Um In Vitro Modelo para o Estudo da Cellular Fisiopatologia em Globóides Leucodistrofia celular

Summary

As células globóides são uma característica patológica definidora da doença de Krabbe, uma leucodistrofia que atualmente carece de uma terapia eficaz a longo prazo. Desenvolvemos um modelo de cultura de células para estudar a biologia inata e o potencial patogênico da microglia ativada e sua transformação em células globóides.

Abstract

A função precisa da microglia multi-nucleadas, chamados de células Globóides, que são excepcionalmente abundantes no sistema nervoso central de leucodistrofia celular globoso (GLD) é incerto. Esta lacuna no conhecimento tem sido dificultada pela falta de um adequado modelo in vitro para o estudo. Relata-se um sistema de cultura glial murino primário em que o tratamento com resultados psicosina em multinucleações de microglia semelhantes às células Globóides características encontradas em GLD. Usando este novo sistema, que definiu as condições e modos de análise para o estudo de células Globóides. O potencial de uso deste sistema modelo foi validado em nosso estudo anterior, que identificou um papel potencial para metaloproteinases da matriz (MMP) -3 em GLD. Este novo sistema in vitro pode ser um modelo útil para estudar a formação e função, mas também a manipulação terapêutica potencial, destas células únicas.

Introduction

Leucodistrofia celular Globóides (GLD), também conhecida como doença de Krabbe, é uma doença desmielinizante fatal, resultante da perda de mutações de função no galatocerebrosidase (GalC) do gene ^1. A forma mais prevalente de GLD é a variante infantil que se caracteriza por início na infância e caracteriza-se por um curso clínico agressivo do motor e do declínio cognitivo, levando à morte prematura, muitas vezes antes dos cinco anos de idade ^2,3. O teste genético é utilizado para verificar o diagnóstico de GLD ^4. Neuropatologia da GLD revela desmielinização generalizada, atrofia neuronal, astrogliosis e presença de microglia multi-nucleadas ingurgitadas chamadas células Globóides ^5-7. A identificação de células Globóides, muitas vezes contendo inclusões tubulosas no seu citoplasma, tem sido uma característica de definição de GLD para os últimos 97 anos, embora a função específica destas células visíveis tem permanecido elusiva.

A participação das organizações não-myelinating glia (microglia e astrócitos) na patogênese da GLD tem sido considerada uma resposta secundária à profunda desmielinização nesta doença ^8. Curiosamente, a primeira descrição da doença, feita por Knud Krabbe em 1916 ^5, formação relatado dos fagócitos multinucleadas contendo detritos lipídica que foram nomeados 'Globóides células "e são uma característica desta doença.

Células Globóides são a característica marca de GLD patologia, apesar de seu papel na GLD tem sido ignorado. Curiosamente, estas células estão entre as primeiras alterações características no tecido do SNC de GLD. Esta falta de conhecimento pode ter sido devido à suposição de que a formação de fagócitos multinucleadas, chamadas de células gigantes em outras doenças, são normalmente considerados como uma consequência de uma patologia, em vez de uma força motriz patogénico inicial ^9. Portanto, há poucos estudos sobre os mecanismos pelos whicélulas Globóides ch são formados a partir de fagócitos, em particular no sistema nervoso central de GLD. O procedimento descrito no presente relatório centra-se na importância da formação de células Globóides no SNC e nossa manifestação anterior que multinucleações induzida por psicosina de microglia in vitro e essas células apresentaram níveis mais altos de atividade fagocitária. Consistente com essas observações, as células Globóides em cérebros Twitcher contêm freqüentemente detritos PAS-positivo, sugerindo níveis elevados de atividade fagocitária. Células Globóides também são encontrados para ser imunopositivas para ferritina (um marcador de microglia) ^10, KP-1 / CD68 (um marcador de monócitos), e alguns também são positivas para vimentina (uma proteína intermediária filamento e marcador de astrócitos e microglia ativada) ^11, HLA-RDa (um receptor da superfície MHCII), e TNF-α ^7, e Iba-1 (uma proteína de ligação de cálcio utilizado para identificar microglia) ^12. Com base neste conjunto de marcadores, células Globóides originam de microglia que desenvolvemum fenótipo original.

Apesar de sua singularidade, a função ea contribuição dos GCs para GLD patogênese específica tem sido largamente ignorado. Células Globóides ter sido pensado para ser uma consequência secundária de desmielinização crônica. No entanto, estudos anteriores examinaram a relação temporal de células Globóides para a patologia da substância branca de GLD identificaram a presença de células no final do Globóides embrionário para períodos de pós-natais; tempos que precederam a apoptose de oligodendrócitos e desmielinização evidente ^13. Assim, a sequência temporal do desenvolvimento da neuropatologia no GLD sugere que as células Globóides são formadas antes da desmielinização nesta doença ^14. Isto levou a nossa hipótese de que o início da formação de células Globóides em GLD pode representar um evento patogénico definindo, em vez de, uma resposta secundária a danos reactivo oligodendrócitos ^15. Além disso, a desregulação da atividade da microglia em GLD tem sido considerado um factor limitando a sua eficácia a longo prazo da terapia de células estaminais hematopeotic para tratar esta doença ^16. Assim, investigando as funções celulares e regulação da microglia e células Globóides, em resposta a psicosina deverá fornecer novos insights na patogênese da GLD.

Até recentemente, a falta de um modelo adequado para estudar a formação de células globoso limitou a compreensão da função e contribuição exacta destas células para a patologia de GLD. Em estudos recentes, foi determinado que as células-Globóides como pode ser formado em resposta directa a Psicosina, uma toxina lípido patogénico que se acumula em GLD. Descobrimos que a microglia, mas não macrófagos, são activadas e transformado em células Globóides em culturas gliais primários, em resposta a Psicosina ^15. Esta transformação em células Globóides foi encontrado para ser mediada pela protease extracelular, as metaloproteinases de matriz (MMP) -3 ^15. Mais recentemente,estenderam estas conclusões e determinou que microglia e Globóides células ativadas por psicosina desenvolvidos neste sistema in vitro modelo são potencialmente tóxicos para os oligodendrócitos e as células progenitoras de oligodendrócitos. Assim, quando considerado no contexto de GLD, a acumulação inicial de psicosina e formação de células Globóides anteriores à desmielinização apoiam um papel patogénico primário e eventualmente em microglias emergente para esta doença.

Propomos que o estudo da formação de células Globóides irá revelar novas informações sobre a patogenia da GLD que irá contribuir para a nossa compreensão da doença. Além disso, esse novo modelo de celular da GLD pode fornecer um novo formato a partir do qual novas abordagens terapêuticas para lidar com alterações patológicas esta doença poderia ser testada. Assim, neste relatório nós fornecemos um protocolo detalhado para o desenvolvimento in vitro de células Globóides induzida por psicosina de culturas primárias de células da glia não myelinating.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com a Política de Atenção Humanizada e Uso de Animais de Laboratório estabelecido pelo Office of Laboratory Animal Welfare (NIH) e somente com a aprovação do Comitê de Cuidados e Uso Animal Institucional (IACUC) da Universidade de Centro de Saúde de Connecticut.

1 Preparação de culturas mista glial

1. Esterilizar todos os instrumentos antes de usar. Adicione 3 mL de solução gelada estéril salina equilibrada de Hank (HBSS) contendo catiões não (Mg2 ⁺ ou Ca2 ⁺⁾ para 60 milímetros estéreis três placas de Petri mantidos em gelo para manter frio.
2. Isolar os córtices de pós-natais P0-P2 rato filhotes, como descrito anteriormente ^17,18.
   NOTA: As estruturas subcorticais, como o hipocampo, não estão incluídos nestas culturas.
3. Retire cuidadosamente as meninges e, em seguida, transferir os córtices isoladas de HBSS e dissociar os tecidos enzimática, utilizando um nekit dissecção dos tecidos ural de acordo com o protocolo do fabricante.
4. Placa as células em estéreis frascos T-175 e incubar durante a noite em meio [meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) contendo 1x penicilina / estreptomicina].
5. Substituir todos os meios de comunicação social no dia seguinte com meio fresco. Continue-se a incubar as culturas, com mudanças de meio regulares, durante cerca de 3 semanas ou até que uma monocamada celular é estabelecida.
   NOTA: Este monocamada será compreendido de astrócitos e microglia com cerca de 10: 1 ^19.

2. Globóides Indução celular em culturas mista glial

1. Prepare as lamelas revestidos de ECM.
   1. Soak lamelas circulares com ácido clorídrico 1 N estéril (HCl) em uma placa de Petri esterilizada, durante 30 minutos. Lavar 3x lamelas com água esterilizada e depois imersão em 95% de EtOH, durante pelo menos 20 min. e deixe secar ao ar.
   2. Coloque gotas de matr extracelular diluídomateriais ix (ECM) de revestimento de proteína sobre uma folha de Parafilm (por exemplo, 150-250 mL / gotícula da laminina de 10 ug / ml dissolvido em solução tampão de fosfato estéril [PBS]). Distribua as gotas para que lamelas não vai tocar quando colocada sobre essas gotículas. Delicadamente, coloque cada lamela seca em uma gota com a pinça.
   3. Deixe as lamelas sobre as gotas de aprox. 4-6 horas dentro da capa de cultura com a faixa fechada.
   4. Coloque as lamelas revestidas com MEC (revestido de ECM secundários acima) em cada um dos poços de uma placa de 24 poços. Lavar cada poço com 3 x PBS estéril e manter a 4 ° C até ser necessário.
2. Preparação da glia As células para plaqueamento em Lamelas.
   1. Aspirar a mídia das culturas gliais e lavar cuidadosamente as 3x monocamada gliais com 10 ml de PBS estéril. Em seguida, adicionar 8-10 ml de solução de tripsina-EDTA para o T-175, e incubar durante 5-10 min a 37 ° C.
   2. Quando a maioria da monocamada foi individual, adicionar 20 ml de meio completoao frasco para parar a tripsinização. Recolher os meios contendo as células isoladas num tubo de 50 ml e girar durante 10 min a 300 xg à temperatura ambiente.
   3. Aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento, e, em seguida, re-suspender as células em 2 ml de meio completo fresco pipetando suavemente a solução usando uma pipeta P1000.
   4. Determinar o número de células utilizando um hemocitómetro e, em seguida, re-suspender as células em meio completo com uma densidade desejada (por exemplo 10 ⁵ células / ml). Placa as células nas lamelas de cobertura revestidas com ECM (por exemplo, 500 ul em cada poço da placa de 24 poços). Adicionar meio completo fresco adicionais a cada poço para 3-5 dias de incubação a 37 ° C, ou até que as células crescer até à confluência desejado visual.
3. O tratamento com Psicosina.
   1. Reconstituir o psicosina a uma concentração de estoque (108,3 mM) em dimetil sulfóxido (DMSO). Diluir esse estoque em 100% EtOH para fazer um estoque de trabalho que pode on ser adicionado em cada poço da placa de 24 poços para atingir uma concentração final de 10 uM.
   2. No momento da adição do psicosina, agite suavemente a placa de cultura para misturar o psicosina em meios de cultura. Suplementar o psicosina adicionando o equivalente a 10 uM em dias alternados durante uma semana.
4. Após 7 dias de tratamento psicosina, recolher os meios de comunicação e de pipeta 500 mL de frio paraformaldeído 4% (PFA) em cada poço. Incubar à temperatura ambiente durante 20 minutos para fixar as células. Em seguida, lavar cada poço 3 vezes com PBS e, em seguida, manter as placas a 4 ° C até serem processadas para imunocitoquímica (ver abaixo).
   NOTA: meios de cultura de células podem ser recolhidas para enzimática ou ensaio ELISA, neste ponto, se desejado.

3. Imunocitoquímica (ICC) para visualizar Globóides Células

1. Substituir PBS com tampão [PBS + 0,3% de Tween-20 + 5% de soro normal de cabra (NGS)] de bloqueio, e incuba-se as células durante 1 h à temperatura ambiente.
2. EmCubate as células fixadas em anti-soros contra o primário Iba-1 [(1: 1000), diluído em PBS + 0,3% de Tween-20 + 2% de NGS] durante pelo menos 1 hora à temperatura ambiente, em seguida lavar cada poço com PBS 3 x 5 min / lavar.
3. Adicionar o anticorpo secundário conjugado de fluorescência adequado para identificar a marcação de anticorpos e anti-mancha principal com 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, 1: 1000) para identificar os núcleos. Incubar em solução de anticorpo secundário durante 1 h à temperatura ambiente e lava-se com PBS, 3x 5 minutos.
4. Monte cada lamela a lâminas de microscópio utilizando um meio de montagem. Exibir slides em um microscópio de fluorescência para análise visual e quantitativa.

4 Análise e caracterização de células Globóides em cultura primária

1. Use as três seguintes critérios morfológicos para identificar uma célula Globóides na cultura:
   1. Identificar células Globóides usando microscopia de fluorescência através da marcação imunoistoquímica para o marcador de microglia, Iba-1 +.
   2. IdentificarGlobóides como células polinucleadas (isto é, contendo dois ou mais núcleos positivos DAPI).
   3. Identificar células Globóides por uma morfologia arredondada distinta da aparência muito ramificado de descansar micróglias.
      NOTA: As células também podem ser recolhidos para análise de marcadores de superfície das células e quantificação por citometria de fluxo a partir de destas culturas.
2. Medir a ativação fagocitária de microglia e células Globóides
   1. Para avaliar a atividade fagocítica de microglia tratados com psicosina, adicione esferas de látex FITC identificados nos poços, de acordo com as instruções do fabricante. Adicionar pérolas de látex fluorescentes conjugados 48 horas antes da fixação com PFA. Corrigir as células tratadas com pérolas (como mencionado na seção 2.4), e processo para imunocitoquímica (como descrito na seção 3).
   2. Seleccionar anticorpos secundários fluoróforos de modo que eles não se sobreponham os espectros de emissão de fluorescência do fluoróforo às contas de rotulado.
   3. Analyze os perfis de fagoc�ica Iba-1 + microglia por identificação das células que co-localizados com os grânulos fluorescentemente marcado.
      NOTA: Psicosina ativará microglia. Grânulos fagocitados serão identificados dentro Iba-1 células mononucleares e multinucleadas + neste cenário cultura.

5. indução de células Globóides de culturas puras Microglial

Observação: Uma abordagem alternativa para decifrar a sinalização intercelular entre astrócito e microglia é outra vantagem deste modelo in vitro de células globoso. A purificação de células microgliais primárias para replating ou de co-cultura pode ser obtida pela sua propriedade de aderência inferior em cultura, tal como descrito nos passos seguintes (ver Secção 5.2).

1. Recolha a mídia das culturas gliais mistas confluentes em tubo de 50 ml e mantê-la a 37 ° C na incubadora.
2. Isolamento da microglia de culturas mista glial primários.
   1. Depois de remover a mídia de uma garrafa mista confluente T175 cultura glial, adicionar mídia agitação quentes [consistindo de mídia completo + 25 mM 4 (2-hidroxietil) -1-piperazina (HEPES) de bicarbonato de sódio + 25 mM (Sigma)]. Agitar os frascos durante 3-4 horas num agitador orbital a 100 rpm (37 ° C). Recolha os media destes frascos agitados em 50 ml tubos cônicos.
      NOTA: Este suporte vai incluir a microglia menos aderente dos frascos.
   2. Girar os meios de comunicação a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e voltar a suspender as células em 2 ml do meio condicionado de astrócitos (coletados na etapa 5.1).
   3. Estabelecer o número de células obtidas utilizando um hemocitômetro e depois a chapa micróglias em lamelas revestido de substrato (ver secção 2.1) para imunocitoquímica ou placa na ULTRALOW placas aderência bem para o futuro conjunto de células Globóides para co-cultura com outros tipos de células, tais como oligodendrócitos (como described na seção seguinte).
      NOTA: Uma vez banhado a microglia pode ser tratada com psicosina (10 mM), como descrito acima (ver secção 2.3).
3. Co-cultura com Primários Oligodendrócitos para Análise de citotoxicidade.
   NOTA: Recolha de microglia tratado psicosina das baixas para as placas de aderência subsequente co-cultura em culturas primárias de oligodendrócitos, ou células progenitoras de oligodendrócito, pode ser utilizado para examinar o potencial citotóxico função destas células-globoso, como in vitro.
   1. Desenvolver culturas de oligodendrócitos primário utilizando métodos estabelecidos ^18,20. Para recolher a microglia tratado psicosina, pipetar suavemente para separar as células fracamente aderentes a partir do fundo dos poços. Recolher as células, centrifugar a 300 xg durante 10 min, e em seguida ressuspender cuidadosamente em meios de diferenciação de oligodendrócitos [composto de meios Neurobasal, L-glutamina (1x), B-27, suplemento (1x) e triiodotironina (T3, 10 ng / mL )].
   2. Conte o número de células utilizando um hemocitómetro e as sementes, em seguida, para a cultura de microglia oligodendrócitos a 1 x 10 ⁵ células / ml, resultando num aproximada proporção de 1: 2 a microglia / oligodendrócito. Incubar como uma co-cultura durante 3 dias.
   3. Fixar as células para imunocitoquímica (ver secção 2.4). Recolhe meios de cultura de células para o ELISA ou análises químicas, conforme necessário.

Results

Este protocolo, como está escrito, deverá ter cerca de 36 dias para ser concluído do início ao fim (veja a Figura 1: Esquema de Fluxo de Trabalho Experimental). Tem sido nossa experiência que o desenvolvimento de células "Globóides-like 'neste sistema de cultura primária é confiável e reprodutível: a formação de células multinucleadas em resposta a psicosina é observado de forma consistente com 7 dias de tratamento.

Coloração imunocitoquímica de microglia usando Iba-1 em con...

Discussion

O protocolo aqui descrito fornece um novo sistema modelo para estudar o desenvolvimento e caracterização funcional de microglia ativados e células Globóides. Trabalhos anteriores por Im et al. utilizando uma linha celular HEK293 fornecido um modelo para o desenvolvimento do presente protocolo para o estudo da formação de células globoso ^21. É também importante salientar que as células derivadas Globóides no modelo diferem das células nativas Globóides identificáveis ​​em GLD. Por exemplo, temos obser...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hank' s solução salina balanceada (HBSS) sem cátions (Mg2+ e Ca2+).	Life technologies	14175-095
Kit de Dissociação de Tecido Neural	Miltenyi	130-092-628
40 μ m filtro de células	Fisherbrand	22363547
Hank' s solução salina balanceada (HBSS) contendo cátions (Mg2+ e Ca2+).	Gibco	14025-092
Meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM)	Soro fetal bovino Gibco	11995-065
(FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
Penicilina/Estreptomicina	Life technologies	15070-063
Laminina	Sigma	L2020
Solução de tripsina-EDTA	Life technologies	25299-056
Psicossina	Sigma	P9256
Dimetil sulfóxido (DMSO)	Sigma	D2650
Paraformaldeído (PFA)Ciência da	Microscopia Eletrônica	19208
Soro de Cabra Normal (NGS)	Invitrogen	PCN5000
Iba-1	WAKO	019-19741
Alexa Fluor conjugado Antisera	Life Technologies	Vários
de montagem	Southern Biotech	OB100-01
Kit de ensaio fagocítico	Cayman Chemicals	500290
HEPES	Sigma	BP310-500