pequena escala são particularmente úteis para testar diferentes construções para a purificação de grandes complexos de proteínas.

Hoje em dia, uma grande variedade de metodologias alternativas estão disponíveis para a expressão de proteínas eucarióticas recombinantes (Quadro 2). Por exemplo, Baculovirus de expressão em células de insecto é amplamente utilizado devido à sua elevada eficiência de transdução e a sua falta de toxicidade em comparação com outras espécies virais ^6. No entanto, o processo de fabrico do vírus é demorado e sua instabilidade não permite que o vírus a ser armazenado por longos períodos. Por outro lado, os sistemas de expressão de levedura oferece a possibilidade de as células a densidades muito elevadas de crescimento em culturas de fermentação, resultando em rendimentos elevados de proteína ^7. Mas ainda não têm toda a variedade de modificações pós-tradução necessárias para proteínas eucarióticas para dobrar correctamente e interagem com os seus parceiros de proteína. HDAC3, por exemplo, é expresso, mas não se dobra em E. coli. No entanto, quando expressa em células 293F, que foram capazes de purificar uma enzima activa num complexo com o seu co-repressor (SMRT) e uma molécula de inositol tetrafosfato (IP4) ^8, o qual não se encontra em células procarióticas. Este método também permitiu-nos a purificar e resolver o cristal Structure de HDAC1 interagindo com MTA1 no complexo NURD, a qual é igualmente activado pelo IP4 ^9. Idealmente, nós sempre gostaria de expressar proteínas eucarióticas em seu ambiente natural, fisiológico. Os sistemas de expressão de mamífero empregando células HEK 293-EBNA1 em biorreatores ^10-12 foram descritas e produzir níveis muito elevados de proteína, mas estas podem ser complexas.

O nosso método é uma alternativa simples e acessíveis a expressão em sistemas de bactérias, leveduras e biorreatores. O método de expressão é rápido e não requer o uso de equipamento caro, especialmente se o ambiente em frascos rotativos ou frasco é substituída com 5% de CO ₂ e agitam as incubadoras convencionais são utilizados. Usámos estes protocolos de co-transfectar vários plasmídeos e purificar complexos com até cinco proteínas com rendimentos de> 1 mg / L de cultura. Curiosamente, o sistema ajuda a identificação de complexos estáveis ​​bem comportados. Por exemplo, expressão do complexo binário de HDAC1 e deram rendimentos limitados Sin3A de proteína, mas a adição de SDS3 resultou em 5 vezes quantidades mais elevadas e, portanto, guia a biologia estrutural na escolha de construções adequadas e complexos estáveis ​​para cristalização.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células HEK 293F FreeStyle	LifeTechnologies	R790-07
FreeStyle 293 Expression Medium	LifeTechnologies	12338-018
Anti-FLAG M2 Affinity Gel	SIGMA	A220
Balão Erlenmeyer de 250 ml com tampa ventilada	Frascos Corning	431144
Roller com tampas ventiladas	Corning	01836-02
Polietilenomina, 25 kDa, ramificado	Sigma-Aldrich	408727	Faça estoques de 0,5 mg / ml em H2< / sub>O, ajuste o pH para 7,0 com HCl diluído e armazene a -20 - 4&�rdm; C
			de expressão de mamíferos
Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (DPBS)	Sigma-Aldrich	D8537
0,22 µ m Unidades de Filtro Centrífugo	Amicon	UFC30GV00
15 ml Filtros ultracentrífugos (corte de 10 kDa)	Amicon	UFC901008
Superdex  10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences	17-5175-01