Coleção, isolamento e Citometria de Fluxo de Análise de Amostras endocervix Humano

Resumo

O uso de amostragem em escova citocitária para coletar linfócitos e monócitos da endocérvice é uma técnica minimamente invasiva que fornece amostras para análise da imunidade do trato genital feminino. Neste protocolo, descrevemos a coleta de amostras de cytobrush e o isolamento de células imunes para ensaios de citometria de fluxo.

Resumo

Apesar da importância dos patógenos da mucosa para a saúde pública (incluindo o HIV), relativamente pouco se sabe sobre a imunidade da mucosa, particularmente no trato genital feminino (FGT). Como a transmissão heterossexual agora representa o mecanismo dominante de transmissão do HIV, e dada a disseminação contínua de infecções sexualmente transmissíveis (DSTs), é fundamental entender a interação entre hospedeiro e patógeno na mucosa genital. As lacunas substanciais no conhecimento sobre a imunidade ao FGT são parcialmente devidas à dificuldade em coletar e processar amostras de mucosa com sucesso. Para facilitar estudos com tamanho amostral suficiente, as técnicas de coleta devem ser minimamente invasivas e eficientes. Para tanto, foi otimizado um protocolo para a coleta de amostras de escova citográfica cervical e posterior isolamento de células mononucleares cervicais (CMC). Usando imunofenotipagem baseada em citometria de fluxo ex vivo, é possível quantificar com precisão e confiabilidade as frequências e fenótipos da população de linfócitos/monócitos CMC. Essa técnica pode ser acoplada à coleta de lavagem cérvico-vaginal (CVL), que contém mediadores imunológicos solúveis, incluindo citocinas, quimiocinas e antiproteases, que podem ser usadas para determinar o ambiente anti ou pró-inflamatório na vagina.

Introdução

A maioria das novas infecções pelo HIV em todo o mundo surgem através de transmissão heterossexual, com as mulheres representando 47% das novas infecções em 2011 (UNAIDS ^1). Compreender o trato genital feminino (FGT), um dos principais portais de entrada para o HIV e outros patógenos sexualmente transmissíveis, é de grande importância no caminho para encontrar estratégias eficazes para prevenir a infecção. As respostas imunitárias a mucosa genital são claramente único e diferem dos que foram medidos no sangue periférico ^2. No entanto, o conhecimento atual sobre a dinâmica do sistema imunológico no FGT é limitada na melhor das hipóteses. Até o momento, os estudos sobre o ambiente imune da mucosa em grande parte focada nos tecidos linfóides associados ao intestino (GALT), onde se tornou claro que os primeiros eventos em tecidos da mucosa após a infecção ter um forte impacto na posterior progressão da doença ^3,4. A recolha de amostras a partir da mucosa genital representa um grande desafio e é pelo menos parcialmente responsável pela lack de compreensão da imunologia da FGT. Resolvendo o quebra-cabeça da dinâmica imunológico entre o hospedeiro eo agente patogénico no contexto do ambiente distinto que é o FGT necessita de métodos eficientes para a coleta e análise de amostras a partir desta localidade.

A FGT está dividido em duas partes: a parte superior do tracto reprodutivo, que inclui os tubos de Falópio, endométrio e endocervical, e do tracto inferior, o qual contém o ectocérvix e da vagina (revisto por Kaushic et al, ^5). Não é ainda claro que a contribuição relativa de diferentes locais é a infecção pelo HIV, mas acredita-se que ambos os locais poderiam contribuir para a entrada do VIH ^6. As células T representam 40-50% dos leucócitos do trato reprodutivo superiores e inferiores, enquanto que os macrófagos representam cerca de 10% (revisto em Rodriguez-Garcia et al ^2). As células T podem ser detectadas na vagina, colo do útero, endométrio e. Os macrófagos são mais fortemente localized no endométrio e miométrio tecido conjuntivo do que o colo do útero, embora possam ser detectados em ambos os tecidos. Finalmente, as células dendríticas plasmacytoid (PDCs) e as células de Langerhans pode também ser detectada em tecidos FGT. O fenótipo e proporções de populações do sistema imunológico e a sua susceptibilidade à infecção por HIV pode variar de acordo com os ciclos importante hormonais, o uso de contraceptivos hormonais, a vaginose bacteriana ou actividades sexuais ^5,7-9.

Diversos métodos foram desenvolvidos para estudar as populações imunes e Meio Ambiente da FGT. Biópsia do colo do útero, colo do útero e cytobrushes lavagens cérvico-vaginais (CVL) ^10-12 são os mais comumente usados ​​em literatura. Coleção CVL por PBS lavagem é o método mais simples e permite o estudo de proteínas moduladoras do sistema imunológico, mas os resultados no rendimento extremamente baixo da pilha, e não é, portanto, adequado para estudar as populações de células imunes do FGT ^13. CVL amostras são, por outro lado, vEry útil para avaliar o ambiente imunológico do FGT medindo a expressão de diversas citocinas, quimiocinas e factores anti-microbianos, utilizando métodos tais como ELISA, citocina talão de matriz ^14, ou espectrometria de massa de ^15,16. Caracterização das frequências de células imunitárias, fenótipos e funções pode ser alcançado através da recolha de células mononucleares do colo do útero (CMC) por cytobrush cervical ou por amostragem de biopsia cervical.

Amostragem de biopsia cervical é um método invasivo, que aumenta o desconforto e risco de hemorragia e leva de 2 a 11 dias para curar seguindo o procedimento de acordo com o estado imunitário do mulher ^12. Por outro lado, cytobrushes cervicais, apesar do rendimento mais baixo de células recolhidas, é um método menos invasivo e mais conveniente para recolher células do sistema imunológico do FGT. Ambos os métodos podem atingir o mesmo rendimento de leucócitos CD45 +, mas dois cytobrushes cervicais sequenciais são necessárias para se obter a mesma quantidade de células continha in uma biópsia ^13. No entanto, a amostragem cytobrush ainda fornece um número aceitável de células (cerca de 5.000 células CD45 + / cytobrush) para posterior ex vivo fenotipagem por citometria de fluxo ^14. Além disso, a caracterização funcional pode ser levada a cabo com as amostras, tal como a estimulação do fluxo intracelular e citometria de qPCR ou ter sido realizada utilizando derivados de CMC cytobrush para identificar as respostas imunitárias específicas para o HIV ¹⁷ ou polarização celular Th ^18. Expansão da população de células T podem também facilitar estudos funcionais com CMC ^19.

É importante notar que as biópsias e cytobrushes amostra porções distintas do FGT. As biópsias são derivados a partir da porção superior do epitélio e estroma da ectocérvix ^12,13, enquanto cytobrushes cervicais amostra do orifício cervical, recolhendo as células derivadas do epitélio endocervical e presumivelmente da zona de transformação. Portanto amostras cytobrush provar uma região composto por uma única camada de epitélio, enquanto que as biópsias, incluem uma região revestida por um epitélio escamoso estratificado ^5. Como resultado, a natureza das populações de leucócitos recolhidos por biopsia cervical e cytobrush difere. Biópsias recolher uma proporção mais elevada de células T CD3 +, ao passo que cytobrushes resultam na recolha de uma maior proporção de monócitos CD14 + / macrófagos ^13.

O estudo da imunologia da FGT tem havido um interesse por muitos anos ^20-22 e temos acumulado uma grande quantidade de conhecimentos com o estudo da CMC derivados de cytobrush. Nossos estudos se concentram principalmente no estudo do HIV-infectados, não infectados e expostas ao HIV soronegativos (HESN) profissionais do sexo de Nairobi, no Quênia. VIH replica preferencialmente em células T activadas ²³ e inferior do número de células activadas que podem ser alvo de HIV no FGT poderiam contribuir para a protecção contra a infecção pelo VIH. Em linha com esta hipótese, vários studies descreveram ativação imune menor entre os trabalhadores do sexo HESN que estão altamente expostos ao HIV ainda permanecem não infectados ^24,25, e este fenótipo quiescente também é observado no FGT ^14. Aqui, descrevemos a metodologia para o processamento e avaliação de ativação de células T em amostras de CMC derivadas cytobrushes cervicais por ex vivo citometria de fluxo.

Protocolo

Declaração de ética: a ética conselhos de administração da Universidade de Manitoba e Kenyatta National Hospital / Universidade de Nairobi de pesquisa aprovado este estudo e consentimento informado foi obtido de todos os participantes do estudo.

1. Preparação de Mídia e CMC Coleção Tubes

1. Preparar a solução (PBS) (NaCl 137,93 mM, KCl 2,67 mM, 8,1 mM de Na ₂ HPO _4, 1,47 mM, KH ₂ PO ₄₎ tampão fosfato salino. Autoclave para esterilidade. Este pode ser armazenado a 4 ° C durante vários meses.
2. Pré-alíquota de 5 ml PBS em 50 ml tubo falcon (uma por amostra a ser coletado) e armazenar a 4 º C até o tempo de coleta de amostras.
3. Rotular 2-4 criotubos ou 1,5 ml microtubos por amostra para coletar lavagem para armazenamento.
4. Preparar meios de cultura celular: RPMI 1640 + 1% de penicilina / estreptomicina / anfotericina B (concentração final de 100 unidades / ml, 100 ug / ml e 250 ng / ml, respectively, sem FCS / FBS acrescentou.

2. Coleta de Amostras cytobrush

Coleta de amostras cytobrush é um procedimento não-invasivo, que deve ser realizada por um médico ou ginecologista treinado.

1. Coletar células mononucleares do colo do útero (CMC) usando tanto um cytobrush e um raspador de madeira ou de plástico. Colete CMC do participante sob exame especular, inserindo o raspador e girando ao redor do orifício cervical (Figura 1). Insira o cytobrush no SO endocervical, gira 360 ° e coloque imediatamente tanto o cytobrush e raspador no tubo falcon 50 ml contendo 5 ml de PBS.
2. Manter as amostras em gelo / a 4 º C até o processamento. Para manter a viabilidade celular, amostras de processos dentro de 2 horas da coleta.
3. Se possível, coletar amostras de sangue compensadas em top vacutainers heparina verdes para células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de isolamento para servir como um comparador / controle para análise CMC.

3. Isolamento de CMC

Executar o processamento de amostras em um laboratório de biossegurança nível 2, em uma cabine de segurança biológica estéril com luvas duplas.

1. Durante a coleta, as amostras de CMC podem ser contaminados com sangue. Excluir amostras com contaminação de sangue visível a partir do estudo, a fim de evitar a inclusão de confusão de PBMC na amostra final. Devido ao baixo número de linfócitos isolados a partir de amostras de CMC, contaminação sanguínea menor pode facilmente sobrecarregar o componente de linfócitos CMC.
2. Tubos Vortex falcon contendo tanto o cytobrush e raspador para 45 seg dissociar células das escovas. As amostras podem tornar espumoso durante este processo; isso é normal.
3. Use o cytobrush para raspar qualquer material restante fora do raspador, e descartar o raspador em uma solução de água sanitária. Para coletar as células continuem ligadas ao escova / raspador, use uma luva fresca para espremer o raspador entre o polegar eo indicador.Deslize a escova, permitindo que as células e PBS a ser recolhidos no mesmo tubo de 50 ml. Descarte o cytobrush em uma solução de água sanitária, e descarte a luva.
   IMPORTANTE: Use uma luva nova para cada amostra.
4. Instale um filtro de células 100 mm de nylon para um novo tubo de 50 ml falcão. Usando uma pipeta de transferência, recolher a suspensão PBS-célula do tubo de amostra e filtra-se através do filtro para dentro do tubo fresco.
5. Adicionar 5 ml de meio RPMI 1640 para o tubo de amostra original. Utilizando a pipeta de transferência, lavar os lados do tubo de ensaio com o meio RPMI, e transferir através do filtro para o novo tubo de recolha. Lava-se a parte inferior do filtro de nylon, com o meio RPMI bem.
6. Centrifugar as amostras durante 10 min a 514 x g. É crucial para deixar o freio de centrifugação, durante este passo, a fim de evitar desalojamento do sedimento CMC.
7. Remova cuidadosamente o sobrenadante do tubo, tomando cuidado para não perturbar o sedimento. Tamanho da pelota será altamente variável; no modome amostras, o sedimento é muito grande, devido à presença de grandes números de células epiteliais, enquanto em outros casos, a pelete é pouco visível e altamente transparente.
8. Ressuspender o sedimento por agitação suave do tubo falcon. Adicionar 5 ml de PBS para lavar a amostra.
9. Centrifugar novamente durante 10 min a 514 x g sem travão de centrifuga.
10. Cuidadosamente descarte do sobrenadante e re-suspensão da pelota como acima. As células estão prontas para qualquer criopreservação (usando um protocolo de criopreservação PBMC), a estimulação ou citometria de fluxo fenotipagem.

4. CMC manchas na superfície e Citometria de Fluxo

1. Ressuspender o sedimento do passo de 3,10 em 100 ul de solução de bloqueio e transferir quer numa placa de 96 poços ou de tubo de FACS. A solução de bloqueio (para bloquear os receptores Fcy) receita é como se segue: 1,8 ul de IgG (concentração final de 0,2 ug / ul), 5 ul de FBS e 93,2 ul de lavagem de FACS (PBS 2% de FBS).A coloração pode ser realizada em uma placa de 96 poços que os tamanhos de aglomerados são suficientemente pequenas, mas podem precisar de ser realizada em tubos de FACS se pelotas são rotineiramente grande. É importante para a titulação de anticorpos em conformidade.
2. Bloquear as amostras durante 10 min em gelo / a 4 ° C.
3. Lavar as células com 100 ul de FACS de lavagem (PBS 2% de FBS) em placas de 96 poços, ou 500 ul em tubos de FACS. Centrifugar a 600 xg por 10 minutos a 4 ° C com o freio baixo (ou fora, se um nível baixo de freio não estiver disponível).
4. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células por agitação. Adicionar Stain viabilidade (corante de viabilidade solucionáveis ​​Morto Live). Prepare corante de viabilidade de acordo com as instruções do fabricante. Ela pode necessitar de ser ajustada para uso em cada configuração de laboratório / citómetro. Incubar durante 30 min no escuro a 4 ° C.
5. Lave as células 100 μl/500 ul de PBS (para tubos de placa / FACS de 96 poços). Centrifugar a 600 xg por 10 min com baixo / nenhum freio. Remover supernatant e ressuspender as células.
6. Incubar as células com o cocktail de anticorpos de marcadores de superfície, num volume total de 100 ul. IMPORTANTE: Otimizar e titular cada citometria de fluxo do painel antes de provar coloração. Incubar as células durante 30 min no escuro a 4 ° C.
7. Repita o passo 4.5. Se a coloração em uma placa de 96 poços, as células de transferência para um tubo de FACS e diluir para um volume final de 750 ul de FACS de lavagem contendo 1% de paraformaldeído (PFA) (ou Cytofix, diluídos 1 para 4). Continuar a aquisição de dados em um citómetro de fluxo.

5. Coleta e Preparação de colo do útero Vaginal Lavage (CVL)

1. Antes da amostragem cytobrush, utilizar uma seringa, para lavar o endocérvix com 2 ml de PBS estéril e aspirar a lavagem do saco posterior.
2. Colete a amostra do lavado aspirado em um tubo falcon de 15 ml e manter em gelo / a 4 º C até o processamento.
3. Amostra Centrifugar a 400 g durante 7 min para remover os restos celulares.
4. Collect o sobrenadante, alíquota da amostra em 1 ml ou 500 mL alíquotas e armazenar a -70 ° C. As alíquotas podem ser descongelados para ELISA ou análise disposição talão de proteínas CVL, mas evite múltiplos ciclos de congelamento / descongelamento.
5. Se desejado, ressuspender o sedimento de restos celulares em ARN Posterior para medir a expressão de ARN seguindo o protocolo do fabricante.

6. Aquisição de Dados

1. Preparar um conjunto de tubos de compensação que corresponde painel de anticorpos. Execute os tubos de compensação para ajustar sobreposição espectral. Execute as amostras de qualquer fluxo multicolor citômetro que está configurada para os anticorpos conjugados com fluorocromos utilizados no painel.
2. Adquirir uma amostra PBMC primeiro para ajustar Forward Scatter (FSC) e Side Scatter tensão (SSC), a fim de detectar a população de linfócitos. Tente mantê-los em 100 em cada eixo em uma escala linear. Executando um controle PBMC irá facilitar significativamente para encontrar a população de linfócitos CMC.
3. O limiar do FSC para amostras de CMC pode precisar de ser aumentada relativamente a amostras de PBMC devido a manchar-se o eixo de SSC a baixos valores de FSC.
4. Vortex cada tubo antes de adquirir. Adquirir todo o tubo para maximizar o número de eventos de porta de linfócitos recolhidos. Monitore a máquina com cuidado para evitar entupimento.
5. Exportar os dados em um programa de análise por citometria de fluxo, tais como FlowJo.

7. Estratégia de propagação

1. Selecione Encaminhar dispersão lateral elevada (FSC-H) / área de dispersão lateral para a frente (FSC-A) para determinar a população singlet.
2. Selecione Tempo contra marcador fluorescente (como exemplo FITC) para controlar a qualidade da aquisição. Alteração da taxa de fluxo pode introduzir artefatos nos dados. Excluir qualquer área que mostra discrepância na taxa de fluxo.
3. Identificar a população de linfócitos em SSC-A/FSC-A trama. Use um controle PBMC para facilitar a identificação. Note-se que a população de linfócitos CMC pode não ser tão clara como o controle PBMC.
4. Portão em SSC-A/viability tingir para excluir as células mortas de células vivas. As células mortas pode não especificamente incorporar os anticorpos, que vai introduzir artefatos.
5. Porta na SSC-A/CD3 para identificar a população de células T. Deste portão, identificar as populações de células CD4 + e CD8 +.

Resultados

Citometria de fluxo Multi é uma poderosa ferramenta para dissecar os fenótipos e funções de subpopulações de células em tecidos previamente descaracterizados. Análise de amostras de CMC pode render informações sobre ambos linfócitos e monócitos populações com as estratégias de propagação apropriados.

Uma estratégia de propagação CMC representativo, em comparação com um perfil combinado de PBMC, é mostrada na Figura 2. O FSC-A versus FSC-H trama permite a exclusão de dupletos...

Discussão

Dadas as grandes lacunas de conhecimento no que diz respeito à imunidade no trato genital feminino (FGT), análise fenotípica de CMC pode fornecer uma ampla gama de conhecimentos em várias populações linfocitárias no colo do útero. Juntamente com análise proteômica e medições da carga viral no lavado cervical, imunidade a infecções sexualmente transmissíveis (IST) s e outros patógenos pode ser dissecada em várias populações.

Considerações técnicas - CMC: O isolamento ea color...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
100 μ filtro de células m para tubo Falcon de 50 ml	BD	352360	processamento CMC
RPMI 1640	Hyclone	SH30027.01	processamento CMC
Soro bovino fetal	Tecnologia de vida	16000044	processamento de CMC
Fungizone	Tecnologia de vida	15290-018	Processamento de
penicilina/estreptomicina	Sigma	P4333-20ml	Processamento CMC
Tubo Falcon de 50 ml	Fisher	14-959-49A	Processamento CMC Pipeta
de transferência descartável para banco de sangue	Fisher	13-711-6M	Processamento CMC
Cytobrush plus	Cooper cirúrgico	C0121	Amostragem CMC
Raspador cervical descartável	Amostragem médica rápida	2183	CMC
15 ml Tubo Falcon	Fisher	14-959-70c	Processamento CVL tubo de
1,5 ml Eppendorf	Fisher	05-402-18	Armazenamento
CBL LIVE/DEAD Kit de coloração de células fixáveis	Invitrogen	Reagente	citometria de fluxo
Tampão de fixação (4% PFA)	BD	554655	Citometria de fluxo regeante
IgG camundongo Sigma		I8765	Regeant de citometria de fluxo