Geração de Enterobacter Sp. YSU auxotrofos Usando Transposon Mutagênese

Resumo

Enterobacter sp. YSU cresce em meio de sais mínimos de glucose. Auxotrofos são geradas através da transformação com um transposome qual se insere aleatoriamente no genoma do hospedeiro. Os mutantes são encontrados pela réplica de placas a partir de meio complexo para meio mínimo. Genes interrompidos são identificados por socorro e seqüenciamento genético.

Resumo

Bactérias prototróficas crescer em M-9 sais de meio mínimo suplementado com glucose (meio M-9), que é usado como uma fonte de carbono e energia. Auxotrofos pode ser gerado usando um transposome. A disponível comercialmente, Tn 5 transposome -derived utilizado neste protocolo consiste de um segmento linear de DNA contendo uma origem de replicação R6K γ, um gene de resistência à canamicina e dois sequência termina mosaico, que servem como sítios de ligação de transposase. O transposome, fornecida como um complexo de proteína de ADN / transposase, é introduzida por electroporação na estirpe prototrófica, Enterobacter sp. YSU, e incorpora-se aleatoriamente no genoma deste hospedeiro. Os transformantes são plaqueadas em réplica Luria-Bertani placas de agar contendo canamicina (LB-kan) e em placas de agar M-9 médias contendo canamicina (M-9-kan). Os transformantes que crescem em placas de LB-kan mas não em placas de M-9-kan são considerados auxotrofos. Genómico purificadoADN a partir de um auxotrofo é parcialmente digerido, ligados e transformados em uma pir ⁺ Escherichia coli (E. coli) estirpe. A origem de replicação R6Kγ permite que o plasmídeo se replique em pir ⁺ E. estirpes de E. coli, e o marcador de resistência à canamicina para selecção permite plasmídeo. Cada transformante possui um novo plasmídeo contendo o transposão ladeada pela região cromossómica interrompida. Seqüenciamento Sanger eo Básico Local Alignment Search Tool (BLAST) sugerem uma identidade putativo do gene interrompido. Existem três vantagens de se utilizar esta estratégia mutagênese transposome. Em primeiro lugar, que não se baseia na expressão de um gene de transposase pelo hospedeiro. Em segundo lugar, o transposome é introduzido no hospedeiro-alvo por electroporação, em vez de por conjugação ou por transdução e, por conseguinte, é mais eficiente. Em terceiro lugar, a origem de replicação R6Kγ faz com que seja fácil de identificar o g mutadoeno que é parcialmente recuperada num plasmídeo recombinante. Esta técnica pode ser utilizada para investigar os genes envolvidos em outras características de Enterobacter sp. YSU ou de uma variedade mais ampla de estirpes bacterianas.

Introdução

Bactérias prototróficas crescer em M-9 sais de meio mínimo contendo glucose (meio M-9), a conversão de glicose através centrais vias de metabolismo de carbono para gerar precursores, tais como aminoácidos, ácidos nucleicos e vitaminas, para a biossíntese ^1. M-9 meio contém cloreto de amónio como uma fonte de azoto, de sódio e fosfato de potássio como tampão e fonte de fósforo, sulfato de magnésio como fonte de enxofre e de glucose como fonte de carbono e energia. Luria-Bertani (LB) é rica em aminoácidos a partir de triptona e em vitaminas e factores de crescimento a partir de extracto de levedura. Ele suporta o crescimento de auxotrofos que não podem sinte....

Protocolo

1. Eletroporação de células competentes ^5,11

1. Dilui-se uma S / N cultura LB de Enterobacter sp. YSU 1/20 em 50 ml de meio LB fresco e crescer com agitação a 120 rpm e 30 ° C para uma DO (600 nm) entre 0,4 e 0,6. Opcionalmente, crescer outras estirpes de bactérias na sua temperatura de crescimento ideal.
2. Relaxar as células em gelo durante 5 min e centrifuga-se a 4 ° C e 7000 x g durante 5 min.
3. Descartar o sobrenadante, ressuspender as células em 50 ml de água gelada estéril e centrifugar a 4 ° C e 7000 x g durante 5 min. Repita este passo.
4. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em um volume de águ....

Resultados

Transformação de Enterobacter sp. YSU por electroporação com o genoma transposome iniciado inserção aleatória no genoma do hospedeiro (Figura 1A; B). A eletroporação sucesso rendeu vários milhares de transformantes que cresceram em placas LB-kan. Para obter 300-400, colônias por placa bem espaçados, a quantidade de transformação mistura propagação em cada placa de ágar LB-kan foi otimizado. Cada transformante continha pelo menos uma inserção transposon, mas não estava claro se um gene important.......

Discussão

Mutagênese Transposon usando um transposome é uma ferramenta eficiente para a geração de auxotrofos em Enterobacter sp. YSU e outros tipos de bactérias Gram negativas e Gram positivas ^3,4. O processo foi iniciado pela introdução do Tn 5 transposome -derived no hospedeiro por electroporação. Para identificar as colónias com inserções, a estirpe não transformada alvo teve de ser sensíveis à canamicina, de modo a seleccionar para o marcador de resistência transportado pelo transposon. Alguns ho.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
EZ-Tn5 R6Kγ ori/KAN-2 Tnp Transposome Kit	Epicentro (Illumina)	TSM08KR
EC100D pir+ Epicentro de E. coli eletrocompetente	(Illumina)	ECP09500	Capaz de replicar plasmídeos com uma origem de replicação R6Kγ em um baixo número de cópias
EC100D pir-116 Epicentro de E. coli eletrocompetente	(Illumina)	EC6P095H	Capaz de replicar plasmídeos com um R6Kγ origem de replicação em um alto número
de cópias 5X M-9 Sais	Thermo Fisher	DF048517
Lennox LB Caldo	Thermo Fisher	BP1427-2
Agar	Amresco, Inc.	J637-1KG	Meio sólido continha 1,6% (p/v) de ágar
Sulfato de Canamicina	Amresco, Inc.	0408-25G	Quando necessário, a mídia continha 50 μ g / ml de sulfato de canamicina
D-Glicose Monohidratada	Amresco, Inc.	0643-1KG
Extrato de levedura	Amresco, Inc.	J850-500G
Triptona	Amresco, Inc.	J859-500G
KCl	Sigma-Aldrich	P4504-500G
NaCl	Amresco, Inc.	X190-1KG
MgCl2	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO2	Fisher Scientific	BP213-1
Caldo Super Ótimo com meio			0,5% (p/v) extrato de levedura, 2% (p/v) triptona, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 e 20 mM Glicose
BfuC I	NEB	R0636S	Digestão parcial do DNA genômico
Xho I	NEB	R0146S	Digestão de plasmídeo
T4 DNA Ligase	NEB	M0202S
Água Livre de Nuclease	Amresco, Inc.	E476-1L	Para dissolver DNA precipitado e reações de endonuclease de restrição
GenomeLab DTCS - Kit de Início Rápido	Beckman Coulter	608120	Sequenciamento de DNA
Wizard Kit de Purificação de DNA Genômico	Promega	A1120A
Wizard Plus SV Minipreps Sistema de Purificação de DNA	Promega	A1460	Purificação de plasmídeo
Réplica de Bloco de Revestimento	Thermo Fisher	09-718-1
Velveteen Squares	Thermo Fisher	09-718-2	Réplica de chapeamento
PetriStickers	Diversified Biotech	PSTK-1100	Grade para réplica de chapeamento
de placas de Petri	Thermo Fisher	FB0875712
Gene Pulser II	BioRad		Electroporation Electroporation
Cuvettes – 2 mm	BioExpress	E-5010-2
CentriVap DNA Vacuum Concentrator	Labconco	7970010	Secagem de DNA
CEQ 2000XL Sistema de Análise de DNA	Beckman Coulter		de sequenciamento de DNA
NTI Advance 11.5.0	Life Technologies	12605099	análise de sequência de DNA

de Repressão Catabólica (SOC) Vetor