Isolamento de proteínas a partir da Embryonic Rato Coração Região Válvula Desenvolvimento

Resumo

A análise da expressão de proteínas em válvulas embrionárias jovens de camundongos foi dificultada pelo tecido limitado disponível. Este manuscrito fornece um protocolo para preparar proteínas a partir de regiões de válvulas embrionárias de camundongos em desenvolvimento para análise de western blot.

Resumo

A análise de Western blot é uma técnica comumente empregada para detectar e quantificar os níveis de proteína. No entanto, para pequenas amostras de tecido, este método de análise pode não ser suficientemente sensível para detectar uma proteína de interesse. Para superar essas dificuldades, examinamos protocolos para obter proteína de válvulas cardíacas humanas adultas e modificamos esses protocolos para os primeiros embriões em desenvolvimento de camundongos embrionários. Em resumo, as regiões da válvula aórtica embrionária de camundongo, incluindo a válvula aórtica e a parede aórtica circundante, são coletadas no volume mínimo possível de um tampão de lise baseado em Tris com inibidores de protease. Se necessário, com base na estratégia de reprodução, os embriões são genotipados antes de agrupar quatro regiões embrionárias da válvula aórtica para homogeneização. Após a homogeneização, um tampão de amostra baseado em SDS é usado para desnaturar a amostra para execução em um gel SDS-PAGE e subsequente análise de western blot. Embora a concentração de proteína permaneça muito baixa para quantificar usando ensaios de quantificação de proteínas espectrofotométricas e tenha amostra restante para análises subsequentes, essa técnica pode ser usada para detectar e semiquantificar com sucesso proteínas fosforiladas via western blot de amostras agrupadas de quatro regiões embrionárias da válvula aórtica de camundongo dia 13,5, cada uma das quais produz aproximadamente 1 μg de proteína. Esta técnica será benéfica para estudar a ativação da via de sinalização celular e os níveis de expressão de proteínas durante o desenvolvimento inicial da válvula embrionária do camundongo.

Introdução

Ser capaz de identificar e quantificar os níveis de expressão de proteínas é uma técnica padrão para sanidade animal e experimentos baseados em células. No entanto, apesar de um interesse de longa data no início do desenvolvimento embrionário da válvula cardíaca, avaliando a expressão da proteína neste tecido específico durante o desenvolvimento está actualmente limitada a imunohistoquímica, tanto a garota e rato ^1,2. Parte da dificuldade de se quantificar a expressão da proteína nas válvulas de desenvolvimento da maioria dos organismos-modelo (por exemplo, grão e do rato) é o tamanho pequeno das válvulas, o que limita a quantidade de proteína que pode ser obtida. Assim, para análise quantitativa, os pesquisadores geralmente dependem de extração de RNA e amplificação por PCR quantitativa ou posterior análise microarray ^2-5. No entanto, RNA e proteína níveis de expressão não são totalmente correlativo ^6, portanto, com foco na expressão do RNA não pode fornecer uma explicação rigorosa das inúmeras mudanças que ocorrem em qualquer sinalizaçãocaminho em vários momentos durante a evolução. Com base neste limite na metodologia actualmente disponível, o objectivo deste procedimento é de desenvolver um protocolo para a obtenção de forma fiável uma quantidade suficiente de proteína a partir das regiões de rato embrionário de válvula cardíaca em desenvolvimento para a análise quantitativa das alterações que ocorrem em diversas vias de sinalização que são importantes em a maturação deste tecido.

As válvulas são normalmente já embrionárias dissecados a partir de ratinhos para isolamento de ARN e a análise da expressão do gene posterior ^2-5. No entanto, estes estudos têm sido limitados a usar a expressão do gene como ler-out de sinalização da ativação da via, que não permite a detecção de detectar modificações pós-traducionais de proteínas que podem afetar a sinalização a jusante. Usando as técnicas de isolamento de RNA como um ponto de partida, que começou com dissecando as regiões de interesse. Porque o nosso interesse foi detectar proteínas fosforiladas que eram indicativos de sinalização patatividade HWAY durante um período específico de desenvolvimento da valva aórtica (E13.5-14.5), realizamos todas as dissecções em tampão Tris livre de fosfato e recolheu as válvulas em um tampão de lise baseada em Tris com inibidores da protease e fosfatase. No nosso caso, apenas as regiões de válvulas aórticas foram recolhidas, mas a região da válvula pulmonar pode ser facilmente obtida ao mesmo tempo. As regiões valvares, foram homogeneizadas e combinado com um tampão de amostra que está sendo usado para estudar a expressão da proteína em válvulas cardíacas adultas ^7. Usando pequenos volumes de amostras (por exemplo, 2 mL) e reunindo regiões de válvulas a partir de embriões com o mesmo genótipo, fomos capazes de detectar proteínas fosforiladas e não fosforilado no dia embrionário 13,5 ^8. Porque as regiões da válvula podem ser congeladas e armazenadas em tampão de lise, os embriões podem ser genotipados se necessário antes agrupamento.

Esta técnica amplia o conjunto de ferramentas que estão disponíveis para avaliar signalin celularg vias durante o desenvolvimento e fornece um elogio quantitativo de imuno-histoquímica, especificamente para as válvulas cardíacas em desenvolvimento. Esta técnica deve ser um benefício não só para os cardiologistas de desenvolvimento, mas também a todos os biólogos do desenvolvimento que trabalham com embriões em estágio inicial está interessado em regiões que contêm tecido limitado.

Protocolo

NOTA: Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill.

1 Imposto de Válvula Aórtica

1. Usando uma técnica de eutanásia aprovado para o estágio embrionário de interesse, a eutanásia um ratinho grávida com crias no dia embrionário desejado (E) de desenvolvimento.
2. Usar 70% de etanol para esterilizar o abdómen da mulher grávida. Levante a pele e músculos do abdômen inferior para cima e longe dos órgãos internos, e dissecar cavidade abdominal inferior aberta da fêmea para permitir o acesso ao corno uterino.
3. Para recuperar o corno uterino, manter o colo do útero com uma pinça e caudal cuidadosamente cortadas para a pinça. Levante o corno uterino, o corte de qualquer tecido conjuntivo que mantém o chifre no local, e concluir a remoção por corte da junção do corno uterino com a tuba uterina.
4. Coloque o corno uterino dissecado em uma placa de Petri contendo cold 0,1 M de tampão Tris (pH 7,6) e enxaguar, conforme necessário. Em seguida, corte o corno uterino aberto longitudinalmente para expor os sacos embrionários.
5. Para expor o embrião, cortar abrir um saco embrionário na junção da placenta e o embrião e o corte dos vasos umbilicais para libertar o embrião. Inserir o embrião dissecados numa segunda placa de Petri com frio de tampão Tris 0,1 M. Voltar a primeira placa de Petri com os restantes embriões não dissecado para gelo até estar pronta para a próxima embrião.
6. Para melhorar o acesso da parede torácica dentro do embrião, decapitar o embrião. Se genotipagem é necessário, remover e guardar um pedaço tecido extra em um tubo Eppendorf colocado no gelo.
7. Inserir o embrião em sua volta, e cortar a parede do peito verticalmente ao longo do lado da caixa torácica, perto de uma pata dianteira, e horizontalmente por cima do diafragma para visualizar o coração. Em seguida, abra a parede torácica para expor o coração.
8. Utilizando uma pinça para segurar alta ao longo dos grandes vasos, levante o coração usando uma pinça e cortar os vasos abaixo. An, corte acima do fórceps para libertar o coração. Se os vasos pulmonares permanecem não cortados, os pulmões podem ser removidos com o coração e deve ser removido antes de continuar.
9. Cortar e remover a artéria pulmonar acima do nível da válvula; nos estágios embrionários aqui descritos, a artéria pulmonar é ligeiramente opaca, o que ajuda na sua discriminação da região da válvula. Cortar logo abaixo da válvula pulmonar, evitando o miocárdio ventricular trabecular e recolher como descrito no passo 1.10, se esta região é também de interesse. Aqui e no passo seguinte, utilizar acção capilar para extrair o excesso de tampão Tris para longe da região de interesse antes da recolha em tampão de lise.
10. Cuidadosamente remover a aorta distai na válvula aórtica, imediatamente acima do nível da válvula; como a artéria pulmonar, a aorta permanece ligeiramente opaca nestes estágios embrionários, auxiliando na sua remoção. Corte logo abaixo da válvula aórtica, novamente evitando o miocárdio ventricular trabeculado e transferir oválvula utilizando uma pinça para um tubo de Eppendorf com um tampão de lise 2 ul (descrito na tabela de Materiais) contendo inibidores de protease e fosfatase em gelo.
11. Repita os passos 1,6-1,10 até as válvulas foram excisadas a partir de todos os embriões, recolhendo cada válvula num tubo de Eppendorf separados. Se todos os embriões têm o mesmo genótipo, todas as válvulas podem ser coletadas em um único tubo de Eppendorf.
12. Se a genotipagem é para ser realizado para determinar quais as válvulas para reunir, colocar imediatamente as amostras em tampão de lise a -80 ° C até à sua utilização. As amostras podem em seguida ser combinadas, após a genotipagem (passo 2.1.1).

Extracção de Proteína 2.

1. Descongelar tecidos colhidos em gelo e centrifugar a 13100 xg durante 1 minuto para recolher os tecidos em tampão de lise, na parte inferior do tubo.
   1. Se os embriões foram genotipados, use uma pipeta para coletar suavemente e pool de buffer de lise contendo as regiões de válvulas a partir de embriões com genótipos similares. Para garantir uma forte be, reunindo 3-4 regiões de válvulas a partir de embriões E13.5 é recomendado por exemplo.
   2. Se todos os embriões eram do mesmo genótipo e todas as regiões de válvulas foram colhidas em conjunto no passo 1.10, lisar a totalidade da amostra, tal como descrito na etapa 2.2.
2. Verificar o volume da amostra combinada resultante e adicionar tampão de lise para um volume total de 40 ul; então, interromper e homogeneizar amostras utilizando cinco milímetros esferas de aço inoxidável em tubos Eppendorf. Operar o lyser para 2-4 min a 50 Hz, de acordo com as instruções do fabricante. Tubos girar rapidamente, (~ 13.100 xg por 1 min) e de transferência de amostras para novos tubos, deixando para trás os escombros insolúvel.
3. Preparar e amostras separadas para SDS-PAGE e transferência para a subsequente análise de mancha de Western, seguindo um protocolo tal como Eslami et ^{al, 9.} Blotting para uma proteína de controlo de carga é essencial para a quantificação de proteínas.

Resultados

Usando esta técnica de preparação, nós fomos capazes de detectar fosforilada Smad ^1,5,8 (pSmad) nas regiões única válvula aórtica de E13.5 embriões. Como mostrado na Figura 1A, a proteína isolada a partir de mesmo uma única região de válvula é capaz de detectar uma banda pSmad fraco. A intensidade de sinal aumenta proporcionalmente com o número de regiões de válvula, que são reunidas. É importante notar que a relação pSmad / β-actina permanece quase constante entre os diferentes tamanhos de a...

Discussão

A capacidade de quantificar os níveis de proteína no início de rato embrionárias e Chick regiões da válvula cardíaca fornece uma ferramenta adicional para a compreensão dos eventos de sinalização celular críticos para o desenvolvimento da válvula. Nosso protocolo aqui descrito não diferem muito de procedimentos de isolamento de proteína padrão. No entanto, modificando alguns passos fundamentais, temos obtido sucesso proteínas fosforiladas de extremamente pequenas amostras. Para alcançar este resultado, os passos seguint...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
		grávido cronometrado	Para ser dissecado no estágio embrionário de interesse
Microscópio estereoscópico	Nikon	SMZ645
0,1 M Tris, pH 7,6
Microtesoura	Ferramentas de Ciências Finas	15003-08
Pinça fina, # 5	Ferramentas de Ciências Finas	11251-30
Agulha de dissecação detentores	Ted Pella Inc.	13560
Agulhas de dissecação	Ted Pella Inc.	13561-10
Micropipeta, 20 μ l, com pontas
Tampão			50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1%
Triton PhosSTOP	Roche	4906845001	Adicione 1 comprimido ao tampão de lise de 10 ml
TissueLyser LT	Qiagen	85600
Esferas de aço inoxidável	Qiagen	69989
Microcentrífuga